全 文 ：DNA条形码在中国金合欢属中的应用*
欧阳铖人1,2, 孙摇 航2, 李志敏1**, 张建文2**
(1 云南师范大学生命科学学院, 云南 昆明摇 650092; 2 中国科学院昆明植物研究所生物多样性
与生物地理学重点实验室, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 根据形态特征难以准确地辨别金合欢属植物, DNA条形码技术提供了一种准确地鉴定物种的方法。
本文利用条形码技术对中国金合欢属物种的序列 ( psbA鄄trnH、 matK、 rbcL 和 ITS) 及其不同组合进行比
较, 通过计算种内和种间变异进行 barcoding gap分析, 运用Wilcoxon秩和检验比较不同序列的变异性, 构
建系统树。 结果表明: 4 个片段均存在 barcoding gap, ITS序列种间变异率较 psbA鄄trnH、 rbcL和 matK序列
有明显优势, 单片段 ITS正确鉴定率最高, ITS+rbcL片段联合条码的正确鉴定率最高, 因此我们认为 ITS
片段或条形码组合 ITS+rbcL是金合欢属的快速鉴别最理想的条码。
关键词: ITS; rbcL; matK; psbA鄄trnH; DNA条形码; 金合欢属; 物种鉴定
中图分类号: Q 949. 7, Q 946. 2摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)05-547-08
Application of DNA Barcoding in Chinese Acacia s. l. (Leguminosae)
OU YANG Cheng鄄Ren1,2, SUN Hang2, LI Zhi鄄Min1**, ZHANG Jian鄄Wen2**
(1 School of Life Science, Yunnan Normal University, Kunming 650092, China; 2 Key Laboratory of Biodiversity and
Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: It is difficult to identify Chinese species of Acacia accurately based on morphological assessment unless an
intact specimen is at hand. In contrast, DNA barcoding through the analysis of short DNA sequences from a small
sample of tissue can provide an accurate method for identifying species. In this study, we used four DNA fragments
(rbcL, matK, psbA鄄trnH, and ITS) to develop a potential barcoding method for Chinese Acacia. Our analysis in鄄
volved calculating inter鄄 and intra鄄specific genetic distances, conducting Wilcoxon signed rank tests to analyze the
sequence variation, and constructing phylogenetic trees from distance data. The results showed that barcoding gaps
exist between Acacia species for each of the four sequences, with ITS showing highest inter鄄specific divergence. Both
the use of ITS on its own and in combination with rbcL sequence variation gave the highest level of species identifica鄄
tion. We therefore propose the use of ITS sequence variation on its own or combined with rbcL as a DNA barcode for
identifying Acacia species in China.
Key words: Acacia; ITS; rbcL; matK; psbA鄄trnH; DNA barcoding; Species identification
摇 DNA条形码 (DNA barcoding) 是利用特殊
的、 可用于物种鉴定的 DNA 序列来鉴别物种的
工具, 该技术已被用于物种的鉴定和新种的发现
(Li等, 2011; Liu 等, 2011)。 自加拿大生物学
家 Hebert等 (2003) 正式提出 DNA 条形码概念
后, 条形码技术迅速成为国际上生物分类学研究
的热点 (宁淑萍等, 2008; 任保青和陈之端,
2010)。 DNA 条形码在植物类群中的研究随之展
开, 国内外许多学者进行积极的探索, 主要从叶绿
体基因组和核基因组中寻找理想的 DNA 条形码
