全 文 ：毬灢氨基丁酸对拟南芥叶片花色素苷的影响
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杜暋艳1,2,余迪求1
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(1中国科学院西双版纳热带植物园,云南 昆明暋650223;2中国科学院研究生院,北京暋100049)
摘要:研究发现毬灢氨基丁酸 (BABA)处理减少了拟南芥 (Arabidopsisthaliana)叶片花色素苷的积累,
而且BABA处理降低了花色素苷合成基因 (CHS,LDOX,UF3GT)的表达,却上调了苯丙氨酸解氨
酶 (PAL)的表达,同时促进了花色素苷降解酶多酚氧化酶 (PPO)的活性。叶片对DPPH (1,1灢二苯
基灢2灢苦基苯肼)的清除能力、总酚和类黄酮含量以及电导率和细胞死亡率的测定表明BABA降低了叶片
的抗氧化能力、电导率及细胞死亡率。结果表明BABA处理抑制了花色素苷在叶片中的积累。
关键词:毬灢氨基丁酸;花色素苷;拟南芥
中图分类号:Q945暋暋暋暋暋暋文献标识码:A暋暋暋 暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)03灢263灢07
Effectof毬灢AminobutyrieAcidonAnthocyaninofLeaves
ofArabidopsisthaliana(Cruciferae)
DUYan1,2,YUDi灢Qiu1**
(1XishuangbannaTropicalBotanicalGarden,ChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;
2GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)
Abstract:Toanalyzetheeffectof毬灢aminobutyrieacid(BABA)onanthocyaninofleavesofArabidopsis,30灢
oldplantsweresprayedwithBABAwhilethecontrolweresprayedwithwater.AftertreatedwithBABA,
thecontentofanthocyaninwassignificantlylowerthanthatofcontrol.Furthermore,theresultsfromRT灢
PCRshowedthatCHS,LDOX,UF3GTweredownregulatedcomparedwithcontro1,whilePALshowedan
oppositetrend.Atthesametime,theactivityofPPO,whichplayedanimportantroleinthedegradationof
anthocyanin,showedhigherlevelthancontrol.Inaddition,theantioxidantcapacity,thedeathrateofcels
andelectricalconductivityofleaveswerealsodecreasedwithBABAtreatment.Alresultssuggestedthat
BABAmightinhibittheaccumulationofanthocyanininleavesofArabidopsisinvitro.
Keywords:毬灢aminobutyricacid;Anthocyanin;Arabidopsisthaliana
暋 花色素苷 (anthocyanin)是植物经由苯基
丙酸途径和类黄酮途径产生的一类天然的水溶性
色素,主要存在于植物的花、果实、叶以及根、
茎等器官细胞的液泡中,通常呈现出红色、蓝色
或紫色等颜色。花色素苷的代谢途径已较为清
楚,几乎每一步的调控基因都得到了分离鉴定,
调控机理也得到广泛的研究 (Boss等,1996;
Mol等,1996;Deroles等,2009)。由苯丙氨酸
到花色素苷经历3个阶段,第一阶段由苯丙氨酸
到4灢香豆酰 CoA,这是许多次生代谢共有的,
该步骤受苯丙氨酸裂解酶 (PAL)基因活性调
控。第二阶段由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA
