全 文 ：文章编号:1008-9926(2008)04-0311-03　　中图分类号:R943　　　文献标识码:A
微波辅助提取竹叶柴胡总黄酮的正交实验筛选
王海宁① ,谢印芝② ,樊飞跃 ,刘培勋 ,龙　伟
(①中国医学科学院　放射医学研究所　天津　300192;②天津美伦医药集团　天津　300400)
摘　要:目的　利用微波辅助提取技术从竹叶柴胡中提取总黄酮。方法　考察了影响提取率的因素 , 包括提取溶剂 、物料粒
度 、微波时间 、功率 、固液比 、pH值 ,并采用正交实验设计进行优化。结果　确定了微波辅助提取竹叶柴胡总黄酮的最佳条件:
60%乙醇为提取溶剂 , 竹叶柴胡粒度为 120目以上 , pH值 7 ～ 8,按 1∶30的料液比 , 微波功率为 640W下辐照 3min.总黄酮提取
率约为 8.5%,与热回流提取 2h相比提取率多出 16.1%。结论　微波辅助提取不仅提取率高 , 而且提取时间大大缩短 , 是竹
叶柴胡中总黄酮快速高效的提取方法。
关键词:微波辅助提取;槲皮素;竹叶柴胡;正交实验设计;HPLC
MicrowaveExtractionofTotalFlavonoidsinHerbaBupleuribyOrthogonalTest
Method
WANGHai-Ning① , XIEYin-Zhi② , FANFei-Yue, LIUPei-Xun, LONGWei
(①InstituteofRadiafionMedicine, ChineseAcodemyofMedicalSciences, Tianjin　300192　China)
(②TianjinMeilunGroup, Tianjin　300400　China)
ABSTRACT:AimToextracttotalflavonoidsfromHerbaBupleuriusingmicrowave-assistedextraction.Methods
Factorsinfluencingtheextractionpercentagewereexamined, includingextractionsolvent, materialgradesize, mi-
crowavetimeandpower, solid-liquidratioandpH.Theorthogonalexperimentaldesignwasalsobeusedtooptimize
thecondition.ResultsTheoptimizedconditionsofmicrowave-assistedextractionwereasfolows:theextractionsol-
ventwas60% alcohol;thesamplewasabove120Meshed;pHwas7 ～ 8;solid-liquidwas1∶30;thepowerofextrac-
tionirradiationwas640Wandtheextractiontimewas3min.Theextractionyieldoftotalflavonoidswas8.5%,
16.1% higherthanthatofheatrecirculationof2hours.ConclusionMicrowave-assistedextractionisarapidandef-
ficientextractiontechniquefortotalflavonoidsinHerbaBupleuri.
KEYWORDS:Microwaveassistextraction;Totalflavonoids;BupleurummarginaturnWal.ExDC., HerbaBu-
pleuri;Orthogonolexperimentaldesign;HPLC
　　竹叶柴胡 (BupleurummarginaturnWal.Ex
DC.)为伞形科柴胡属植物 ,全草入药 ,性味苦寒 ,主
要分布于四川北部 、陕西南部 、湖北西部以及云南 、
贵州等省 ,为目前市场上药材柴胡的三大主要来源
之一[ 1] 。竹叶柴胡主要含黄酮类成分 ,黄酮类化合
物的提取主要有碱水提取 ,乙醇回流和索氏提取等
方法。微波提取是目前国内外正在研究开发的一种
新的提取技术。具有萃取时间短 、溶剂用量少 、提取
效率高和投资少等优点 ,近年来已成为提取天然植
物中活性成分的重要方法 。本文借助于微波提取这
种工艺方法 ,详细研究了竹叶柴胡中总黄酮的最佳
提取工艺条件 ,为竹叶柴胡的进一步深入开发利用
提供理论基础 。
1　仪器与试药
　　UV-3802型紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器
有限公司);LGMG-5520S微波炉(乐金电子天津电
器有限公司);MP200B型电子天平(上海精科天平
仪器厂);旋转蒸发仪 RE52-AA(上海亚荣生化仪器
厂);FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器
有限公司);芦丁对照品 (中国药品生物制品检定
所);竹叶柴胡 [购于成都药材市场 ,经天津中医药
大学中药鉴定教研室张丽娟副教授鉴定为竹叶柴胡
(BupleurummarginatumWal.ExDC.)]
