全 文 ：萱草花粉中微管蛋白生物化学性质?
廖俊杰1 , 2 , 吴英杰3
??
, 阎隆飞1
(1 中国农业大学生物学院植物生理生化国家开放重点实验室 , 北京 100094; 2 广东轻工职业技术学院食品与生物工程系 ,
广东 广州 510300; 3 Department of Medicine, Mount Sinai School of MedicineNew York , NY 10029)
摘要 : 微管 (microtubule) 是细胞骨架的重要成份 , 参与囊泡运输、信息传递等多种生命活动。我们从萱
草花粉中纯化了植物微管蛋白 , 对其生物化学及生物物理学部分性质研究表明 , 纯化的微管蛋白经超离心
法测定沉降系数为 6 .2S, SDS-PAGE 分析α, β微管蛋白分子量为 56 kD、58 kD, 凝胶扫描分析纯度为
93 .7%。等电聚焦电泳测定等电点为 pI = 5 .35。光谱学性质研究结果表明 , 最大紫外吸收峰为 280 .8 nm,
荧光光谱研究表明最大激发波长为 282 nm; 此时的最大发射峰为 338 nm, 圆二色光谱分析二级结构表明α-
螺旋占 27 .24 % , β-折叠占 24.48% , 无规卷曲为 48 .28% , 呈典型球蛋白特征。
关键词 : 微管蛋白 ; 微管 ; 花粉 ; 萱草
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)04 - 425 - 04
Biochemical Characterization of the Pollen Tubulin from
Day Lily ( Hemerocallis fulva, Liliaceae)
LIAO Jun-J ie
1 , 2
, WU Ying-Jie
3 **
, YAN Lung-Fei
1
( 1 State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, China Agricultural University, Beijing 100094 , China;
2 Department of Food and Bio-technology, Guangdong Light Industry Technologic College, Guangzhou 510300 , China;
3 Department of Medicine, Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029 , USA )
Abstract: Eucaryotic cells contain a complex network of filamentous proteins collectively called the cytoskeleton, which
participates in many cellular functions, including organellemotility and information transfer . Tubulins areoneof themain
components of the cell cytoskeleton . Tubulinsof high puritywere preparedfromday lilypollen grains, andwerebiochemi-
cally and biophysically characterized in this study .
Themolecular weight ofα-andβ-tubulin from day lily pollen is about 56 kD and 58 kD on SDS-PAGE, respectively .
The purity is 93.7% by scanning analysis . The tubulin has a sedimentation coefficient of 6 .2S and an isoelectric point of
about 5.35 . Themaximumultraviolet absorption is 280 .8 nm . Fluorescence emission wave length of day lily tubulin is 338
nmby excitation at 282 nm . Circular dichroism (CD) spectrum analysis showed that the percentage ofα-helix, β-sheet and
randomcoil of day lily tubulin is 27 .24% , 24 .48% and48 .28% , respectively, indicating atypical feature of globulin .
Key words: Tubulin; Microtubule; Pollen; Day lily
微管 (Microtubule) 是真核生物细胞中普遍
存在的空间网络结构。作为细胞骨架的主要成
分 , 其组成的基本单位是微管蛋白 ( tubulin) α,
β异二聚体 , 此异二聚体可头尾相连形成原丝 ,
再由 13 根原丝组成微管。有关微管蛋白生物化
学和药物学方面的研究绝大多数来自动物脑组
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (4) : 425～428
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence . E - mail : yyjjwu@yahoo. com
收稿日期 : 2006 - 01 - 16 , 2006 - 03 - 15 接受发表
作者简介 : 廖俊杰 (1965 - ) 男 , 硕士研究生 , 副研究员 , 主要从事植物细胞研究工作。 E - mail : junjie33@ gdqy. edu. cn ?
