全 文 ：氮源和真菌诱导子对铁皮石斛原球茎悬浮培养的影响
?
宋经元 , 郭顺星?? , 肖培根
(中国医学科学院·中国协和医科大学药用植物研究所 , 北京 100094)
摘要 : 利用正交实验设计研究不同种类和浓度的氮源对铁皮石斛原球茎生长的影响 , 利用完全随机实验设
计研究不同真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的影响。结果表明硝态氮促进铁皮石斛原球茎鲜
重和干重的增加 ( P < 0 .05) ; 铵态氮促进铁皮石斛原球茎鲜重增加 ( P < 0 .05)。无论鲜重还是干重 , 硝
态氮和铵态氮的影响均不存在互作 , 最佳组合为 : 67-V 培养液 + 100 mg?L (NH4 )2 SO4 + 800 mg?L KNO3 + 30
g?L 蔗糖 + 200 g?L 马铃薯提取汁。F 检验的结果表明 , 14 种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生物量的增加
(鲜重与干重 ) 均无显著性影响 ( P > 0 .05)。但与对照铁皮石斛原球茎的多糖含量相比 , 真菌诱导子 g6、
g14、g5、g4 处理可使其多糖含量分别提高 14%、9 %、6%、4 %。本研究获得了有利于铁皮石斛原球茎生
长的硝态氮和铵态氮的最佳搭配方案以及有利于铁皮石斛原球茎积累多糖的四种真菌诱导子 , 表明通过液
体悬浮培养生产铁皮石斛原球茎及其多糖成分具有较好的开发应用前景。
关键词 : 正交实验设计 ; 完全随机实验设计 ; 铁皮石斛 ; 生物量 ; 多糖积累
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 01 - 105 - 05
Effects of Nitrogen Source and Fungal Elicitors on Biomass
and Polysaccharide Accumulation in Suspension Cultured
Protocorms of Dendrobium candidum (Orchidaceae)
SONG Jing-Yuan, GUO Shun-Xing* * , XIAO Pei-Gen
( Instituteof Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100094 , China)
Abstract: Biotic and abiotic elicitors have dramatically promoted the accumulation of secondary metabolites in plant cell cul-
tures . In this paper, through theorthogonal design and the randomized complete experimental design, we have investigated ef-
fects of nitrate source and fungal elicitors on growthand polysaccharideaccumulation in suspension cultured protocorms of Den-
drobiumcandidum . It has been found that nitrate (KNO3) promoted propagationof D. candidumprotocorms in suspension cul-
ture, fresh weight and dryweight of protocorms increased significantly ( P < 0.05) . However, ammonium ( (NH4 )2 SO4 ) only
stimulated significant increaseof freshweight of protocorms ( P < 0.05) , nitrateandammoniumwere not interrelatedfor biomass
of protocorms . Theresults demonstratethat 67-V mediumsupplemented with (NH4 )2 SO4 100 mg?L , KNO3 800mg?L , sucrose30
g?L and potato extract 200 g?L was best for the growth of protocorms . In addition, fourteen fungal elicitors did not significantly
influence biomass of suspension cultured protocorms of D. candidum ( P > 0.05) . However, compared with the content of po-
lysaccharides in thecontrol, theone in the protocorms of D. candidumelicited by fungi g6, g14 , g5 and g4 raised14% , 9% ,
6% and4% , respectively .Since D. candidumis a raremedicinal plant andpolysaccharides are important active components in
the plant, our results showgood application prospect for producing protocorms of D. candidumin suspension culture .
Key words : Orthogonal design; Randomined complete experimental design; Dendrobium candidum; Biomass; Polysac-
charide accumulation
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (1) : 105～109
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : sxguo2006 @yahoo. com. cn; Tel : 010 - 62829619
收稿日期 : 2007 - 05 - 19 , 2007 - 07 - 29 接受发表
作者简介 : 宋经元 (1969 - ) 男 , 副研究员 , 主要从事植物次生代谢的相关研究。 ?