到二氢黄酮醇,是类黄酮代谢的关键反应,该阶
段产生的黄烷酮和二氢黄酮醇在不同酶作用下,
云 南 植 物 研 究暋2010,32(3):263~269
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09249
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基金项目:云南省基金项目 (2003C0342M)、国家自然科学基金 (3037803)和中国科学院 “百人计划暠择优资助项目
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:ydq@xtbg灡ac灡cn
收稿日期:2009灢12灢11,2010灢01灢28接受发表
作者简介:杜艳 (1983-)女,在读硕士研究生,主要研究方向:植物分子生物学。
可转化为花色素苷和其他类黄酮物质。第三阶段
是各种花青素的合成,二氢黄酮醇还原酶
(DFR)、花青素合成酶 (ANS)和类黄酮3灢葡
糖基转移酶 (UF3GT)将无色的二氢黄酮醇转
化成 有 色 的 花 色 素 (Holton and Cornish,
1995)。与合成途径相比,关于花色素苷的降解
机制的研究相对较少,目前认为多酚氧化酶
(Polyphenoloxidase,PPO)以及花色素苷酶对
花色素苷的降解起着重要作用,但是花色素苷酶
仅存在于一些病原真菌中,所以对于高等植物花
色素苷的降解多集中在多酚氧化酶上 (Polovni灢
kovaandVoskresenskaya,2008;Oren灢Shamir,
2009;Szankowski等,2009)。
大量研究结果表明花色素苷作为植物次生代
谢产物,是一类有效而有广谱性的保护因子,具
有多种生理功能:提高植物的抗氧化能力 (Sha灢
heen等,2009);提高植物的光保护能力 (Smilie
andHetherington,1999);提高抗虫抗病及抗机械
损伤能力 (Gould等,2002);提高植物的抗旱能
力 (Linda,1999)和作为植物细胞与某些真菌的
共生基因的信号分子 (Chen等,2007)。叶片中
花色素苷的产生可受多种胁迫条件的诱导,在植
物适应环境条件的改变上有重要作用,同时因为
花色素苷具有一定营养和药理作用,所以在食
品、化妆品、医药领域有着巨大应用潜力,是替
代合成色素的理想材料 (Deroles,2009)。
毬灢氨基丁酸 (毬灢aminobutyrieacid,BABA)
是一种植物体内次生代谢的非蛋白氨基酸。虽然
BABA并非植物体内常见的天然复合物,而它却
具有使不同植物产生广谱抗性的能力,可诱导植
物敏化过程 (priming)(Conrath等,2002;Jak灢
ab等,2001;Cohen,2002)。其具体的作用机理
表现在以下3个方面:(1)可诱导植株细胞壁结
构发生变化,产生胼胝质,形成乳突或导致细胞
木质化等具有防止侵染和增强抗病性作用的结构
(Cohen等,1999);(2)可诱导植物产生活性氧
(ROS),发生过敏反应从而进入对病原菌的防
卫状态,使病原菌的侵入和扩展受到抑制 (Si灢
lue等,2002;Baysal等,2005); (3)能诱导植
物积累病程相关蛋白、植保素等抗病物质 (Ton
andMauch灢Mani,2004)。BABA不仅可以促进
植物快速且大量积累胼胝质,更高水平的木质
化,或者及时启动抗性基因的表达 (Ton等,
2005),而且还可以引起一种与抗性相关的次生
代谢产物———双萜类丹参醌的积累 (Geand
Wu,2005)。目前还没有关于对由BABA诱导抗
性的环境污染问题的相关报道 (Olivieri等,
2009),从一定程度上讲,BABA诱导的抗性是植
物在能量投资最经济的前提下安全有效调控植物
抗逆途径的优化机制,因此,近年来BABA诱导
的抗性机制成为一项研究热点,并不断在经济作
物上广泛应用,给绿色农业的发展带来新方向。
关于BABA对逆境中植物叶片花色素苷的
影响,目前国内外还未曾报道。我们用BABA
处理拟南芥叶片,发现其花色素苷含量降低。进
一步分析发现,BABA下调了花色素苷合成途径
基因的表达,同时提高了降解途径酶的活性。另
外,BABA还降低了叶片的抗氧化能力、电导率
和细胞死亡率。
1暋材料和方法
1灡1暋植物材料
野生型拟南芥种子 (哥伦比亚生态型)表面灭菌后
均匀散布在1/2MS培养基 (含0灡6%agar),4曟 春化