·311·解放军药学学报　第 24卷第 4期　微波辅助提取竹叶柴胡总黄酮的正交实验筛选　　　　　　　　　王海宁　　
① 作者简介:王海宁(1985-),男 ,山东济宁人 ,在读硕士。研究方向:天然药物化学。 E-mail:hainingmessenger@hotmail.com
2　方法与结果
2.1　样品的处理方法　取竹叶柴胡粉碎 ,置于烘箱
中 60℃烘干 2h。称取一定量的粉末于三角瓶中 ,加
入一定量不同浓度的乙醇 ,搅匀 ,浸泡 ,将瓶口用保
鲜膜覆盖 ,放人微波炉中加热 ,取出滤过 ,滤液加溶
剂定容至 100ml,摇匀 ,为供试品溶液。
2.2　总黄酮含量的测定
2.2.1　标准曲线的制备　精密称取芦丁对照品 8mg
置 50ml量瓶中 ,加 70%乙醇溶解 ,定容 ,精密吸取
0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml,分别置 10ml量瓶中 ,加
5%亚硝酸钠溶液 0.3ml,放置 6min,再加 10%硝酸铝
溶液 0.3ml,摇匀 ,放置 6min,加 1mol·L-1NaOH4ml,
加水至刻度 ,摇匀 。放置 10min, 510nm处测吸收度 A
对浓度 C回归 ,得回归方程:
　　A=11.129C+0.007 1 , r=0.999 1
　　在 0 ～ 40μg·ml-1范围内 ,浓度与吸收度呈良好
的线性关系 。
2.2.2　样品含量的测定　取稀释至一定浓度的待
测液 1ml置 10ml量瓶中 ,同 2.2.1项下操作 ,在
510nm处测得吸收度。
　总黄酮含量(%)=(黄酮类化合物质量 /干物料质量)×100%
2.3　单因素实验
2.3.1　乙醇浓度对黄酮得率的影响　取干燥竹叶
粉末 2.0g(120目以上),置 150ml三角瓶中 ,按固液
比为 1∶20(g·ml-1)依次加入水 、30% 、50% 、60%、
70%乙醇浸泡 30min,选取微波功率为 320W的条件
下作用 2min。提取液滤过 、定容 ,并测定黄酮的含
量 ,结果表明随着乙醇浓度的增加 ,黄酮含量增加 ,
乙醇浓度为 60%时最大 ,进一步增大浓度 ,含量降
低 。究其原因 ,可能与黄酮类化合物的极性有关 ,因
为微波提取的选择性主要取决于目标物质和溶剂性
质的相似性;另外 ,提高乙醇浓度可以增加提取剂对
物料的渗透性 ,提高黄酮类的溶解度。但在使用微
波加热时 ,主要是物料中的极性分子尤其是水分子
吸收微波能 ,产生大量的热量 ,使物料升温 ,乙醇浓
度增加减小了料液中水的比例 ,会使料液升温减慢 ,
从而影响得率[ 3] 。
2.3.2　物料粒度对黄酮得率的影响　取干燥竹叶粉
末 2.0g,粒度分别为 24目以上 、24 ～ 50目 、50 ～ 80目 、
80 ～ 120目 、120目以上 ,置于 150ml三角瓶中 ,按固液
比为 1∶20依次加入 60%的乙醇浸泡 30min,选取微波
功率为 320W的条件下作用 2min。提取液滤过 、定容 ,
并测定黄酮的含量 ,结果表明物料粒度越小 ,黄酮得率
越高。随着粒度变小 ,比表面积增大 ,植物细胞 、组织
受破坏程度较大 ,从而利于有效成分的扩散 ,提取率逐
渐增大;而且粒度越小 ,细胞内容物和浸提剂接触面积
增加 ,从而提高黄酮的溶出速率。
2.3.3　微波时间对黄酮得率的影响　取干燥竹叶
粉末 2.0g(120目以上),置 150ml三角瓶中 ,按固液
比为 1∶20依次加入 60%的乙醇浸泡 30min,选取微