基金项目 : 国家杰出青年科学基金资助项目 ( 30325047 ) ; 北京市科技新星计划 ( 2003A61)
铁皮 石斛 ( Dendrobium candidum Wall . ex
Lindl .) 是我国重要的药用植物之一 , 用其加工
的产品“铁皮枫斗晶”在国内外市场深受欢迎 ,
由于铁皮石斛生活环境特殊和自身繁殖困难 , 使
得其产量低、生长区域小、野生资源极其有限 ,
目前铁皮石斛已被列为濒危物种。通过细胞工程
技术生产铁皮石斛原球茎是解决铁皮石斛资源紧
缺、栽培困难等问题的有效途径 , 我们已经报道
了不同基本培养基对铁皮石斛原球茎生长的作
用 , 并研究了接种量与培养液体积对铁皮石斛原
球茎生长的作用 (宋经元等 , 2004 )。郁美娟等
(2003) 报道多糖类成分是石斛中具有免疫增强
作用和抗肿瘤作用的活性成分 , 常以多糖的含量
高低来判断某一石斛类药材质量的好坏。由于生
物和非生物因子 ( 刘晓琴等 , 2006; 赵春芳等 ,
2006) 在植物细胞培养生产次生产物时具有重要
的调控作用 , 特别是真菌诱导子往往可以大幅度
提高次生产物的含量 , 因而已获得广 泛应用
( Pitta-Alvarez 等 , 2000; Khosroushahi 等 , 2006;
Conceicao等 , 2006 ) , 并已深入到其作用机理的
研究 ( Alexander 等 , 1996; Sanchez-Sampedro 等 ,
2007) 。本文进一步研究氮源和真菌诱导子对铁
皮石斛原球茎生长和多糖积累的影响 , 为通过液
体培养大量生产铁皮石斛原球茎以及研究真菌诱
导子的作用机理奠定基础。
1 材料和方法
1 .1 植物材料
铁皮石斛 ( Dendrobium candidum Wall . ex Lindl .) 原
球茎于 1?2MS (大量元素减半 , 以下同此) + 30 g?L 蔗糖
+ 200 g?L 马铃薯提取汁的固体培养基上培养 30 d继代或
用作实验材料。
1 .2 真菌材料
真菌菌种保存于 (0～4)℃冰箱 , 于试管斜面上的原
始菌种共 14 种 , 均分离自兰科药用植物体内 , 编号 g1
～g15 (缺 g12)。
1 .3 试剂
基本培养液 : 67-V 培养液 (已含 100 mg?L (NH4 )2 SO4
和 800 mg?L KNO3 ) + 30 g?L 蔗糖 + 200 g?L 马铃薯提取汁 ,
KNO3 (分析纯) , (NH4 )2 SO4 (分析纯 )。真菌诱导子实验
中采用的培养基为基本培养液 + 100 mg?L (NH4 )2 SO4 + 800
mg?L KNO3 。麦麸培养基成分 : 麦麸 50 g?L 煮沸 30min, 四
层纱布过滤取滤液 + MgSO4 1 .5 g?L + D-葡萄糖 20 .0 g?L +
KH2 PO4 3.0 g?L (条形琼脂 12～15 g?L)。
1 .4 不同氮源影响的研究方法
以 67-V + 30 g?L 蔗糖 + 200 g?L 马铃薯提取汁为基本
培养液 , 利用正交设计研究硝态氮 (KNO3 ) 和铵态氮
(NH4 ) 2 SO4 两因素对原球茎生长的影响。每因素各取四
个水平 (表 1 , 考虑两因素的交互作用 )。选正交表 L16
(45 ) 安排实验 , 因为考虑没有空列作误差估计 , 应作重
复试验。为避免系统误差 , 做 1～16 号签两份 , 当实验
计划编订后 , 用抽签办法确定实验顺序 , 实验方案见表
1。采用 250 ml 三角瓶 , 每瓶加 50 ml 培养基 , 平均接种
量 : 2 547 mg?flask。培养条件 : (24± 1)℃ , 漫射光下 ,
摇床转速 120 r?min。培养 30 d收获 , 用吸水纸吸干培养物
表面水分 , 称取鲜重 , 晾干 , 称干重 , 计算极差 R 及 K
值 , 确定主要因子列及最佳组合 , 并采用 F 检验进行统
计分析 , 如果差异显著或极显著 , 则进一步采用 q检验
表 1 实验方案和结果
Table 1 Experimental scheme and results
处理编号
Treatment No .
