全 文 ：小麦黄色素合成途径中 Psy基因的克隆及分子特性 ?
蔡 华1 ,2 , 马传喜1
??
, 司红起1 , 乔玉强1
(1 安徽农业大学农学院 , 安徽 合肥 230036 ; 2 滁州学院化学与生命科学系 , 安徽 滁州 239000)
摘要 : 对普通小麦 ( Ttiticumaestivum) 黄色素 (YP) 合成途径中的首要限速酶———八氢番茄红素合成酶
(Psy) 基因进行克隆和测序 , 并和玉米 Psy基因进行序列比对。结果表明 , 在高和低 YP 含量小麦品种中
均扩增出一条长 1 192 bp的 Psy基因片段 , 该片段包含一条可编码 78 个氨基酸的小麦 Psy基因的外显子 ,
与玉米 Psy基因第 4 外显子的核苷酸序列同源率为 80 .74 % , 同源区域内有 47 个 SNPs, 但仅 11 个 SNPs导
致氨基酸编码序列的改变 , 二者氨基酸序列的同源率达 85 .89% , 推测 Psy基因在不同物种中的表达具有
较高的保守性。BLAST 聚类分析表明 , 禾谷类植物 Psy 基因的分类与物种的亲缘关系存在明显的相关性 ,
小麦 Psy基因在系统进化中比禾谷类其他植物更为高级。
关键词 : 小麦 ; 黄色素 ; Psy基因 ; 外显子 ; 序列分析
中图分类号 : Q 78 , Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 06 - 693 - 06
Cloning and Molecular Characterization of Psy Gene
in Wheat Yellow Pigment Biosynthesis
CAI Hua1 , 2 , MA Chuan-Xi1 * * , SI Hong-Qi1 , QIAO Yu-Qiang1
(1 Collegeof Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036 , China; 2 Department of Chemistry
and Life Science, Chuzhou University, Chuzhou 239000 , China)
Abstract : Phytoene synthase (Psy) gene, a primary rate-limiting enzyme in the biosynthesis pathwayof wheat yellow pig-
ment (YP) , was cloned and sequenced in this study, at the sametime, the Psygene sequences between wheat andmaize
werecompared . The results showed that, a 1 192 bp DNA fragment was amplified by polymerase chain reaction in DNA
samples extracted fromthe high YP and low YP content wheat cultivar, the gene fragment contains a intact exon of Psy
gene, which codes 78 amino acids . Sequence analysis showed that the wheat DNA fragment was closely homologous to
those of themaize 4th exon, with homology rate of nucleotide and amino acids sequences at 80 .74 % and 85 .89 % . Al-
though there were 47 SNPs in the homology area of wheat and maize, only 11 SNPs led to the variation of amino acid se-
quences, which indicates Psygenewasconservative in different species . Blast clusteringanalysis showed, the class of Psy
gene was significantly related to their genetic relationship in gramineous plants, the Psygeneof wheat was moreadvanced
than other cereal plants in system evolution .
Key words: Wheat; Yellow pigment; Psygene; Exon; Sequence analysis
普通小麦 ( Ttiticum aestivum L . 2 n = 6 x =
AABBDD) 籽粒黄色素 (Yellow Pigment, YP) 是
造成面粉白度下降的重要因素 , 黄色素含量对蒸
煮面食品的色泽以及小麦的营养品质等均具有显
著影响 ( 张立平等 , 2006 )。相反 , 对硬粒小麦
( TtiticumturgidumL . 2 n= 4 x = AABB ) 而言 , 黄
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (6) : 693～698
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2008.08062
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : machx@163 . net; Tel : 0551 - 5786213
收稿日期 : 2008 - 04 - 10 , 2008 - 05 - 16 接受发表
作者简介 : 蔡华 ( 1972 - ) 男 , 博士研究生 , 副教授 , 主要从事小麦遗传育种研究。E-mail : caihua19721220@ 163 . com ?
