全 文 ：束花石斛种子超低温保存的研究*
何明高1,2,王瑞霞3,宋希强2,4,宋松泉3,张如莲1**
(1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南 儋州暋571737;2海南大学园艺园林学院,
海南 儋州暋571737;3中国科学院植物研究所,北京暋100093;4海南大学热带作物
种质资源保护与开发利用教育部重点实验室,海南 儋州暋571737)
摘要:以濒危兰科物种野生束花石斛 (Dendrobiumchrysanthum )的成熟种子为材料,研究了PVS2植
物玻璃化液对其萌发的作用,以及快速冷冻法和玻璃化法对种子超低温保存的影响。结果表明,种子的萌
发率随着PVS2处理时间的延长而下降。PVS2预处理能明显地增加种子的超低温耐性。当预处理时间为
15~45min时,种子的超低温耐性随预处理时间的延长而增加;当预处理时间长于60min后,种子的超
低温耐性随预处理时间的延长而下降。经液氮保存后,存活的种子能萌发成为正常的幼苗。结论是经
PVS2预处理45min后,成熟的束花石斛种子能成功地进行超低温保存。
关键词:超低温保存;束花石斛;兰科植物种子;快速冷冻;玻璃化
中图分类号:Q945暋暋暋暋暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)04灢334灢05
StudyonCryopreservationofDendrobiumchrysanthum
(Orchidaceae)Seeds
HEMing灢Gao1,2,WANGRui灢Xia3,SONGXi灢Qiang2,
SONGSong灢Quan3,ZHANGRu灢Lian1**
(1TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou571737,China;
2ColegeofHorticultureScienceandLandscapeArchitecture,HainanUniversity,Danzhou571737,China;
3InstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Beijing100093,China;4KeyLaboratoryofProtection
andDevelopmentalUtilizationofTropicalCropGermplasmResources(HainanUniversity),
MinistryofEducation,Danzhou571737,China)
Abstract:Thisworkaimedtostudytheroleofplantvitrificationsolution2(PVS2)onseedgermination,and
theeffectofrapidfreezingandvitrificationtreatmentonseedcryopreservationofthewildmatureseedsof
Dendrobiumchrysanthum,anendangeredorchidspecies.Theresultsindicatedthattheseedsgermination
decreasedwithincreasingtreatmenttimeofPVS2.Cryo灢toleranceofseedswasobviouslyincreasedbyPVS2
pre灢treatment.Whenpre灢treatmenttimewasbelow45min,seedscryo灢toleranceincreasedwithincreasing
pre灢treatmenttimeofPVS2,whileitdecreasedafter60min.Thesurvivalseedscouldgerminateanddevelop
intonormalseedlingafterstorageinliquidnitrogen.Inconclusion,matureD灡chrysanthumseedscouldbe
successfulycryo灢preservedafter45minpre灢treatmentwithPVS2.
Keywords:Cryopreservation;Dendrobiumchrysanthum;Orchidspeciesseeds;Rapidcooling;Vitrification
云 南 植 物 研 究暋2010,32(4):334~338
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡10023
*
**
基金项目:中国科学院重要方向性项目 (KZCX2灢YW灢414)、五唇兰种质资源收集与种子保存技术研究 (YJS灢2008灢S030)、国
家科技支撑计划 (2006BAD07B05)
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:zhang23300406@126灡com