波功率为 320W的条件下分别作用 30s、1、 2、3、4、
5min。提取液滤过 、定容 ,并测定黄酮的含量 。结果
表明 3min时黄酮提取率达最大值 ,此后随着时间延
长 ,提取率逐渐减少 。可能是由于微波辐射在短时
间内 [ 4]对细胞膜的破碎作用比较大 ,溶出物多 ,所
以产率上升较快 ,而且黄酮类化合物的溶出 [ 5]需要
一定时间 。但长时间微波产生的强热效应对黄酮类
成分有破坏作用 ,因此 4min后黄酮得率不升反降;
而且时间越长 ,溶剂挥发越多 ,且可能发生暴沸。
2.3.4　微波功率对黄酮得率的影响　取干燥竹叶
粉末 2.0g(120目以上),置 150ml三角瓶中 ,按固液
比为 1∶20依次加入 60%的乙醇浸泡 30 min,分别
选取微波功率为 160、320、480、640、800W的条件下
作用 2min。提取液滤过 、定容 ,并测定黄酮的含量 ,
结果表明:当微波功率 <480W时 ,提取液总黄酮含
量随功率增大而升高 ,这可能是由于功率增大 ,加热
速率就增大 ,因此分子运动速度加快 ,摩擦增加 ,物
质的渗透 、扩散和溶解速度加快 ,有利于有效物质由
外层细胞转移到溶剂中;超过 480W后 ,提取液总黄
酮含量下降可能是强热效应对其产生了破坏作用 ,
同时溶剂挥发较多 ,溶解出的杂质增多 [ 5] 。
2.3.5　溶液 pH值对黄酮得率的影响　取干燥竹叶
粉末 2.0g(50 ～ 80目),置 150ml三角瓶中 ,按固液比为
1∶20依次加入 60%的乙醇 ,分别用 1mol·L-1柠檬酸或
1mol·L-1NaOH调节 pH值为 3 ～ 4、5 ～ 6、7 ～ 8、9 ～ 10、
11 ～ 12。浸泡 30min,选取微波功率 320W的条件下作
用 2min。提取液滤过 、定容 ,并测定黄酮的含量 ,结果
表明 pH7 ～ 8提取率最高。可能是因为黄酮类化合物
含有酚羟基 ,宜在碱性环境下提取;而碱浓度过高时 ,
加热条件下可以破坏黄酮类母核 ,提取率反而下降。
2.3.6　固液比对黄酮得率的影响　取干燥竹叶粉
末 2.0g(120目以上),置 150ml三角瓶中 ,分别按固
液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50依次加入 60%
的乙醇。浸泡 30min,选取微波功率为 320W的条件
下作用 2min。提取液滤过 、定容 ,并测定黄酮的含
量 ,结果表明固液比为 1∶40时黄酮得率最高 ,此后
随着固液比增高 ,得率下降。增加提取剂比例可以
·312· 　解放军药学学报　2008年 8月　第 24卷　第 4期　　　PharmJChinPLA　Vol24　 No8　Aug2008　　　　　
提高得率 ,其主要原因是溶液体积增大时 ,可以使槲
皮素从胀破的细胞里充分溶解出来 ,从而提高得率;
当料液比达到 1∶40后继续增加提取剂比例对得率
反而减少 ,原因可能是浸提剂对微波能的吸收增加 ,
导致细胞液对微波能吸收减少 ,细胞壁的破裂不完
全 ,总黄酮不能从细胞中充分溶出[ 6] 。
2.3.7　正交实验　根据单因素实验结果 ,为进一步
考察各因素影响的显著性 ,以及得出微波提取的最
佳工艺条件 ,以乙醇浓度 、微波功率 、微波时间和料
液比为试验因素 ,用 L9(34)进行四因素三水平正交
实验 ,结果见表 1。
表 1　正交设计因素水平表
Tab1　Listoffactorsandlevelsoftheorthogonaltest
水平
因 素
A乙醇浓度
(%)
B微波时间