3天后转移到22曟温室培养,7天后移栽到土里。培养
条件为22~24曟,14h光照,10h黑暗,湿度40%。生
长4周,经0灡25mmol·L灢1BABA和H2O (对照)喷施
处理2d后,取相同部位的叶片正面朝下,背面朝上漂
浮于超纯水中,放入温室中培养。
1灡2暋RT灢PCR
拟南芥的总 RNA 提取采用 Trizol法 (Logemann
等,1987)。按照Fermentas公司生产的反转录试剂盒的
操作步骤进行反转录,首先进行DNA的消化,其次进
行反录反应:随机引物1毺l,5暳buffer4毺l,RNA酶抑
制剂1毺l,10mmol·L灢1 dNTP Mix2毺l,逆转录酶1
毺l。反应条件为37曟5min,42曟60min,70曟10min。
cDNA合成后以cDNA 为模板进行actin管家基因的
PCR扩增,判断是否逆转录成功,并把其表达水平调为
一致,然后进行目的基因表达水平的检测。
1灡3暋花色素苷、总酚和类黄酮含量的测定
参考 Oren灢Shamir (2009)和 Tukumoto and Mazza
(2000)的方法称取拟南芥叶片重量1g,加入1ml1% 盐酸
甲醇 (v/v)提取液,避光,4~8曟摇床过夜以充分浸提。
次日,13000r·min灢1离心10min,取浸提液500毺l,加入
750毺l1% 盐酸甲醇 (v/v)溶液混匀,以1% 盐酸甲醇
(v/v)为参照,用分光光度计测280nm、325nm、530nm、
462暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
657nm的吸光值A,花色素苷的相对含量用公式 (A530-
0灡25*A657)/gFW表示,直接用 (A280/gFW)与 (A325/g
FW)表示总酚和类黄酮的水平。
1灡4暋细胞死亡率的测定
细胞死亡率的测定参照JacynBakerandMock的方
法 (1994):0灡1%的evansblue染色30min后用蒸馏水
洗3次 (充分漂洗),然后将漂洗后的材料浸泡于含
50%甲醇 (v/v)和1%SDS (w/v)的混合液中并于
60曟水浴30min,另准备一份相同的材料于100曟沸水
中10min后重复以上三步,测定 OD600,细胞死亡率为
两次吸光值的比值。
1灡5暋总抗氧化能力的测定
首先制备50%乙醇的叶片提取液和120毺mol·L灢1
的DPPH (1,1灢二苯基灢2灢苦基苯肼)的50%乙醇溶液,
于517nm 测定样品对 DPPH 的褪色程度,计算清除
DPPH的能力。反应液体积为4ml,反应时加植物叶片
提取液0灡2ml和3灡8mlDPPH的乙醇溶液,室温下静置
20min后测吸光度 。清除率= (A-B)/A暳100% 。这
里A为未加样的DPPH (3灡8mlDPPH+0灡2ml50%乙
醇)的吸光度,B为样品与DPPH反应后的吸光度。
1灡6暋电导率的测定
将叶片置于10ml双蒸水中,抽真空后于25曟摇床
上振荡1h,测定渗出液的电导度 (DDS灢11A电导仪),
接着于沸水中30min冷却至室温,再测一次电导率,计
算煮沸前后电解质泄漏的百分比。
1灡7暋多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性分析参考Kruger等 (1994)的方法:
称取拟南芥叶片0灡1g左右,加入5mlpH5灡8的磷酸缓冲
液,液氮研磨成匀浆后倒入离心管中,4曟,10000r·
min灢1离心10min,弃残渣,留上清液作为粗酶液。
在反应体系中加入pH5灡8的磷酸缓冲液0灡3ml,
0灡2mol·L灢1邻苯二酚溶液0灡3ml,37曟恒温水浴中预
热10min后加入0灡4ml酶液,反应4min,在分光光度
计420nm处读取吸光值,每30s记录一次,以每分钟
增加0灡001O灡D灡值定义为一个酶活性单位 (U)。酶活
性用Ug灢1min灢1表示。在酶活性测定前,用考马斯亮兰
法测定各个样品的总蛋白浓度,对各个样品的总蛋白浓
度进行归一化。
2暋结果与分析
2灡1暋BABA处理减少了拟南芥叶片花色素苷的积累
为了研究BABA 对叶片花色素苷的影响,
我们用BABA处理了拟南芥幼苗和成苗。萌发3
天后的幼苗分别移栽到含有0 mmol·L灢1和
0灡025mmol·L灢1BABA的 MS培养基上。30天
的拟南芥成苗喷施0灡25mmol·L灢1BABA两天
后,将叶片正面朝下,背面朝上漂浮于超纯水