A : (NH4 o) 2 SO4
( mg?L)
B : KNO3 b
( mg?L)
鲜重 Freshweight
I ( g?flask) I I (g?flask)
干重 Dry weight
I ( g?flask) II ( g?flask)
1 ?0 P0 5 O. 895 8 .709 0 . 818 0 z. 953
2 ?100 u200 ?8 O. 845 13 .106 1 . 059 1 z. 360
3 ?200 u400 ?10 b. 876 10 .510 1 . 198 1 z. 179
4 ?300 u800 ?11 b. 373 13 .057 1 . 161 1 z. 233
5 ?200 u800 ?11 b. 254 13 .825 1 . 248 1 z. 262
6 ?300 u400 ?9 O. 042 12 .034 1 . 050 1 z. 318
7 ?0 P200 ?7 O. 129 10 .445 0 . 943 1 z. 194
8 ?100 u0 5 O. 489 13 .334 0 . 750 1 z. 284
9 ?300 u200 ?11 b. 440 8 .475 1 . 177 1 z. 068
10 ?200 u0 8 O. 341 6 .989 0 . 994 0 z. 881
11 ?100 u800 ?12 b. 354 14 .976 1 . 331 1 z. 443
12 ?0 P400 ?7 O. 270 7 .386 1 . 021 0 z. 962
13 ?100 u400 ?13 b. 035 12 .338 1 . 256 1 z. 211
14 ?0 P800 ?8 O. 406 8 .415 1 . 050 1 z. 082
15 ?300 u0 5 O. 613 10 .011 0 . 711 1 z. 168
16 ?200 u200 ?10 b. 590 11 .384 1 . 146 1 z. 257
601 云 南 植 物 研 究 30 卷
(Newman-Keuls检验 ) 找出主要影响因素和最佳处理 , 结
果以“均值±标准差”表示。统计分析参考文献 (徐吉
民 , 1987 ; 南京农业大学 , 1989; 李春喜等 , 1997)。
1 .5 真菌诱导子的制备
原始菌种→转接到含麦麸培养基的平皿中→24℃ ,
暗培养 10～15 d→ 转至含麦麸培养基的液体培养基中
(250 ml 培养液?500 ml 三角瓶 , 每个菌种接 2 个 500 ml 三
角瓶 ) →24℃ , 暗培养 10 d左右→收获 , 培养液与培养
物一起匀浆 , 每个菌种分装 2 个 500 ml 三角瓶 , 121℃ ,
灭菌 30 min→置室内 (20℃左右 ) 阴凉干净处备用。
1 .6 真菌诱导子影响的研究方法
采用 250 ml 三角瓶 , 每瓶加入 100 ml 培养液 , 100 ml
培养液中含 10 ml 真菌诱导子作为处理 , 不含的作为对
照 , 共 14 个处理加 1 个对照。平均接种量 7 .5 g?flask。
重复 3 次 , 完全随机实验设计。在 120 r?min摇床上 , ( 24
±1)℃ , 漫射光下培养 30 d收获 , 称鲜重、干重。采用
F 检验进行统计分析 , 结果以“均值±标准差”表示。
1 .7 铁皮石斛原球茎多糖含量的分析
将所有干样品分别用研钵磨碎 , 混匀 , 每种处理的
样品称 5 .0 g, 用于测定多糖含量 , 采用苯酚法 (李满飞
等 , 1990)。
2 结果
2 .1 不同氮源对铁皮石斛原球茎生长的影响
收获时各处理的表观性状如下 : 处理 1、
15、16 浅绿色、淡黄色、生长良好 , 组织块较
致密 , 无分 化 ; 处 理 2、 3、6、 7、8、 9、10、
12、14 淡黄色 , 少量绿色 , 组织块较致密 , 无
分化 ; 处理 4、5、11、13 黄白色 , 浅绿色 , 组
织块较致密 , 无分化。该结果表明不同氮源对原
球茎分化和组织致密程度没有影响 , 但对原球茎
生长和颜色有较明显影响。
收获时各处理的鲜重和干重见表 2 , I、II 为
2 个重复。不同浓度的硝态氮 (以 KNO3 作代表 )
和铵态氮 ( 以 (NH4 )2 SO4 作代表 ) 对铁皮石斛
表 2 铵态氮对铁皮石斛原球茎生长的影响
Table 2 Effect of ammonium on protocorm growth
of Dendrobium candidum
( NH4 ?) 2 SO4
( mg?L)
Fresh weight
( g?flask)
Dry weight
( g?flask)
300 ?10 .131±2 .384 1 . 111±0 ?. 183
200 ?10 .471±2 .054 1 . 146±0 ?. 138
100 ?11 .685±3 .041 * 1 . 212±0 ?. 218
0 ?7 . 957±1 .358 1 . 003±0 ?. 112
n= 8 , x±s, q test, * P < 0 .05 compared with treatment 0
原球茎鲜重、干重影响的极差分析、 F 检验及多
重比较 ( q测验 ) 的结果如下 :
对鲜重进行极差分析的结果为 : RA?Re =
3 .1 , RB?Re= 3 .0 , RAXB?Re= 0 .8 ; 对干重进行极
差分析的 结果为 : RA?Re = 2 .5 , RB?Re = 3 .4 ,
RAXB?Re= 0 .5。无论鲜重还是干重 , 极差分析表
明 : 硝态氮和铵态氮均为主要影响因素 , 二者不
存在互作。故不考虑互作 , 最有利于鲜重和干重
增加的处理组合均为 100 mg?L ( NH4 )2 SO4 + 800
mg?L KNO3 ( 即 A2 B4 )。
对鲜重和干重进行 F 检验及多重比较 ( q
测验 ) 的结果表明 ( 表 2、表 3) , 对于鲜重 , 硝
态氮和铵态氮均具有显著性影响 , 二者不存在互
作 , 最佳组合为 : 100 mg?L ( NH4 )2 SO4 + 800 mg?