基金项目 : ?国家科技支撑计划 (2006BAD01A02) 、公益性行业 ( 农业 ) 科研支项 ( nyhyzx07-002 )、农业部“引进国际先进农业
科学技术”项目 ( 2006-G2 )
色素含量高的品种却可制作出高品质的黄亮的面
制食品 , 因此 , 无论高低 , 黄色素含量都是四倍
体硬粒小麦和六倍体普通小麦遗传育种研究的重
要内容 ( Zhang and Dubcovsky, 2008)。
黄色素是由多种物质组成的混合物 , 其主要
成分是类胡萝卜素 (Naik 等 , 2003; Sharp, 2001) ,
它的生物合成是在八氢番茄红素合成酶 ( Phy-
toene synthase, Psy) 作用下进行的。该酶为类胡
萝卜素生物合成途径中的首要限速酶 ( Fraser
等 , 2002; Galagher 等 , 2004; Rёmer and Fraser,
2005) , 其基因也是类胡萝卜素基因操作的首选
基因。近年来 , 有关 Psy 基因的研究已在辣椒
(R?mer 等 , 1993 )、拟南芥 (Scolnik and Bartley,
1994)、甜瓜 ( Zoi Karvouni 等 , 1995 )、黄水仙
(Burkhardt 等 , 1997 )、番茄 ( Faqiang 等 , 2008 )
等植物中广泛开展。
在禾谷类植物中 , 黄色素最初是在黄玉米
( Zea mays L .) 的成熟籽粒中被发现 , 而白玉米
中则没有 (Gallagher 等 , 2004)。目前对普通小麦
黄色素及相关基因的研究仅见表型及与 Psy连锁
的分子标记等相关报道。已有研究表明 , 虽然环
境条件对小麦黄色素含量有一定影响 , 但它受基
因型的影响更大 , 遗传力达 0 .68 , 不同品种间
黄色素含量可相差 3～4 倍 ( Baik, 1995 )。Parker
(1998 ) 报道了一个位于 7A 染色体的黄色素
RFLP 标记 , 可解释黄色素变异的 60%。Kuchel
等 (2006 ) 和 Pozniak 等 ( 2007 ) 分别在六倍体
普通小麦和四倍体硬粒小麦的 7BL 染色体上定
位了一个面粉黄色度 b 和 Psy基因的主效 QTL ,
均能解释面粉颜色 40% 以上的表型变异 , Zhang
等 (2006) 在 7A 染色体上发现了一个能解释小
麦籽粒黄色素含量 12 .9%～37 .6%表型变异的另
一个主效 QTL。然而迄今真正针对普通小麦 Psy
基因的研究仍然极少 , 为此 , 本研究以已发表的
玉米 Psy基因序列为探针克隆小麦 Psy基因 , 并
进行序列比对分析 , 为深入研究小麦黄色素生物
合成的分子机制和高?低黄色素含量小麦新品种
的选育提供遗传学和分子生物学基础。
1 材料与方法
1 .1 材料
供试小麦品种 (系) 为安徽农业大学小麦育种与品
质改良实验室的育种材料 , 包括 218 份小麦微核心种质
资源和 19 份品质性状典型的品种 (系 ) , 2003～2005 两
年分别种植于安徽农业大学试验农场 (合肥 ) 和校外试
验基地 (凤阳 )。
1 .2 方法
1 .2 .1 小麦基因组 DNA 的提取 采用改良的单籽粒法 ,
取一粒饱满的小麦籽粒充分研碎后放入 1.5 ml 离心管
中 , 加入 700μl SDS 样品提取液 ( 288 mmol?L NaCl , 200
mmol?L Tris-HCl , 25 mmol?L EDTA , 0 . 5%SDS) , 60℃水浴
45 min, 酚 + 氯仿 + 异戊醇 ( 25∶24∶1 , V?V ) 抽提蛋白 ,
DNA 经异丙醇沉淀、乙醇漂洗后真空干燥。1% 琼脂糖
凝胶检测 DNA 浓度 , - 20℃保存备用。
1 .2 .2 引物设计和合成 从 NCBI ( http:??www.ncbi.nlm.