中。结果发现,经过BABA处理的拟南芥叶片
比未经处理的叶片更绿 (图1)。
图1暋BABA对植物叶片颜色的影响
Fig灡1暋EffectofBABAoncolor灢changingofleaves
5623期暋暋暋 暋暋暋暋暋杜艳和余迪求:毬灢氨基丁酸 (BABA)对拟南芥叶片花色素苷的影响暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋
暋暋由以上表型推测可能是花色素苷积累的原
因,所以我们对叶片的花色素苷含量进行了测
定。结果如图2所示,花色素苷含量呈上升趋
势。经BABA处理的材料也表现出类似的增长
趋势,但花色素苷的积累比对照组更慢,在第4
天表现尤为明显。
图2暋BABA对叶片花色素苷含量的影响
Fig灡2暋EffectofBABAoncontentofanthocyaninofleaves
2灡2暋BABA对拟南芥叶片花色素苷合成酶基因的影响
花色素苷的生物合成受两类基因的共同调
控:一类是结构基因,编码生物合成途径中所需
要的酶;一类是调节基因,编码的是调控结构基
因时空表达的转录因子 (HoltonandCornish,
1995)。为了从分子水平上探索BABA对拟南芥
叶片花色素苷合成途径的影响,我们应用 RT灢
PCR技术对花色素苷合成酶相关基因CHS(查
尔酮合成酶),UF3GT (类黄酮醇3灢葡糖基转移
酶),LDOX(无色花青素双加氧酶),PAL (苯
丙氨酸解氨酶)的表达水平进行了检测。结果表
明CHS的表达水平在经BABA处理后的每个时
间点都明显低于对照,而LDOX,UF3GT在水
泡第48h才表现出明显的差异 (图3)。进一步
定量分析发现第 48h 时,BABA 处理组的
CHS,LDOX,UF3GT 表达量分别为对照组
表达量的43灡3%,42灡3%,30灡1%,PAL的表
达情况与其他3个基因恰好相反,即在BABA
处理后表达量反而上调,在第24h时,处理的
表达量为对照的2倍 (图3)。
2灡3暋BABA增强了拟南芥叶片多酚氧化酶 (PPO)
的活性
花色素苷的积累有两方面的原因,一是合成
途径方面;二是降解途径方面。前面我们已经检
测相关合成基因的表达,尽管如此,一些与花色
素苷降解相关的基因或蛋白的表达情况还未检
测。PPO 对花色素苷的降解起着重要作用
(Kader等,1997)。为了明确BABA是否通过调
节PPO的表达从而影响花色素苷的积累,我们
进行了PPO的活性分析。
图3暋花色素苷合成酶基因 (CHS,UF3GT,LDOX及PAL)的RT灢PCR分析
Fig灡3暋RT灢PCRanalysisofanthocyaninsyntheticenzymesgenes(CHS,UF3GT,LDOXandPAL)
662暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
暋暋图4 (a)显示了在BABA处理后拟南芥离
体叶片PPO活性的变化。结果表明PPO活性上
升,胁迫第4天时差异较为显著,对照组上升为
处理前的2灡9倍,处理组上升为处理前的3灡7
倍,处理组PPO活性为对照组的1灡3倍,结果
表明BABA处理后,离体叶片的PPO酶活性高
于对照组。
2灡4暋BABA对拟南芥叶片抗氧化能力的影响
花色素苷可提高植物的抗氧化能力,Neil
等 (2002)的研究表明,花色素苷对楼梯草属植
物Elatostemarugosum 总抗氧化剂库的贡献约
占70%。花色素苷、酚类物质及类黄酮都可以
作为抗氧化剂清除稳定性有机自由基DPPH (1,
1灢二苯基灢2灢苦基苯肼),对DPPH的清除能力是
评价植物总抗氧化能力的指标 (Shaheen等,
2009)。为了进一步证实BABA对拟南芥叶片花
色素苷的影响,我们比较了对照与处理间对稳定
自由基1,1灢二苯基灢2灢苦基苯肼的清除能力,以
及总酚及类黄酮的含量。结果表明植物对DPPH
的清除能力逐渐增强,4天后,对照组的自由基
清除率为处理前的3灡2倍,BABA处理组的自由
基清除率为处理 前 的 2灡3 倍,为 对 照 组 的
70灡5% (图4:b)。总酚及类黄酮两类抗氧化剂
含量均呈上升趋势,对照组与处理组总酚含量分
别为为处理前的1灡6,1灡4倍,类黄酮含量分别
为处理前的3灡1,2灡9倍 (图4:c,d)。对照组
的总酚及类黄酮含量均比处理稍高,但是二者差
异不明显。
图4暋BABA对拟南芥叶片多酚氧化酶活性 (a)以及DPPH自由基清除率 (b),总酚、