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (5): 547 ~ 554
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201312148
*
**
基金项目: 中科院大科学装置工程项目 (2009鄄LSFGBOWS鄄01)、 国家自然科学基金项目 (31061160184)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: lizhimin_vip@ 163. com; zhangjianwen@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2012-11-08, 2013-03-20 接受发表
作者简介: 欧阳铖人 (1988-) 男, 硕士研究生, 主要从事植物系统与生物地理学研究。 E鄄mail: oycr6018@ 126. com
(闫化学和于杰, 2010; Chase 等, 2005)。 Kress 等
(2005) 利用 9 个叶绿体片段 ( trnK鄄rps16、 trnH鄄
psbA、 rp136鄄rps8、 atpB鄄rbcL、 ycf6鄄psbM、 trnV鄄
atpE、 trnC鄄ycf6、 psbM鄄trnD) 以及基因片段 ITS 对
整个被子植物类群进行分析, 提出 ITS和 trnH鄄psbA
组合是较好的选择。 Kress和 Erickson (2007) 提出
rbcL和 trnH鄄psbA组合作为整个陆地植物的条形码。
生物条形码联盟 (CBOL) (2009) 推荐 matK 和
rbcL组合作为陆地植物的核心条形码。 随后, 有学
者提出将 ITS作为种子植物研究的核心条码, 并得
到学者们的认同 (Chen 等, 2010; Gao 等, 2010;
Wang 等, 2011; China Plant BOL Group, 2011;
Logacheva等, 2008)。 总之, 植物 DNA条形码的研
究工作已全面展开, 叶绿体片段 ( psbA鄄trnH、
matK、 rbcL) 和核基因片段 ITS已广泛的应用于植
物 DNA 条形码的研究中 (Liu 等, 2011; Fu 等,
2011; Du等, 2011; China Plant BOL Group, 2011)。
金合欢属 (Acacia) 是世界特大属之一, 该属
在全世界分布约 1 200种, 主要分布于大洋洲和非
洲 (吴德邻, 1988; 孙航, 2006), 中国约 16 种, 3
变种 (孙航和陈介, 1990)。 传统金合欢属被独立
为5个属, 即 Acacia、 Senegalia、 Vachellia、 Acaciel鄄
la和Mariosousa (Maslin 等, 2003), 中国自然分布
的金合欢属植物应属于 Senegalia, 鉴于中国及邻国
的植物志仍然使用广义的 Acacia名称, 为了使用的
方便, 我们在这里仍然沿用广义金合欢属的概念
(孙航和陈介, 1990; Sun, 2006; Nielsen, 1985;吴德
邻, 1988; Wu, 2010)。 金合欢属植物属内鉴别困难
是本属分类的焦点问题之一, 因该属植物在种间形
态上差别不大, 几乎都为头状花序、 二回羽状复
叶, 小叶形态、 大小等有较高的相似度, 在标本
不完整时鉴定很困难, 且属内分类也存在较大的
争议 (孙航和陈介, 1990; Wu, 2010)。 鉴于金
合欢属在形态鉴定的困难, 急需一种方法来弥补
形态分类学中的不足, 而 DNA 条形码技术的出
现使金合欢属植物快速鉴定成为可能, 如 New鄄
master 和 Ragupathy ( 2009 ) 利用 psbA鄄trnH、
matK和 rbcL条形码实现 DNA条码技术对金合欢
属植物近缘种类快速鉴定。 本研究将利用叶绿体
DNA 片段 ( psbA鄄trnH、 matK、 rbcL) 和核基因
片段 ITS从分子水平上解决形态分类学中存在的
问题, 实现中国金合欢属种类的快速鉴别。
1摇 材料与方法
1. 1摇 实验材料
金合欢属实验材料主要来自野外采集, 少部分来源
于腊叶标本, 从 GenBank中下载部分数据, 材料种类及
来源见表 1。 本实验研究材料共 39 个个体代表该属 15
个种及 2 个变种, 采集生长良好, 无病斑的幼叶, 用硅
胶快速干燥后带回实验室, 采集 2 ~ 5 株代表个体作为
凭证标本, 凭证标本保存于中国科学院昆明植物研究所
标本馆 (KUN)。
1. 2摇 实验方法
每个样品称取约 15 mg, DNA的提取采用 OMEGA试
剂盒提取, 并参照试剂盒方法提取总 DNA。 ITS扩增采用
White等 (1990) 设计的通用引物 ITS1 和 ITS4, psbA鄄
trnH引用 Miller等 (2003) 使用的引物, rbcL参照 Fay等
(1997) 使用的引物, matK参照 Yu等 ( 2011) (表 2)。
扩增反应采用 20 滋L反应体系, 包括 30 ~ 60 ng的模
板 DNA, 2 滋L 10伊PCR 反应缓冲液, 1. 6 滋L MgCl2 (25
mmol·L-1), 1. 6 滋L dNTP 混合液 (10 mmol·L-1 ) 正反
引物各 1 滋L (10 mmol·L-1), Taq DNA聚合酶 0. 5 单位。
反应程序如下: 94 益预变性 4 min, 94 益变性 1 min, 55