nih. gov?blast) 网站上获取最新发表的玉米 Psy基因序列 ,
以其 cDNA 为探针 BLAST 搜索小麦 EST 序列 , 选择同源
性较高的序列拼接后应用 Premier 5 .0 软件设计引物 , 经
试扩增获得一对有效引物 PSY01 , 其序列为 : Forward
Primer: 5′-TAGACAATGCATTCAACGCG-3′; Reverse Primer:
5′-TTGTTGTAATACTTTGTAAGG-3′。引物交由上海 Sango生
物工程公司合成。
1 .2 .3 PCR 反应体系和扩增程序 优化的 PCR 反应体系
总体积为 20μl , 各成分如下 : 10×PCR buffer (2 . 0μl )、
2 .5 mmol?L dNTP ( 0 . 8μl )、1μmol?L Forward Primer 和 Re-
verse Primer (各 5μl )、1 U Taq DNA 聚合酶 (0 . 2μl )、2 .5
mmol?L MgCl2 (1 . 2μl )、50 ng DNA 模板、无菌去离子水
(补足至 20μl)。以上试剂均购自上海 Sango 生物工程公
司。PCR 反应扩增程序如下 : 95℃预变性 5 min; 95℃变
性 30 s, 61℃退火 30 s, 72℃延伸 1 .5 min, 共循环 40 次 ;
最后 72℃延伸 5 min。PCR 产物经 1 .5%琼 脂 糖凝胶 电
泳 分 离 检 测 , 缓冲体系为 1×TAE 溶液 , 100 V 电压电
泳 1 h, 溴化乙锭 ( EB ) 染色 , 凝胶成像系统扫描并保
存图像。
1 .2 .4 PCR 扩增产物的测序及序列分析 PCR 扩增产物
交由上海 Sango 生物工程公司纯化、测序。测序结果递
交至 http:? linux1 . softberry. com?berry. phtml ? topic= fgenesh-
&group= programs&subgroup = gfind 网站进行基因结构预
测 , 并在 NCBI 网站上进行 BLAST 分析。利用 DNAStar
5 .0 软件包的 EditSeq程序对 BLAST搜索结果中 E 值≤1e-
20 (Li 等 , 2006) 的各序列进行比对分析 , 同时寻找被测
序列的最大开放阅读框 (Open Reading Frame, ORF) , 并
将 ORF转换成氨基酸序列 , 在 NCBI 网站对氨基酸序列
进行 BLASTx分析。
2 结果与分析
2 .1 引物 PSY01 的 PCR 扩增结果
以玉 米序列 U36360 的 cDNA 为 探针 , 经
496 云 南 植 物 研 究 30 卷
BLAST 搜索共获得 137 条小麦 EST, 分属于 79 个
序列 , 以同源性 > 70%、长度 > 200 bp和 E 值≤
1e-20 为标准筛选出 4 条序列 , 分别为 AL822090、
CJ685595、DR739164 和 CJ579028 ( http:??www. ncbi .
nlm.nih.gov?blast?Blast. cgi ) , 4 条序列共包含 16
个 EST, 由此构 建的重叠群 (contig) 覆盖了玉
米 U32636 基因 全 部编 码 区 ( coding sequence,
CDS) 1 394～4 936 bp区域的 6 个外显子 (图 1 )。
由上述 EST 序列设计的引物 PSY01 在实验群体中
黄色素含量最高和最低的两品种 (济宁 12 和郑
9023) 总 DNA 中均扩增出一条长约 1 200 bp的片
段 ( 图 2 )。
图 1 玉米 Psy 基因 ( U36360) 外显子—内含子结构及
4 条小麦 EST 用于设计引物
Fig . 1 The exon- intron structureof Psy frommaize
( U32636 ) and 4 wheat ESTs used to design primes
黑色箭头示玉米 Psy 基因的 6 个外显子及序列长度 ;
玉米 U32636 线下为 4 条小麦 EST 序列及其长度
The black solid arrows on maize U32636 denote 6 exons with their sizes;
The lines under U32636 represent the aligned 4 wheat ESTs with their sizes
图 2 小麦 Psy 基因的 PCR 扩增结果
Fig . 2 Results of PCR amplification inwheat Psy gene
M: DNA 标准分子量 ; 1 : YP 含量低的小麦品种 (郑 9023) ;
2 : YP 含量高的小麦品种 ( 济宁 12 )
M : DNA marker; 1 : wheat cultivar Annong95083 with low YP content;