基金项目 : 国家自然科学基金资助 (39730280)
织 , 对植物微管蛋白生物化学方面的知识所知甚
少 , 主要原因是植物微管蛋白分离纯化相当困
难。我们利用萱草花粉为材料采用丙酮粉法、
QAE-Sephadex A50 离子交换层析及 FPLC 技术作为
主要分离纯化手段 , 建立了微管蛋白的纯化方
法 , 并研究了纯化的微管蛋白生物化学及生物物
理学部分性质。
1 材料与方法
1 .1 材料
萱草 ( Hemerocallis fulva L .) 花粉采自中国农业大学校
园栽培的萱草 , 收集花药后置于 60 W灯光下照射 , 待花粉
囊开裂后用分样筛收集花粉 , 干燥后贮于 - 80℃冰箱中。
QAE-Sephadex A50 , FPLC 整套设备及分离 预装柱
Mono Q, 均为 Pharmacia产品 , 其它生化试剂均为 Sigma
公司产品及国产分析纯试剂。
1 .2 方法
萱草花粉微管蛋白的制备 花粉经破碎 , 丙酮粉、
硫酸铵分级盐析 , QAE-Sephadex A50 及 FPLC-Mono Q 柱层
析 , 最后得到纯化的花粉微管蛋白。
蛋白质浓度测定 采用 Bradford (1976) 方法 , 以牛
血清白蛋白为标准蛋白 , 考马斯亮蓝 G250 为显色剂 ,
岛津 UV—240 分光光度计测定。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 电泳
参照 Lamelli (1970) 方法 , 分离胶浓度为 10% , 浓缩
胶浓度为 4 .8% , 分子量标准为 Sigma公司产品。蛋白质
带用考马斯亮蓝 R250 法及银染色法染色 ( Blum, 1987)。
聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 采用 5% ～12 .5% 梯度
胶为分离胶 , 浓缩胶为 4 .8 % , 显色方法同上。分子量
标准为 Pharmacia公司产品。
等电点 (PI ) 测定 用 Bio-Rad Mini IEF电泳槽 (Model
Ⅲ) 测定等电点。电泳凝胶浓度为 5% T, 3% C。两性电解
质为 Bio-Rad公司的 Bio-Lyte 3?10 Ampholyte, 凝胶支持膜为
Bio-Rad公司专用膜。点样量 2μg, 聚焦用 Bio-Rad Model
3000xi 电源 100 V 15 min, 200 V 15 min, 450 V 60 min。蛋白带
用银染色法显色 , 标准蛋白为 Pharmacia公司产品。
沉降系数的测定 利用沉降速度法 ( Shelanski,
1973) 测定沉降系数 , 转速 55 000 r?min, 温度 16℃。紫
外吸收光学扫描及 Schlieren光学系统摄影记录。
圆二色谱测定 样品溶液 1 ml (蛋白含量 1 ug?ul )
于 JASCO J500C 型圆二色谱仪上测定 200 nm～250 nm范
围的远紫外 CD谱 , 样品池光径为 1 mm, 容量 800μl。
紫外吸收光谱测定 微管蛋白紫外吸收光谱在 Beck-
man DU-7000 型分光光度计上测定 , 计算机自动绘图。
荧光光谱测定 纯化的微管蛋白样品溶液用日立 F-
4010 型荧光分光光度计测定激发光谱及发射光谱。
2 结果与分析
2 .1 萱草花粉微管蛋白的生物化学性质
分子量的测定 将丙酮粉粗提液、硫酸铵分
段盐析以及 QAE-Sephadex A50 柱、Mono Q 柱各步
纯化所得样品经 SDS-PAGE 分析 , 可得到电泳纯
的微管蛋白样品 ( 廖俊杰等 , 2005 )。微管蛋白
存在α及β两个亚基 , 利用蛋白质电泳迁移率 Rf
与分子量对数成正比的关系测定微管蛋白α及β
亚基的分子量分别为 56 kD 和 58 kD, 比动物微
管蛋白亚基的分子量略大。薄层扫描分析其纯度
达到 93 .7% , 而且α、β两个亚基是等量存在的。
天然 梯 度聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 ( Native-