益退火 1 min, 72 益延伸 1 min, 35 个循环, 最后 72 益延
伸 7 min。 扩增得到的 PCR产物在 1. 5%的琼脂糖胶上电
泳, 在 ABI 3700 测序仪上测序, 由测序公司完成。
1. 3摇 数据分析
测定的序列编辑和拼接用软件 Sequencher 4. 14 完
成, 使用软件 BioEdit ( Hall, 1999) 和 Clustal W1. 83
(Thompson等, 1994) 进行校正和多重序列比对, 并进
行了相应的手工调整。
种内、 种间遗传距离基本采用 K2P模型计算 (Kimura鄄
2鄄parameter distance)。 Wilcoxon 秩和检验可以用来评估
种内和种间变异的分布是否存在重叠, 用来比较各片段
序列之间的变异性差异 (Kress和 Erickson, 2007)。 DNA
条形码的指标是 barcoding gap 是否存在, 即用柱形图表
示种间和种内的遗传距离分布频率, 对所研究的片段进
行检验。 本文使用 MEGA 5. 0 (Tamura 等, 2011) 软件
计算种内、 种间遗传距离, 并构建能体现种内、 种间遗
传距离的分布柱形图。 通过 Wilcoxon秩和检验来检验各
片段序列之间的变异性差异。 物种的分辨率也是评价
DNA条形码的一个重要指标。 若每个种的所有个体都聚
为一个单系分支则认为该物种鉴定正确 (宁淑萍等,
2008; Hollingsworth 等, 2009)。 利用 MEGA 5. 0 软件
(Tamura等, 2011) 构建系统树 (UPGMA, NJ, MP, ML),
建树时采用 K2P 模型, 所有对位排列结果中的空位
(gaps) 或缺失数据 (missing data) 作完全删除 ( com鄄
plete deletion) 处理, 系统树的每个分支的支持率以自展
支持率 (bootstrap) 进行检验, 以 5 000 次重复运算。
845摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
表 1摇 实验材料及来源
Table 1摇 Origins of materials
种名 Species 采集地 Locality 凭证标本Voucher (KUN)
GenBank序列号
ITS rbcL matK psbA鄄trnH
鸭皂树 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9609 KF532059 KF532022 —————— KF531983
Acacia farnesiana 永胜 Yongsheng 孙航 15634 KF532075 KF532038 —————— KF531999
儿茶 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9608 KF532064 KF532027 KF531950 KF531988
A. catechu 西双版纳 Xishuangbanna 董金龙 C06012 KF532079 KF532043 KF531964 KF532003
尖叶相思 孟定 Mengding 王焕冲等 20110222 KF532062 KF532025 KF531948 KF531986
A. caesia 盈江 Yingjiang 孙航 1498 KF532073 KF532041 KF531959 KF531997
羽叶金合欢 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9611 KF532058 KF532021 KF531945 KF531982
A. pennata 峨山 Eshan 欧阳铖人 OY010 KF532072 KF532037 KF531958 KF531996
滇南金合欢 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9603 KF532057 KF532020 KF531944 KF531981
A. tonkinensis 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9614 KF532077 KF532036 KF531962 KF532001
海南金合欢 金平 Jinping 王焕冲等 20110182 KF532061 KF532024 KF531947 KF531985
A. hainanensis 屏边 Pingbian 毛品一 3922 KF532076 KF532040 KF531961 KF532000
钝叶金合欢 新平 Xinping 孙航 15776 KF532056 KF532019 KF531943 KF531980
A. megaladena 元江 Yuanjiang 孙航 15792 KF532070 KF532035 KF531956 KF531994
var. megaladena 新平 Xinping 孙航 15781 KF532086 KF532049 KF531971 KF532010
盘腺金合欢 A. mega鄄 凤庆 Fengqing 孙航 15765 KF532089 KF532013 KF531937 KF531974
ladena var. garrettii 老挝 Laos 孙航 12484 KF532088 KF532051 KF531973 KF532012