2 : wheat cultivar J iling12 with high YP content
2 .2 小麦 Psy基因片段的序列特征
PCR 产物经回收纯化后测序 , 表明该片段全
长为 1 192 bp, 经 DNAMAN软件的 Alignment比对 ,
发 现 该 片 段 第 799～1 042 bp区与玉米 U32636 第
4 160～4 403 bp 区的 244 个碱基存在 80 .74% 的同
源率 ( E 值 < 1e-20) , 说明该片段属于黄色素 Psy
合成相关基因。这一结果与 http:??linux1 .softb-
erry. com?berry. phtml ? topic= fgenesh&group= progr-
ams&subgroup= gfin网站对该片段的基因结构分
析报告基本一致。对照玉米 U32636 序列的 CDS
区域 , 发现该同源片段正好覆盖了玉米 Psy基因
的第 4 外显子 (4 163～4 398 bp, 图 1 ) , 表明这
个区域可能包含小麦 Psy基因的一个完整外显
子。序列分析表明 , 该区域内小麦与玉米 Psy基
因的第 4 外显子序列存在 47 个单核苷酸多态性
(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) 变异 , 未
发现 GAPs。但在外显子的两侧翼序列却与玉米
U32636 同一位置的内含子区域存在广泛的变异 ,
内含子的 5′和 3′端符合 GT?AG 法则 ( 图 3 )。以
该片 段 第 799 ～ 1 042 bp 序 列 为探 针 , 进 行
BLAST-EST 搜索 , 发现同源性最高的 EST 序列为
CJ685595 和 CJ579028 , 同 源率 分 别为 100% 和
99% , 仅在 CJ579028 序列内存在一个碱基的缺失。
应用上述引物方法共设计 5 对引物以扩增小
麦 Psy基因全长并进行序列比对分析 , 结果表
明 , 5 对引物的扩增产物长度分别为 690 bp、302
bp、989 bp、785 bp和 1 192 bp, 覆盖了 Psy基因
的全部 6 个外显子和 5 内含子 , 且在各外显子区
域内和玉米 U32636 的序列同源率均达 80% 以
上 , 所以认为 5 对引物的扩增产物均为小麦 Psy
基因片段 , 经 DNAMAN 软件组装成一个全长 3 437
bp、包括 6 个外显子和 5 个内含子的小麦 Psy基
因 (图 4)。
2 .3 小麦 Psy基因编码的氨基酸序列分析
应用 DNAMAN 软件将小麦 PCR 产物的 799～
1 042 bp区和玉米 U32636 第 4 外显子区翻译成一
条编码 78 个氨基酸的序列 ( 图 5) , 序列分析表
明虽然小麦与玉米在该区域存在 47 个 SNPs, 但
仅有 11 个 SNPs 影响到基因所编码的氨基酸序
列 , 其余的 36 个 SNPs并未改变氨基酸的编码顺
序 , 属同义 cSNP ( Coding SNP) , 两物种 Psy 基
因的氨基酸序列在该区域的同源率为 85 .89%。
5966 期 蔡 华等 : 小麦黄色素合成途径中 Psy基因的克隆及分子特性
图 3 玉米 Psy基因第 4 外显子与小麦 Psy 基因同源区域的序列比对
注 : 阴影部分为玉米 Psy 基因第 4 外显子的 5′端和 3′端 ; 方框部分为小麦该区域的 5′端和 3′端
Fig . 3 Sequence alignment of Psy gene between the 4th exon of maize and the homologous areaof wheat
Note: The shaded part are 5′and 3′end of the 4th exon of maize Psy gene; the pane part are 5′and 3′end of thehomologous area of wheat
图 4 小麦 Psy 基因全长 . 箭头示 5 对引物扩增的 PCR 产物
Fig . 4 Full length of wheat Psy gene . The solid arrows down black line denote PCR products of 5 primer sets
图 5 玉米 U32636 第 4 外显子和小麦 Psy基因编码的氨基酸序列比对
Fig . 5 Sequence alignment of Psy genebetween wheat CDS and the 4th exon of maize
2 .4 PSY 基因的进化分析
以实验获 得的小 麦 Psy 基 因片段 ( 编 号
18729) 为探针 , 在 GenBank 中进行 BLAST 搜索 ,
共得到 56 条同源性较高的目的序列 (http:??www.