PAGE) 分析 将纯化的花粉微管蛋白利用 5%～
12 .5%梯度凝胶电泳进行分析 , 结果见图 1。通常
纯化的微管蛋白应当是α、β亚基以 1∶1 二聚体存
在 , 其分子量为 110 kD, 但梯度电泳测得的分子
量为 57 kD。推测其原因可能是由于微管蛋白巯基
的氧化还原状态影响微管的聚合 , 当单体分子中
有 2 个巯基被烷化或氧化形成硫醇盐而被封闭时 ,
聚合状态就受阻。二聚体的稳定性是靠-S-S-键维
持的 , 因此巯基还原剂可能促进二聚体解聚。所
以这里测定的结果仍是单体的分子量。
等电点的测定 萱草花粉微管蛋白等电聚焦
电泳图谱 ( 图 2) , 其等电点为 5 .35 , 表明它是
一种酸性蛋白质 , 与动物微管蛋白相似。
图 1 天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 图 2 微管蛋白等电聚焦电泳
Fig . 1 Native-PAGE of purified Fig . 2 IEF-PAGE of day lily
tubulin from pollen tubulin
lane 1 , 3 : purified day lily tubulin lane 1 , 2 : day lily tubulin
lane 2: Standard markers lane 3: Standard markers
624 云 南 植 物 研 究 28 卷
沉降系数的测定 纯化的微管蛋白溶液在
pH6 .9 , 0 .1 mol?L 磷酸缓冲液 ( 内含 0 .1 mol?L
NaCl , 1 mmol?L PMSF , 1 mmol?L TPCK 和 1 mmol?L
TAME) 充分透析后浓缩至蛋白质浓度 0 .34 mg?
ml , 55 000 r?min 离心 , 检测吸收峰。以吸收界
面至转头中心距离的对数 ( logr) 对时间 ( t) 作
图 (图 3 ) , 从所得直线求出斜率为 0 .473159×
10 - 3 , 代入公式 : S = 2 .303?60ω2· ( d log?dt) , 式
中ω为角速度 ( 弧度?秒 ) , r 为轴心至沉降界面
的距离 ( cm) , t为时间 ( 秒 )。
通过温度补偿校正计算出沉降系数 S20w为
6.2S, 比动物微管蛋白沉降系数 5.8～6S 略大一
些 , 这正好与 SDS-PAGE 所测定的植物微管蛋白
分子量比动物微管蛋白分子量略大的结果相一致。
图 3 微管蛋白沉降系数测定 图 4 微管蛋白圆二色谱图
Fig . 3 Sedimentation coeffici- Fig . 4 Circular dichroismspec-
ent of day lily tubulin trum of day lily tubulin
2 .2 植物微管蛋白生物物理性质
2 .2 .1 圆二色谱的测定与二级结构的预测
一般 认为 , CD 光谱 法 ( Circular Dichroism
Spectrum) 是测定生物大分子构象的手段 , 可反
映出非对称分子内部结构信息。当圆偏振光通过
含有生物大分子物质的溶液时 , 由于这些分子的
不对称性及分子中发色团周围电荷分布的不对称
性 , 可使左、右的圆偏振光消光系数的差产生二
色性。分子或分子中电荷分布越不对称 , 这种差
值就越大 , 反映在 CD 光谱中的θ值越大 , 所以
远紫外区的圆二色性反映了蛋白质主肽链的构
象。微管蛋白的远紫外区圆二色谱见图 4。微管
蛋白在 208 nm, 215 nm有二个平缓的负峰 , 呈现
出球蛋白的特征。根据 Chen (1974) 的方法 , 从
圆二色光谱上计算出微管蛋白二级结构中的α-螺
旋 , β-折叠 , 无规卷曲的含量分别为 27 .24% ,
24 .48%和 48 .28%。
2.2.2 紫外吸收光谱分析 萱草花粉微管蛋白的
紫外最大吸收波长为 280.8 nm, 这主要是由色氨
酸残基的吲哚环和酪氨酸残基的酚基所贡献的。
2 .2 .3 荧光光谱分析 荧光光谱是研究蛋白质
结构和功能的一种重要手段 , 一般可分为外源荧
光和内源荧光 , 内源荧光是指由蛋白质内色氨