(min)
C微波功率
(%)
D料液比
1 50 2 40 1∶20
2 60 3 60 1∶30
3 70 4 80 1∶40
表 2　正交试验设计与结果
Tab2　Designandresultsoftheorthogonalexperiment
实验号 A B C D 黄酮得率(%)
1 1 1 1 1 6.15
2 1 2 2 2 7.64
3 1 3 3 3 8.12
4 2 1 2 3 8.36
5 2 2 3 1 6.77
6 2 3 1 2 7.52
7 3 1 3 2 7.19
8 3 2 1 3 7.65
9 3 3 2 1 5.84
K1 7.303 7.233 7.107 6.253
K2 7.550 7.353 7.280 7.450
K3 6.893 7.160 7.360 8.043
R 0.657 0.193 0.253 1.790
表 3　方差分析
Tab3　Analysisofvariance
方差来源 偏差平方和 自由度 F P
A 0.660 2 11.579 >0.05
B 0.057 2 1.000 >0.05
C 0.101 2 1.772 >0.05
D 4.988 2 87.509 <0.05
误差 0.06 2
　　注:F0.05(2, 2)=19.00
　　由正交实验结果可以看出 ,影响因素 C>D>A
>B,其中 D为显著性因素(a=0.05),最佳方案为
A2B2C3D3。在此条件下 , 我们进行了 3批验证实
验 ,总黄酮提取率分别为达到 8.52%、 8.47%、
8.55%,平均提取率为 8.51%, RSD为 0.47%。
2.4　不同提取工艺槲皮素得率比较　将微波提取法
与传统提取法进行比较 ,结果见表 4。可以看出微波提
取与索式提取效果接近 ,比回流提取高出 16.1%。
表 4　不同提取工艺总黄酮得率比较
Tab4　Comparisonoftotalflavonoidsyieldbydiferentextractionmethod
提取方法 提取时间 提取溶剂 料液比 总黄酮得率(%)
乙醇回流 2h 60%乙醇 1∶30 7.53
索式提取 6h 甲醇 1∶30 8.74
微波提取 3min 60%乙醇 1∶30 8.55
3　讨论
3.1　试验中使用的是家用微波炉 ,不能对物料进行
长时间加热 ,因此只能采用间歇加热方式 [ 3] ,加热
一段时间要对料液降温 ,然后再补足加热时间 ,因此
提取温度不好控制 。由此产生的影响暂时还无法评
估。据报道 ,使用几个间断辐射的周期比连续辐射
效果要好 [ 7] , 但这还必须视具体的被萃取物质而
定[ 8] 。此外 ,采用间歇式加热方式劳动强度很大 ,
以后应多进行连续式加热方式的研究。
3.2　黄酮类化合物热稳定性差 ,在较高温度下易发
生分解氧化等反应而受到一定的破坏 ,因此 ,以后的
研究中应加强对提取温度的控制 。
3.3　竹叶柴胡总黄酮含量明显高于南柴胡 、北柴
胡 、银州柴胡 、秦岭柴胡 、烟台柴胡 [ 9] 。竹叶柴胡分
布广泛 ,易栽培 ,是一极为丰富的资源 ,有待继续对
其黄酮类成分作进一步研究 ,以扩大药源[ 10] 。
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(收稿日期:2007-11-11;修回日期:2008-05-22)
(本文编辑　梁爱君)
·313·　解放军药学学报　2008年 8月　第 24卷　第 4期　　　PharmJChinPLA　Vol24　 No8　Aug2008