粉被金合欢 六库 Liuku 孙航 15758 KF532055 KF532018 KF531957 KF531979
A. pruinescens 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9613 KF532071 KF532034 KF531942 KF531995
阔叶相思树 鹤庆 Heqing 孙航 15732 KF532054 KF532014 KF531938 KF531975
A. delavayi var. 永胜 Yongsheng 孙航 15622 KF532078 KF532017 KF531941 KF531978
delavayi 鹤庆 Heqing 冯国楣 844 KF532090 KF532033 KF531963 KF532002
盐丰金合欢 泸定 Luding 孙航等 15148 KF532053 KF532016 KF531940 KF531977
A. teniana 石棉 Shimian 孙航等 15152 KF532069 KF532032 KF531955 KF531993
禄劝 Luquan 陈林杨 009 KF532085 KF532048 KF531970 KF532009
云南金合欢 盐源 Yanyuan 孙航等 15031 KF532052 KF532015 KF531939 KF531976
A. yunnanensis 冕宁 Mianning 孙航等 15045 KF532068 KF532031 KF531969 KF531992
冕宁 Mianning 孙航等 15054 KF532084 KF532047 KF531954 KF532008
昆明金合欢 峨山 Eshan 武素功 209 KF532063 KF532026 KF531972 KF531987
A. delavayi var. 昆明 Kunming 邱炳云 50141 KF532074 KF532042 KF531949 KF531998
kunmingensis 西畴 Xichou 孙必兴 708 KF532087 KF532050 KF531960 KF532011
藤金合欢 西双版纳 Xishuangbanna 孙航等 9612 KF532060 KF532023 KF531946 KF531984
A. concinna 景东 Jingdong 孙航 12048 KF532080 KF532039 KF531965 KF532004
银荆 昆明 Kunming 欧阳铖人 OY033 KF532065 KF532028 KF531951 KF531989
A. dealbara 昆明 Kunming 欧阳铖人 OY034 KF532081 KF532044 KF531966 KF532005
黑荆 昆明 Kunming 欧阳铖人 OY036 KF532066 KF532029 KF531967 KF531990
A. mearnsii 昆明 Kunming 欧阳铖人 OY040 KF532082 KF532045 KF531952 KF532006
台湾相思 昆明 Kunming 欧阳铖人 OY037 KF532067 KF532030 KF531953 KF531991
A. confusa 昆明 Kunming 欧阳铖人 OY038 KF532083 KF532046 KF531968 KF532007
种名 Species
GenBank序列号
ITS rbcL matK psbA鄄trnH
种名 Species
GenBank序列号
ITS rbcL matK psbA鄄trnH
A. melanoxylon JF420093 HM849736 HM850601 JF420206 A. tortilis JQ265926 EU213441 JF270618 JQ230201
A. melanoxylon JF420314 JF419987 A. subrigida JF420086 JF419986 JF420199
A. auriculiformis JX856395 JX856619 A. subrigida DQ029251 JF420200
A. auriculiformis JX856534 JX856620 A. victoriae JF420087 AF274226
A. cyclops JF420024 JQ412305 JQ412187 JF420134 A. victoriae DQ029278
A. cyclops JF420248 JF419923 A. chartacea DQ029263
A. longifolia JF420332 HM849735 HM850600 JF420225 A. chartacea DQ029241
A. longifolia JF420111 JF420006 A. rigens JF420108 JF420003 JF420222
A. mucronata JF420107 JF420002 A. rigens FJ868405
A. mucronata JF420329 A. karroo JQ265837 JF265252 JF270609 AF524992
A. tortilis JQ265928 EU213443 JX850063 JQ230203 A. karroo JQ265837 EU042178 AF274137