收稿日期:2010灢01灢22,2010灢03灢15接受发表
作者简介:何明高 (1983-)男,海南大学2006级在读硕士研究生,研究方向:种质资源。E灢mail:heminggao@163灡com
暋暋兰科 (Orchidaceae)是被子植物中最为进
化的科之一。兰科植物在受保护的濒危物种中占
很大的比例。在 《野生动植物濒危物种国际贸易
公约》中,我国被列入重点保护的植物约有1300
种,而兰科植物则占了1200余种 (陈心启和罗
毅波,2003)。因此,兰科植物种质资源的保存
对于生物多样性保护以及兰花产业的可持续发展
均具有重要的意义。兰科植物种子数量大,但贮
藏所占空间小,是保存兰科种质资源的有效途
径。有关兰科种子贮藏特性的研究较少 (Prit灢
chardandSeaton,1993),目前迫切需要建立长
期保存兰科植物种子的有效方法。
超低温保存 (cryopreservation)被认为是
一种有希望长期保存植物种质资源的技术,在液
氮 (-196曟)保存状态下活细胞的所有代谢几
乎完全停止,可防止老化及变异 (Nikishina等,
2001a)。超低温保存的冷冻方法分为快速冷冻法
(rapidcooling)和玻璃化法 (vitrification)等,
已应用于一些兰科植物种子保存 (Pritchard,
1984;Wang等,1998)。快速冷冻法是指将材料
直接投入液氮,此方法适合于含水量低、细胞小
的材料。快速冷冻法已成功地保存了一些兰科植
物种子,如铁皮石斛 (Dendrobiumcandidum,
Wang等,1998)。玻璃化法是利用高浓度的复合
保护剂在25曟或者0曟下对材料进行预处理,投
入液氮 (Takagi,2000)。玻璃化液作用在于增
大膜的通透性,促进脱水,降低水分冰点温度,
保护蛋白质和酶类。目前广泛使用的玻璃化液为
PVS2 (plantvitrificationsolution2),并成功地
保存了一些兰科植物种质资源,如白芨 (Bletil灢
lastriata,Ishikawa等,1997)、石斛 (Den灢
drobiumnobile,Vendrame等,2007)、鹤顶兰
(Phaiustankervileae,Hirano等,2009)。
本文以成熟的束花石斛 (Dendrobiumchry灢
santhum WalichexLindley)种子为材料,研究
了PVS2对种子萌发的作用,以及快速冷冻法和
玻璃化法对种子超低温保存的影响,以期为兰科
植物种子的超低温保存提供参数。
1暋材料和方法
1灡1暋试验材料
束花石斛为兰科石斛属 (Dendrobium Swartz)植
物,为多年生草本植物,丛生密林的树干或者岩石上,
属附生兰。分布于印度西北部、缅甸、泰国、老挝、越
南和我国的广西、贵州、云南和西藏 (吉占 和 等,
1999)。由于生境的破坏和过度采挖,该物种已面临濒
危的境地 (汪松和解焱,2004)。野外人工授粉14个月
的束花石斛蒴果于2008年1月采自海南霸王岭国家级自
然保护区 (18曘57曚~19曘11曚N,109曘03曚~109曘17曚E,
海拔560m)。该地区的年平均温度为23灡6曟,年平均
降雨量为1750mm,雨量主要集中在7~10月份;年平
均相对湿度 (RH)76%~82%,林内土壤终年湿润,
以砖红壤为代表类型 (陈升华和杨世彬,2006)。蒴果采
集后于室内 (25曟,50% RH)风干至含水量为27灡8%,
然后储存于干燥密闭的容器中,于5曟保存备用。
1灡2暋方法
1灡2灡1暋种子含水量的测定暋种子含水量的测定参照宋
松泉等 (2005)的方法,将4个蒴果的种子混合均匀,
取适量的种子于103曟烘焙17h;以鲜重为基数计算种
子的含水量。
1灡2灡2暋生活力的测定暋种子经5%次氯酸钙 (w/v)处
理30min后,用蒸馏水清洗2~3次,然后用1%的2,
3,5-氯化三苯基四氮唑溶液 (TTC,w/v)在30曟黑
暗条件下染色24h;在显微镜下拍照。胚被染为红色的
为具有生活力的种子,不染色或者染色很浅的为没有生
活力的种子。每次测定读取3个视野,每个视野不少于
300粒种子;重复3次,计算有生活力种子的百分率。
1灡2灡3暋种子萌发试验暋种子经5%次氯酸钙 (w/v)处
理30min后,用蒸馏水清洗3~5次,然后播种于含花
宝1号3g·L灢1、马铃薯泥30g·L灢1和蛋白胨0灡5g·
L灢1的固体培养基上 (柯海丽,2007)。在25曟暲2曟、黑
暗中培养30d后统计萌发率。以胚膨大和种皮破裂作为
种子萌发的标准。
1灡2灡4暋超低温保存暋采用快速冷冻法和玻璃化法将种
子进行超低温保存。快速冷冻法,将种子装入冻存管
后,直接投入液氮中。玻璃化法参照Sakai等 (1990)
的方法进行,取约20mg种子,用5%次氯酸钙 (w/v)
表面消毒30min,无菌水清洗3次后,用无菌滤纸吸干
种子表面的水分,放入PVS2植物玻璃化溶液中处理0
~120min,然后投入液氮中。PVS2由30%甘油 (v/