酸、酪氨酸、苯丙氨酸等的荧光生色团产生的荧
光。由于这些残基都是蛋白质的天然成分 , 利用
它们作为蛋白质内源的“报导”基团 , 可以更加
准确地反映出天然状态下蛋白质结构和功能的变
化。花粉微管蛋白的荧光光谱分析见图 5。从图
中可以看出 , 最大荧光发射波长为 338 nm, 最适
激发波长为 282 nm。表现了色氨酸与酪氨酸两者
的荧光光谱特征。
图 5 萱草花粉蛋白荧光发射光谱
Fig . 5 Fluorescence emmision spectrum of tubulin from day lily pollen
A : EX Spectrum B : EM Spectrum
3 讨论
与动物微管相比 , 植物微管的研究是比较落
后的 , 主要原因就是难以制备足够量的微管蛋白
及其相关蛋白。Morejohn 等 ( 1982 , 1984 ) 从玉
米、烟草、胡萝卜、玫瑰悬浮细胞中分离纯化得
到微管蛋白 , 并体外聚合成功。但有关植物微管
蛋白的生化特征尚未见报道 , 可能也是纯化的数
量太少之故。而且悬浮细胞经过脱分化过程产
7244 期 廖俊杰等 : 萱草花粉中微管蛋白生物化学性质
生 , 能否代表正常的植物细胞尚待确定。我们选
用干物质十分丰富 , 微管蛋白含量较高的植物花
粉作为材料并利用丙酮粉及 PVP 消除了氧化酶
及次级代谢物的影响。利用该方法可以得到毫克
级的电泳纯微管蛋白。
所有的微管都是由相似的蛋白亚基即α, β-
二聚体所组成 , 在纯化过程中要维持α, β-二聚
体的稳定结构 , 必须维持二硫键的稳定。否则得
到的是单体的蛋白亚基。Oakley ( 1993 ) , Stearns
(1993 ) 等发现一种新的微管蛋白组分γ - 微管
蛋白 , 占总微管蛋白含量的 1% 左右 , 存在于中
心粒或纺锤极体中 , γ-微管蛋白可能不直接参与
微管结构的组成 , 但可能对微管发生中的微管成
核过程起作用。本试验中纯化的是α, β等量的
蛋白亚基 , 并未发现γ-微管蛋白 , 可能是γ-微
管蛋白含量太少的缘故。
微管的α-微管蛋白亚基上含有一个不可交换
的 GTP 结合位点 , β亚基上含有一个可交换的
GTP 结合位点 , 而且这个可交换的 GTP 结合位
点在β-微管蛋白的氨基端随着微管的聚合它可被
水解成 GDP, 为微管聚合提供能量 , 所以在微管
的内部 , β亚 基都是结合 GDP 的 ( Madelkow,
1994) 。由于 GTP 在微管聚合时已经结合到微管
蛋白上 , 并起着稳定微管蛋白的作用 , 所以按我
们的纯化方法可以省去纯化过程中的 GTP, 大大
降低了费用。鉴于微管蛋白是 GTP 结合蛋白并
参与了信号传递 , 表现了部分 G-蛋白的特征 ,
所以现在也把微管蛋白归为 G-蛋白家族中的一
员 (Shivanna, 1993)。
植物微管与动物微管具有很大的可比性 , 例
如利用 Taxol 诱导 , 动植物微管蛋白都可以聚合
形成微管 ( Bokros 等 , 1993 ) , 并且植物微管可
以和神经系统中微管结合蛋白 MAPs紧密地结合
(Hugdahl , 1993) 。从我们得到的上述生化性质结
果看 , 无论从分子量 ( 图 1 )、等电点 (图 2 ) 还
是二级结构的成分预测 ( 图 3 ) , 都与动物微管
蛋白相似。天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分析及
沉降系数的测定都表明植物微管蛋白的分子量比
动物微管蛋白的分子量略大。我们纯化的微管蛋
白在紫杉醇诱导下 , 也成功地完成了体外聚合
(廖俊杰 , 2005) , 再次证明动植物微管蛋白有着
相同的化学特性和聚合机制。这可能与微管蛋白
在进化上相对保守相符。
虽然我们通过圆二色谱的测定可以进行微管
蛋白二级结构的预测 , 通过紫外吸收光谱分析和
荧光光谱分析可以推测微管蛋白内部含有色氨酸
与酪氨酸残基 , 呈现球蛋白特征。但有关微管蛋
白的其它结构与功能仍有待更深入研究。
〔参 考 文 献〕
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