9455 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 欧阳铖人等: DNA条形码在中国金合欢属中的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 PCR 扩增引物及序列
Table 2摇 Polymerase chain reaction primers and conditions used for amplification and sequences
Gene and region Name of primer Primer sequence 5忆-3忆 Origin
rbcL 1f724r
ATGTCACCACAAACAGAAAC
TCGCATGTACCTGCAGTAGC Fay et al., 1997
matK 472F1248R
CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC
GCT RTRATAATGAGAAAGATTTCTGC Yu et al., 2011
trnH鄄psbA trnH
GUG
psbA
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAACGTAATGCTC Miller et al., 2003
ITS ITS1ITS4
AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al., 1990
2摇 结果
2. 1摇 PCR扩增和测序成功率
DNA 片段引物通用性是条形码评价的重要标
准之一 (Kress等, 2005)。 本研究选用的 4个 DNA
片段都表现较好的 PCR扩增效率和测序效率 (表
3), rbcL和 psbA鄄trnH引物的通用性 (PCR扩增和
测序成功率) 表现最好, 为 100%; ITS和 matK各
有少量样品测序失败, PCR测序成功率为 90%。
2.2摇 Barcoding gap的评估和Wilcoxon秩和检验
表 3摇 四个候选片段序列及扩增、 测序效率表
Table 3摇 PCR amplification and sequencing success
rate of four candidate segments
Potential
barcode
Aligned
length / bp
Variable
sites / bp
PCR
success / %
Sequencing
success / %
rbcL 678 36 100 100
matK 755 32 100 90
ITS 599 116 100 90
psbA鄄 trnH 540 36 100 100
摇 摇 Barcoding gap 是评价 DNA 条形码的标准之
一。 理想的 DNA条形码检测到的种间遗传变异应
明显大于种内遗传变异, 形成一个明显的间隔区,
在理想状况下, 柱形图上的种内变异会集中在数
值较小的一侧, 而种间变异则集中在数值较高的
一侧 (Meyer和 Paulay, 2005)。 在 4 个片段遗传
距离分布图中 (图 1), ITS 片段的种间遗传变异
最大, 种内和种间存在明显的 barcoding gap, 叶
绿体片段 psbA鄄trnH、 matK和 rbcL在 0. 001 ~0. 004
有重叠, 但仍表现出一定的 barcoding gap。 Wilc鄄
oxon秩和检验可以用来评估种内和种间变异的分
布的差异 (Kress 和 Erickson, 2007)。 利用 Wilc鄄
oxon秩和检验对不同序列种内和种间的变异进行
统计分析, 结果表明 4 个片段的种内变异率无明
显差别 (表 4), 种间变异率则表现出一定的差异
(表 5), ITS的种间变异最大, psbA鄄trnH 的种间
变异最小, 即 ITS>rbcL>matK>psbA鄄trnH。
图 1摇 四个候选片段的种内种间遗传变异 (X轴: K2P遗传距离; Y轴: 分布频率)
Fig. 1摇 Comparisons of frequency distribution of intra鄄 and inter鄄 specific pairwise distances among four barcoding
candidate segments (x axis: pairwise distance; y axis: frequency distribution)
055摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
2. 3摇 物种分辨率
物种分辨率是评价 DNA 条形码的另一个重
要指标, 条形码分析中通常采用标准的分子系统
学方法建立多种系统树, 目的是为了检验每个物
种的单源性, 即同一物种的不同个体能否紧密聚
类到一起 (宁淑萍等, 2008)。 不同的建树方法
可能得到不同的效果, 通过 K2P 模型对 4 种方
法 (UPGMA, NJ, MP, ML) 的比较发现 UPG鄄
MA和 NJ分析较 MP和 ML有较高的物种分辨率
(表 6), 而 NJ树常在 DNA条形码研究中广泛使
用 (宁淑萍等, 2008)。 四个 DNA片段中 ITS 有
较高的物种分辨率, 通过 UPGMA 和 NJ 分析构
建的 ITS 系统树能较好的分辨不同的物种 (表
6)。 matK、 rbcL和 psbA鄄trnH单独使用时物种分
辨率较低, 只能识别 22. 7% ~ 38. 4% 的种类,