v),15% 乙二醇 (v/v),15% 二甲基亚砜 (DMSO,v/
v)和0.4mol·L灢1的蔗糖配成。种子经液氮超低温保
存24h后取出,在 (40暲1)曟的水浴中解冻2min,用
1灡2mol·L灢1蔗 糖 溶 液 浸 泡20min,然 后 进 行 萌 发
试验。
1灡2灡5暋数据处理暋用SPSS13灡0统计分析软件对数据进
行单因素方差分析 (one灢wayANOVA)和多重比较
(Student灢Newman灢Keuls)。
5333期暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋何明高等:束花石斛种子超低温保存的研究暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
2暋结果
2灡1暋束花石斛种子的大小和生活力
授粉后14个月的束花石斛种子和胚的长度
分别为: (0灡65暲0灡012)mm、 (0灡24暲0灡006)
mm;种子的含水量为:(27灡78暲2灡7)%,TTC
染色表明,具有生活力的种子胚被染为红色,无
生活力的种子胚为白色或者染色很浅 (图1:a)。
种子的萌发率 (89暲0灡601)%与TTC染色的生
活力 (89灡2暲0灡357)%相似 (P>0灡05)。
图1暋束花石斛的种子TTC染色 (a),萌发 (b)和小苗 (c)
CK,未经液氮保存的种子所得小苗;LN,经液氮保存的种子所得小苗
Fig灡1暋TTCstaining(a)andgermination(b)andseedlingofD灡chrysanthum (c)
CK,showingseedlingdevelopedfromseedswithoutbeingimmersedintoliquidnitrogen;
LN,showingseedlingdevelopedfromseedsimmersedintoliquidnitrogen
2灡2暋PVS2处理对超低温保存种子萌发率的影
响
如图2所示,添加PVS2处理,不经液氮保
存的束花石斛种子随着处理时间的延长,萌发率
逐渐下降。例如,未经PVS2处理的种子的萌发
率为89%,经PVS2处理120min后的种子萌发
率降低到77%。种子经PVS2预处理不同时间
后,投入液氮中保存。当预处理时间为15~45
min时,种子的存活率随预处理时间的延长而增
加;当预处理时间长于60min后,随预处理时
间的延长,种子的存活率下降;适宜的预处理时
间为45min(图2)。经液氮保存后,存活的种
子在播种30d后可诱导出绿色的圆球茎 (图1:
b),到90d时长出正常的小苗 (图1:c)。
2灡3暋PVS2处理对束花石斛种子的超低温耐性
的影响
暋暋为检测在超低温下PVS2对束花石斛种子的
保护作用,将种子分别放入添加和未添加PVS2
的冻存管中,然后直接投入液氮或者经PVS2预
处理45min后投入液氮,并在液氮中保存24h。
结果如图3,添加PVS2后立即投入液氮能明显
地增加种子的存活率,而PVS2预处理45min
后再投入液氮的超低温保存效果比立即投入液氮
的效果好,三者差异显著。(图3,P<0灡05)。
图2暋PVS2预处理不同时间对超低温保存束花石斛种子存活率的影响
图中数据为3次重复的平均值暲标准误 (n曒150)。下同。
TC,添加PVS2处理不投入液氮;LN,添加PVS2处理后投入液氮中
Fig灡2暋MapshowinggerminationrateofD灡chrysanthum
seedsafterdifferentPVS2pre灢treatmenttime
Alvaluesaremeans暲standarderrorofthreereplicates(n曒150).
TCindicatedgerminationoftheseedstreatedwithPVS2butnot
immersedintoliquidnitrogen;LNindicatedgerminationofthe
seedstreatedwithPVS2andimmersedintoliquidnitrogen
633暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
图3暋在液氮中PVS2对束花石斛种子的保护作用
柱子上的不同字母表示具有显著性的差异 (S灢N灢K,P曑0灡05)。
Control,种子未加PVS2处理,直接投入液氮中;PVS2灢0:
加PVS2后立即投入液氮中;PVS2灢45:用PVS2
预处理45min后投入液氮中
Fig灡3暋TheprotectiveroleofPVS2toD灡chrysanthum
seedsinliquidnitrogen
Thedifferentletterabovecolumnindicatesasignificantly
diference(S灢N灢K,P曑0灡05).Controlindicatedgermination
oftheseedsdirectlyimmersedintoliquidnitrogen.