L KNO3 (即 A2 B4 ) ; 对于干重 , 硝态氮具有显著
性影响 , 铵态氮具有较明显的影响 , 二者不存在
互作 , 最佳组合为 : 100 mg?L ( NH4 )2 SO4 + 800
mg?L KNO3 ( 即 A2 B4 )。
故 F 检验与极差分析的结果完全一致 , 综
合对干鲜重的影响 , 选取的最佳处理组合为 :
100 mg?L (NH4 )2 SO4 + 800 mg?L KNO3 (即 A2 B4 )。
2 .2 真菌诱导子的获得
获得 14 种真菌的匀浆制备液 , 各匀浆液表
观性状如下 : g1、g3、g4、g6、g15 , 菌丝碎片与
液体分层明显 , 浅黄色 ; g2 , 菌丝碎片与液体分
层明显 , 红棕色 ; g5、g7 , 菌丝碎片与液体分层
不明显 , 白色 ; g8 , 菌丝碎片与液体分层一般 ,
白色 ; g9、g10、g11 , 菌丝碎片与液体分层明
显 , 浅红棕色 ; g13 , 菌丝碎片与液体分层一般 ,
黄色 ; g14 , 菌丝碎片与液体分层一般 , 浅灰色。
上述结果表明 14 种真菌经发酵后获得的匀浆液
在颜色和分层特性等表观性状方面具有多样性。
表 3 硝态氮对铁皮石斛原球茎生长的影响
Table 3 Effect of nitrateon protocorm growth
of Dendrobium candidum
KNO3
( mg?L)
Fresh weight
( g?flask)
Dry weight
( g?flask)
800 11 n. 708±2 y. 374 * 1 .226±0 .129 *
400 10 .311±2 .213 1 .149±0 .124 *
200 10 .177±1 .921 1 .151±0 .129 *
0 }8 {. 048±2 .687 0 . 945±0 . 200
n= 8 , x±s, q test, * P < 0 .05 compared with treatment 0
7011 期 宋经元等 : 氮源和真菌诱导子对铁皮石斛原球茎悬浮培养的影响
2 .3 真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影响
14 种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影
响见图 1 和图 2, F 检验的结果表明 , 14 种真菌
诱导子对原球茎生物量的增加 (鲜重与干重 ) 均
无显著性影响 ( P > 0.05 )。无论鲜重还是干重 ,
收获量排在前三位的是 : 对照 (CK )、g4 号真菌、
g11 号真菌。与对照 (CK ) 相比 , 所有真菌诱导
子对原球茎的生长均表现了不同程度的抑制作用。
2 .4 铁皮石斛原球茎多糖含量的分析
真菌诱导子对铁皮石斛样品多糖含量的影响
见图 3。结果表明 , g6 处理的铁皮石斛原球茎的
多糖含量最高 , 约 12 .0% , g14、g5 处理的铁皮
石斛原球茎的多糖含量分别为 11 .4%、11 .1% ,
高于 CK (10 .5% ) , g4 处理的铁皮石斛原球茎的
多糖含量 (10 .9% ) 则与 CK 相当 , 其它样品的
多糖含量均低于 CK , 其中 g2 处理的铁皮石斛原
球茎的多糖含量最低 , g11 处理的铁皮石斛原球
茎的多糖含量次低。
3 讨论
硝态氮和铵态氮不同浓度对植物细胞、组织
和器官生长、分化的影响 , 在许多植物上均有报
道 , 但对于石斛属植物 , 仅见 Lim等 (1992 ) 报
道光强、糖和 CO2 浓度对生长在琼脂培养基上
石斛小植株硝态氮和铵态氮吸收、生长、光合作
用活性的影响 : 优先吸收铵态氮超过硝态氮 , 硝
态氮的吸收相对较少 , 随光照增加其吸收量增加 ,
培养基中有糖时其吸收也增加 , 铵态氮吸收也受
光影响 , 而铵态氮和硝态氮吸收的比率变动不大。
当培养基中存在糖时小植株的鲜重增加 , 但其相
对生长率则有所下降 , CO2 浓度的增加不影响氮