联合叶绿体片段时分辨率升高 (43. 6% ~61. 5%),
联合 ITS和叶绿体片段时能较好的分辨金合欢属
的种类 (82. 1% ~86. 7% ), 联合 ITS+rbcL 时有
最高分辨率, 与 3 个片段联合和 4 个片段联合具
有相同的物种鉴定效率 (表 6)。
表 4摇 种内遗传变异的Wilcoxon检验
Table 4摇 Wilcoxon test of pairwise intra鄄specific variation
W+ W鄄 Relative Ranks N P value Result
ITS rbcL W+=7, W鄄=13 17 P=0. 600 ITS= rbcL
ITS psbA鄄trnH W+=2, W鄄=8 17 P=0. 273 ITS= psbA鄄trnH
ITS matK W+=0, W鄄=6 17 P=0. 109 ITS=matK
rbcL matK W+=2, W鄄=8 17 P=0. 273 rbcL=matK
rbcL psbA鄄trnH W+=2, W鄄=4 17 P=0. 593 rbcL= psbA鄄trnH
matK psbA鄄trnH W+=2, W鄄=1 17 P=0. 655 matK= psbA鄄trnH
表 5摇 种间遗传变异的Wilcoxon检验
Table 5摇 Wilcoxon test of pairwise inter鄄specific variation
W+ W鄄 Relative Ranks N P value Result
ITS rbcL W+=9094, W鄄=86 136 P臆0. 001 ITS>rbcL
ITS psbA鄄trnH W+=376, W鄄=8803 136 P臆0. 001 ITS>psbA鄄trnH
ITS matK W+=0, W鄄=8911 136 P臆0. 001 ITS>matK
rbcL matK W+=1322, W鄄=5580 136 P臆0. 001 rbcL>matK
rbcL psbA鄄trnH W+=8848, W鄄=66 136 P臆0. 001 rbcL>psbA鄄trnH
matK psbA鄄trnH W+=71, W鄄=7803 136 P臆0. 001 matK>psbA鄄trnH
表 6摇 条形码重新构建中国金合欢属系统树单源性的百分比
Table 6摇 Percent of Acacia species recovered as monophyletic based on phylogenetic trees for each barcode in China
Potential barcode UPGMA NJ MP ML
rbcL 22. 7 (18. 7) 22. 7 (18. 7) 22. 7 (18. 7) 22. 7 (18. 7)
matK 33. 3 (31. 3) 33. 3 (31. 3) 30. 6 (31. 3) 30. 6 (31. 3)
ITS 78. 8 (74. 1) 78. 8 (74. 1) 74. 2 (58. 2) 74. 2 (58. 2)
psbA鄄trnH 38. 4 (37. 5) 38. 4 (37. 5) 33. 3 (33. 3) 33. 3 (33. 3)
rbcL+matK 43. 6 (37. 5) 43. 6 (37. 5) 41. 7 (31. 3) 41. 7 (31. 3)
rbcL+psbA鄄trnH 51. 3 (45. 0) 51. 3 (45. 0) 41. 7 (31. 3) 41. 7 (31. 3)
matK+psbA鄄trnH 51. 3 (42. 8) 51. 3 (42. 8) 52. 8 (31. 3) 52. 8 (31. 3)
rbcL+matK+psbA鄄trnH 61. 5 (65. 0) 61. 5 (65. 0) 55. 6 (37. 5) 55. 6 (37. 5)
ITS+ rbcL 86. 7 (81. 3) 86. 7 (81. 3) 78. 8 (76. 3) 78. 8 (76. 3)
ITS+matK 82. 1 (71. 4) 82. 1 (71. 4) 82. 1 (71. 4) 82. 1 (71. 4)
ITS+psbA鄄trnH 82. 1 (71. 4) 82. 1 (71. 4) 82. 1 (71. 4) 82. 1 (71. 4)
ITS+rbcL+matK 86. 7 (87. 5) 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1)
ITS+psbA鄄trnH+rbcL 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1)
ITS+rbcL+matK+psbA鄄trnH 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1) 86. 7 (73. 1)
Resolved species with bootstrap >70% are in brackets. ITS: internal transcribed spacer; ML: maximum likelihood; MP: maximum parsimony;
NJ: neighbor joining; UPGMA: unweighted pair group method with arithmetic mean