ncbi. nlm. nih.gov?blast?Blast. cgi ) , 包括 4 条六倍
体普 通 小 麦基 因 序 列 ( EF600063、 EF600064、
EU096091 和 EU096094 )、6 条四倍体硬粒小麦基
因 序 列 ( DQ642439、 DQ642440、 DQ642443、
DQ642444、EU096090 和 EU096092 )、 1 条 水 稻
( Oryza sativa) 基因序列 ( AP005750 )、1 条高粱
( Sorghumbicolor) 基因序列 (AY705389) 和 1 条
中间偃 麦草 ( Thinopyrum ponticum) 基 因 序 列
(EU096095) , 其余均为玉米序列 ( 序列号未列
出 ) , 所有序列都是 Psy合成酶基因。4 条普通小
麦序列均为 2008 年刚注册 , 6 条硬粒小麦序列
中 4 条 2007 年注册 , 2 条 2008 年注册 , 提示对
麦族 Psy基因的研究已逐渐引起重视。BLAST 聚
类分析表明 , 这些 Psy基因可归为 3 类 , 水稻、
玉米和高粱聚为一类 ( 玉米不同基因序列因同源
性极高未全部列入 ) ; 中间偃麦草单独聚为一类 ,
696 云 南 植 物 研 究 30 卷
四倍体硬粒小麦和六倍体普通小麦聚为第 3 类 ,
这一结果与上述物种的植物学分类基本一致 , 也
即禾谷类植物 Psy基因的分类与物种的亲缘关系
存在明显的相关性。聚类分析同时显示本实验获
得的 Psy基因片段可能来源于普通小麦 A 组染
色体 , 属于 Psy1-A1 基因或其等位变异 ( 图 6 )。
聚类分析图的进化距离表明 , Psy基因的进化趋
势为 : 普通小麦 > 硬粒小麦 > 中间偃麦草 > 水稻
> 高粱 > 玉米。
3 讨论
利用已报道的基因序列 , 尤其是近缘物种的
基因序列 , 进行同源克隆是基因克隆的一条重要
途径。本研究以玉米 Psy基因序列 U32623 为探
针 , 在 GenBank 中 BLAST 搜索普通小麦的 EST 序
列 , 在 能 覆 盖 玉 米 U32623 全 部 开 放 阅 读 框
(ORF) 区域内设计引物 , 通过同源克隆的方法获
得一条普通小麦的 Psy基因 , 长 1 192 bp, 虽然只
是该基因的一个片段 , 但它包含一个完整的外显
子序列 , 编码 78 个氨基酸 , 因此该基因片段可用
于制备小麦核酸探针 , 为进一步深入研究小麦黄
色素生物合成的分子机制奠定基础。应用这种方
法同样可以设计出多对引物 , 可实现小麦 Psy基
因组全长的扩增 , 以及小麦 Psy基因内全部外显
子和内含子的结构分析。实验同时表明 , 该基因
编码区与玉米第 4 外显子的同源区域存在 47 个单
核苷酸多态性变异 , 而其中仅有 9 个 SNP 导致小
麦和玉米在该区域内编码氨基酸的变异 , 推测虽
然小麦和玉米属亲缘关系较远的物种 , 但 Psy基
因在不同物种中的表达却具有较高的保守性。
已有研究表明 , 在籽粒 ( 或果实 ) 发育过程
中 , Psy 对于类胡萝卜素合成途径中代谢物质的
流量有着极大的影响 , 是一个限速酶。在籽粒成
熟期 , Psy 基因的表达量显著升高 ( Ronen 等 ,
2000)。这一现象表明在籽粒中 , 转录水平的调
控是控制类胡萝卜素合成的重要方式。 Psy基因
在玉米中又称 y1 基因 , 决定玉米胚乳的颜色
( Buckner 等 , 1996) , 被认为是黄色素合成过程中
图 6 小麦 PSY 基因核苷酸序列的 BLAST 聚类分析
Fig . 6 Blast clustering of nucleotide sequence in Psy gene between wheat and other cereal plants
7966 期 蔡 华等 : 小麦黄色素合成途径中 Psy基因的克隆及分子特性
的“瓶颈”基因 , 定位在第 6 号染色体上 ( Pal-
aisa等 , 2003; Wong等 , 2004) 。因玉米第 6 染色
体与小麦第 7 同源群有着广泛的共线性 (extens-
ive synteny) ( Gale and Devos, 1998 ) , 所以小麦
Psy基因应位于第 7 同源群上 , 结合 Psy基因的
BLAST 聚类分析 , 本实验克隆的 Psy基因应定位
在小麦 7A 染色体上。进一步分析 BLAST 聚为一
类的麦族 Psy基因序列及所研究的普通小麦和硬
粒小麦品种特性 , 发现除了依据 Psy基因的分类
(Psy1-A1 和 Psy1-B1 ) 外 , 不同实验材料黄色素
含量高低也是 BLAST 重要的分类依据 ( 见各基
因序列提供的详细资料 , 未列出 )。因此开发出
具有多态性的 Psy基因分子标记对小麦黄色素含
量的分子鉴定和高?低黄色素含量的小麦新品种
的分子标记辅助选择育种 (Molecular Marker As-
sisted Selection, MAS) 具有重要意义。
〔参 考 文 献〕
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