的吸收和植株的生长。在培养中小植株的营养供
应主要是异养的。以前兰科植物的原球茎和小植
株也有类似报道 ( Hew 等 , 1988; Hew and Lim,
1989)。石斛是自然界中的附生兰 , 森林中石斛茎
的化学成分分析表明铵态氮是硝态氮的 40 倍
(Benzing, 1989)。兰根优先吸收铵态氮可以使石
斛充分利用在矿质少的附生生活环境中的营养。
但是 , 在本文的研究中发现铁皮石斛原球茎
需要硝态氮的浓度比铵态氮的浓度大 , 可能由于
图 1 培养 30 天后真菌诱导子对铁皮石斛原球茎鲜重的影响 CK: 未加诱导子处理的对照 ; g1-g15: 14 种真菌诱导子
Fig . 1 Effect of fungal elicitors on thegrowth of protocorm in Dendrobium candidum30 days after culture
CK : control without fungal elicitor; g1-g15: 14 types of fungal elicitors
图 2 培养 30 天后真菌诱导子对铁皮石斛原球茎干重的影响 CK: 未加诱导子处理的对照 ; g1-g15: 14 种真菌诱导子
Fig . 2 Effect of fungal elicitors on thegrowth of protocorm in Dendrobium candidum30 days after culture
CK : control without fungal elicitor; g1-g15: 14 types of fungal elicitors
801 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 3 培养 30 天后真菌诱导子对铁皮石斛原球茎中
多糖含量的影响 CK : 未加诱导子处理的对照 ;
g1-g15: 14 种真菌诱导子
Fig . 3 Effect of fungal elicitors on polysaccharides content in
protocorm of Dendrobium candidum30 days after culture
CK: control without fungal elicitor ; g1-g15: 14 types of fungal elicitors
液体悬浮培养的条件不同于固体培养的条件 , 更
不同于自然界附生兰生长的环境。比如 , 我们已
经证实培养在液体和固体培养基上的原球茎在形
态上和生理上均不相同 ( 宋经元等 , 2004 )。本
研究从对原球茎生长影响的角度 , 利用正交设计
研究了不同浓度的硝态氮和铵态氮对原球茎生物
量积累的作用 , 获得了最佳的浓度配方 , 对确定
生产工艺具有重要的指导意义。结果表明 , 硝态
氮和铵态氮不存在互作 , 即硝态氮和铵态氮的不
同比例对铁皮石斛原球茎生长不具有明显影响 ,
因此在今后的工作中可以对二者分别进行研究。
所选 14 种真菌及对照对铁皮石斛原球茎生
长 ( 鲜重和干重的增加 ) 无显著性影响 ( P >
0 .05) , 但与对照相比 , 14 种真菌表现了不同程
度的抑制作用。原球茎中多糖含量的分析表明 ,
不同真菌诱导子的影响不同 , 有的促进多糖产
生 , 有的抑制多糖的产生 , 为进一步筛选 , 尚需
进行收获样品 ( 干物质 ) 的生物活性研究。
本研究制备诱导子方法简便步骤少 , 成本低 ,
使用方便。制备获得的真菌诱导子 (如 g6) 明显
促进铁皮石斛原球茎培养产生多糖 , 将有利于在
大规模工业化生产中使用。继续研究有两个方向 :
一是研究此种诱导子的适宜浓度 , 加入时间与培
养物收获时间的最佳组合 , 为大规模培养工艺提
供依据; 二是筛选获得有用的诱导子之后 , 对诱
导子制备方法进行改变 , 以有利于机理研究。
〔参 考 文 献〕
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