1555 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 欧阳铖人等: DNA条形码在中国金合欢属中的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 ITS+rbcL基于 K2P模型构建金合欢属的 NJ树
Fig. 2摇 A neighbor joining tree of Kimura鄄2鄄parameter distances based on ITS+rbcL for Acacia species
3摇 讨论
3. 1摇 DNA条形码的评价
DNA条形码是一种精确的物种鉴别工具,
核心工作之一是寻找适合的条形码片段。 条形码
最基本的评价是引物通用性和 barcoding gap的评
价 (Kress等, 2005; Meyer和 Paulay, 2005)。 本
研究中, 4 个候选片段都表现较好的通用性 (表
3), ITS相对测序成功率较低, 可能与核基因存
在多拷贝有关 (Li 等, 2011)。 Barcoding gap 分
析中, 4 个候选条形码片段种内和种间遗传距离
分析表明 4 个片段均存在 barcoding gap, 种内遗
传变异都无显著差异, 种间遗传变异差异明显,
表现为 ITS 片段的种间遗传变异最大, 其次是
rbcL, 而 psbA鄄trnH 最小。 基于 4 个片段均具有
255摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
良好的扩增效率和测序成功率, 且都存在 bar鄄
coding gap, 我们认为 4 个片段都适合作为金合
欢属的候选条码。
3. 2摇 物种分辨率评价
物种的分辨率是评价 DNA 条形码的一个重
要指标 (Hollingsworth等, 2009)。 本研究中, 单
片段鉴定能力为 ITS 最高, rbcL 最低, 即: ITS>
psbA鄄trnH>matK>rbcL。 ITS能较好的区分金合欢
属的种类, 绝大部分种类均能形成单系分支, 表
现出较好的物种分辨能力 (78. 8% )。 基于 ITS
在物种分辨率方面有明显的优势, 所考察的候选
序列中具有较大的种间变异和物种鉴定成功率,
引物的通用性较高, 符合标准条形码的要求, 故
认为 ITS适合作为金合欢属植物标准条形码的候
选条码。 单片段 rbcL 和 matK 的物种鉴定率较
低, 分别为 22. 7%和 33. 3% , 但与其他片段组
合能提高物种的正确鉴定率, 两者均具有较高的
引物通用性, 因此可以作为候选条码。 psbA鄄
trnH具有较高的引物通用性, Wilcoxon秩和检验
种间变异在候选片段最小, 然而其物种的正确鉴
定率却比 rbcL 和 matK 高, 达 38. 4% 。 我们对
psbA鄄trnH序列排列比对时发现该片段存在较多
的插入和缺失位点, 有学者认为利用好插入 /缺
失有助于物种鉴定 (赵月梅和张玲, 2011; Liu
等, 2011; Newmaster和 Ragupathy, 2009)。
物种鉴定中多个条形码片段的组合比单一片
段往往能更有力的区别物种 (CBOL Plant Work鄄
ing Group, 2009; Fu 等, 2011)。 联合核心条形
码 ( rbcL+matK) 时, 能解决 43. 6%的金合欢属
种类, 远比使用单一条形码高 ( rbcL 22. 7% 、
matK 33. 3% ), 但这与 CBOL (2009) 推荐 rbcL
+matK作为核心条形码能解决 72%种类差异较
大, 因为 CBOL评价的种类是综合不同种类, 我
们的结果仅仅是中国分布的金合欢属种一级别的
鉴定。 当 ITS+rbcL 组合时显示最高的正确鉴定
率, 能解决 86. 7%的种类, 绝大部分种类聚为
单系分支, 且具有较高的内部支持率 (图 2),
表现出高的物种分辨能力。 与 3 个条形码组合和
4 个条形码组合具有相同的物种鉴定效率。 因
此, 我们建议使用 ITS+rbcL 组合作为标准条形
码来精确地鉴定金合欢属植物。
综上所述, ITS 片段或者 ITS+rbcL 组合有较
高的物种鉴定效率, 并且两个片段均存在 barcod鄄
ing gap, 因此我们认为 ITS 片段或 ITS+rbcL 作为
标准条形码来鉴定金合欢属植物是较为合适的。
3. 3摇 分类学问题的修订
DNA条形码技术除帮助鉴定现有的物种外,
还能帮助解决一些分类学问题, 发现新的物种或
隐种 (Newmaster 和 Ragupathy, 2009)。 金合欢
属植物在特殊的环境影响下, 有些种类形态或遗
传结构已经发生了变化, 需要用 DNA 条形码的
方法结合形态特征来重新评估现有物种的分类地
位, 在本研究结果中, 羽叶金合欢和海南金合欢
分别聚集于不同的分支上 (图 2), 此两种也曾
因外部形态高度相似, 而被合并 (Wu, 2010),
利用 DNA条形码技术, 很容易将二者分开, 因
此, 支持孙航和陈介 (1990) 将羽叶金合欢和
海南金合欢作为两个独立类群的处理。
致谢摇 中国科学院西双版纳植物园董金龙, 中国科学院
昆明植物研究所高山植物多样性研究组周卓、 邓涛、 王
洽、 牛洋、 陈永生、 岳亮亮、 朱鑫鑫、 陈林杨和王焕冲
帮助采集或提供材料, 宋敏舒在实验中给予指导, 彭德
力在论文修改中给予建议。
也参摇 考摇 文摇 献页
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