PVS2灢0andPVS2灢45indicatedthattreatedwithPVS2for0
and45min,respectively,thenimmersedintoliquidnitrogen
3暋总结与讨论
3灡1暋总结
本文通过TTC染色鉴定束花石斛种子生活力
和用超低温方法保存束花石斛种子的试验研究。结
果证明了TTC染色法适合作为束花石斛种子质量
的鉴定方法;束花石斛种子经玻璃化液处理一定时
间对其萌发无影响,经玻璃化液处理45min能显
著提高其超低温耐性。初步确定快速冷冻法和玻璃
化法超低温保存适合于束花石斛种子的长期保存,
且玻璃化法超低温保存明显优于快速冷冻法。
3灡2暋讨论
兰科植物的种子非常细小,一个蒴果中有几
万到上百万粒种子。由于种子内没有胚乳,仅有
分化不完全的胚细胞 (陈心启和罗毅波,2003)。
在自然条件下,兰花种子的萌发依靠其真菌的侵染
来完成 (共生萌发),但萌发率非常低 (陈心启和
罗毅波,2003;ThomasandMichael,2007)。在人工
培养基以及控制温度和光照的条件下萌发 (非共生
萌发)也需要较长的萌发时间。例如,二叶红门兰
(Orchisdiantha)和广布红门兰 (O灡chusua)在
共生萌发达到最终萌发率时分别需要165d和132d
(Wang等,2009);这样就给引种和种子质量检测带
来了困难。TTC染色能快速检测束花石斛种子的
生活力,并与种子萌发试验一致;这些结果与Ish灢
ikawa等 (1997)和Nikishina等 (2001b)的结果一
致。也有兰科植物种子的TTC染色率与萌发率不
一致的报道;有的种子TTC染色率偏高,这可能
是由于种子存在休眠,尽管被TTC染色,但不
能萌发;也可能是次氯酸钙处理的时间过长,胚
受到损坏释放出脱氢酶,进而造成无活力的种子
被染色的假象 (Shoushtari等,1994)。
随着PVS2处理时间的延长,束花石斛种子的
萌发率下降。下降的原因是PVS2是一种低水势并
含有毒物质 (15%二甲基亚砜,具有渗透性的冷冻
保护剂)的溶液,处理时间延长将导致化学伤害和
脱水伤害。已有报道,培养液中DMSO浓度为
10%时,细胞生长抑制率为100%;0灡1%时抑制
率为35%,即使是0灡004%的浓度,DMSO 对
细胞的生长也有不利的影响 (葛峰等,2006)。
种子含水量是影响超低温保存的一个关键因
素。含水量为33%的大花万代兰种子不能超低
温保存 (ThammasiriandSoamkul,2007);含
水量为28灡5%的铁皮石斛种子经超低温保存后
的存活率为18灡69% (王君晖等,1999)。正常性
种子在一定的含水量范围内可以不经过任何处理
直接在液氮中保存 (Popova等,2003),不同种类
种子对超低温保存要求的最适含水量不同 (Hira灢
no等,2009)。新鲜收获的束花石斛种子经超低温
保存后的存活率为零 (未列出数据);当脱水至种
子含水量为27灡8%时,快速冷冻法的存活率为
52%,表明此含水量的种子具有一定的超低温耐
性。添加PVS2后直接投入液氮或者经PVS2预
处理45min后投入液氮显著地增加种子的存活
率,这些结果与Ishikawa等 (1997)用玻璃化法
保存石斛 ‘SenaRed暞种子,Hirano等 (2005)
保存白芨种子的结果类似。DMSO能够快速穿
透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过
程,同时提高细胞内的离子浓度,减少细胞内冰
晶的形成,从而减少细胞损伤 (刘耳等,1994)。
7333期暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋何明高等:束花石斛种子超低温保存的研究暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
玻璃化超低温保存的效果与材料经过玻璃化
处理的时间有关。当预处理时间为15~45min
时,种子经超低温保存后的存活率随预处理时间
的延长而增加;当预处理时间长于60min后,
种子的存活率随预处理时间的延长而降低。前者
可能是由于PVS2预处理,增大膜对水分的通透
性,促进细胞外冰冻造成的脱水效果,降低细胞
内水分冰点温度,保护蛋白质和酶类,有利于超
低温保存,以及PVS2的毒害较小;后者可能是
PVS2预处理时间过长所引起的脱水伤害和化学
伤害,导致种子的萌发率降低。
经PVS2预处理45min后进行超低温保存,
成熟的束花石斛种子的存活率为80%,这可能
是一种束花石斛种质资源长期保存的有效方法。
致谢暋野外调查和实验得到了海南霸王岭国家自然保护
区王进强同志和海南大学蒙真诚、陈福、陈金花、何建
顺、水庆艳、石晶、姜郝颖、龙威同学以及中国科学院
植物研究所李燕军同学的帮助。
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