类黄酮 (candd),相对电导率 (e)及细胞死亡率 (f)的影响
Fig灡4暋EffectofBABAonPPOactivities (a)andDPPHradicalscavengingactivities (b),contentoftotalphenol
andFlavonoid (candd),relativeconductivities (e)anddeathrateofcels(f)ofleaves
7623期暋暋暋 暋暋暋暋暋杜艳和余迪求:毬灢氨基丁酸 (BABA)对拟南芥叶片花色素苷的影响暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋
2灡5暋BABA对拟南芥叶片电导率及细胞死亡率
的影响
花色素苷是植物响应逆境的代谢物之一,花
色素苷能清除自由基,抑制脂质过氧化。胁迫会
导致细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和死
亡。当细胞膜受到损害时,胞膜的选择透过性发
生改变或者丧失,导致细胞内的电解质外渗,使
电导率增大,因此细胞膜的电解质泄漏率反映了
膜系统的稳定性 (Wang等,2009)。早期的研究
表明花色素苷可诱导细胞分化及细胞凋亡 (Fi灢
mognari等,2004),前面的结果表明BABA抑
制花色素苷的积累,我们推测其可能对膜系统及
细胞死亡也有影响。我们进行了电导率及细胞死
亡率测定,结果表明相对电导率及细胞死亡率均
呈上升趋势,水泡离体叶片的第4天处理组电导
率为对照组的77灡3% (图4:e),而细胞死亡率
为对照组的73灡3% (图4:f)。
3暋讨论
诱导花色素苷合成的因素很多,例如光诱
导、低温诱导、渗透诱导以及其它一些内在和外
在的因子 (Mol,1996),但BABA与植物叶片
花色素苷的关系还未曾有研究报道。为了研究花
色素苷与BABA信号通路的相互关系,我们研
究了BABA对拟南芥离体叶片的花色素苷积累
情况以及在抗氧化胁迫等方面的生理指标变化。
我们检测了花色素苷合成基因CHS,LDOX,
UF3GT以及PAL的表达,结果表明除PAL上
调外,其它3个基因的表达都受到BABA不同
程度的抑制。PAL表达的上调与Baysal(2005)
关于BABA处理植物材料使得PAL酶活性增加
的研究结果一致。作为花色素苷合成的关键酶,
PAL活性对植物花色素苷合成作用的差异己被
广泛关注,其活性水平的大量变化与花色素苷合
成间的关系已被广泛报道。但是目前并没有统一
的结论,有研究认为,花色素苷的合成与PAL
活性呈正相关 (Singh等,2009),也有研究认为
PAL并非是花色素苷合成的唯一关键酶,花色
素苷仅是类黄酮物质的一小部分,PAL作为催
化酚类物质合成过程中的第1个酶,也涉及其他
产物如木质素、单宁等的生物合成 (Boss等,
1996)。所以,PAL可为多酚及类黄酮等终产物
提供前体,花色素苷只是其中的产物之一,因此
PAL与花色素苷发育并非全正相关也就不难预
料了,但是其具体的内在机制还有待于更深一步
的研究。
多酚氧化酶 (PPO)在花色素苷的降解中起
着重要作用 (Kader等,1997),我们的研究结
果表明经BABA处理的植物叶片的PPO活性高
于对照,与预期结果一致。因此我们认为BABA
主要是通过抑制花色素苷合成酶基因的表达以及
提高花色素苷降解酶活性来对拟南芥离体叶片花
色素苷产生抑制作用。
我们的研究中具有抗氧化伤害能力的物质包
括花色素苷、类黄酮、总酚。通过对以上抗氧化
剂含量以及对DPPH的清除能力的测定,发现经
BABA处理降低了花色素苷的含量,同时也降低
了总抗氧化能力。而类黄酮、总酚含量差异不显
著,所以推测抗氧化能力的降低可能是通过
BABA降低了具有抗氧化功能的花色素苷含量所
致。
Fimognari等 (2004)的研究表明花色素苷
可以诱导细胞凋亡。在对细胞死亡率的测定中,
我们的研究结果 (图4:f)与Fimognari的结
果一致,BABA处理后,离体叶片花色素苷含量
降低,细胞死亡率也较对照组低。
综上所述,BABA对拟南芥离体叶片的花色
素苷产生了一定程度的抑制作用,其机理是通过
抑制合成及促进降解两方面来实现的。但是
BABA对花色素苷调控方面的分子机理及具体的
信号转导途径还不清晰,还有待于进一步研究。
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