全 文 ：起始密码子区域相关序列多态性的开发及
在苜蓿遗传多样性上的应用*
何庆元1,2, 李正鹏1, 吴摇 萍1, 杨红燕2, 王松华1**
(1 安徽科技学院生命科学学院, 安徽 凤阳摇 233100; 2 南京农业大学大豆研究所 国家大豆改良中心
作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏 南京摇 210095)
摘要: 目前广泛使用的基于 PCR基础的分子标记多为扩增非编码区域, 或是随机基因组中扩增, 在 QTL
定位中得到的位点一般与目标性状基因距离较远, 我们开发了一个新的基于启动子序列目的基因型分子标
记技术———启动子区域相关序列多态性 (SCRP), 试图使标记能够更为准确的反映不同品种的遗传基础。
它利用启动子位置保守一致序列 (“Kozak冶序列) 作为其上游引物, 利用内含子富含 “AATT冶 的特性, 作
为核心序列设计下游引物, 上下游引物均为 18 bp, 引物间通过组合配对的方式作为扩增引物对。 设计了
14 条上游引物和 10 条下游引物, 共 140 对引物组合, 对 34 个苜蓿品种进行扩增, 研究了 34 个苜蓿的遗
传多样性。 每个 PCR反应产生 3 ~ 16 个 50 ~ 2 000 bp的条带, 结果表明该标记简单、 可靠、 具有较高多态
性, 并且扩增区域为一种目的基因型分子标记, 在种质资源研究中具有重要价值。
关键词: 遗传多样性; 苜蓿; 起始密码子区域相关序列多态性
中图分类号: Q 75, Q 16摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)01-048-07
Start Codon Region鄄related Polymorphism (SCRP): A Novel
DNA Marker Technique for Assessing Genetic Diversity
in Alfalfa Germplasm Collections
HE Qing鄄Yuan1,2, LI Zheng鄄Peng1, WU Ping1, YANG Hong鄄Yan2, WANG Song鄄Hua1**
(1 Life Science College of Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China; 2 National Center for Soybean Improvement,
National Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract: Mostly PCR鄄based molecular markers amplified non鄄coding regions, or the whole genome randomly, the
locus is far away from the gene of targeted trait. We developed a novel marker technique called start codon region鄄re鄄
lated polymorphism (SCRP) aimed for the amplification of gene start condon regions. It is based on the use of two
primers of 18 nucleotides. The forward primer is designed from the targeted “Kozak冶 sequence; and the other prim鄄
er, the reverse primer is an arbitrary sequence with an AT鄄rich core to anneal with an intron. PCR amplification is
applied for the first 5 cycles with an annealing temperature of 35 益, followed by 35 cycles with an annealing tempe鄄
rature of 50 益 . In the present study, we utilized SCRP to study genetic diversity of 34 alfalfa cultivars (varieties) .
Each PCR reaction has generated as many as 3 to 16 fragments of 50 to 2 000 bp in size. The successful genetic di鄄
versity of 34 alfalfa cultivars by SCRP was achieved. This new technique should be useful in genotyping germplasm
collections and in tagging genes govern desirable agronomic traits of crop plants.
Key words: Genetic diversity; Medicago sativa; Start Codon Region鄄related Polymorphism
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (1): 48 ~ 54
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201312023
*
**
基金项目: 国家公益性行业 (农业) 科研专项 “绿肥作物生产与利用技术集成研究及示范冶 (201103005); 安徽省教育厅重点
项目 (KJ2011Z066); 安徽科技学院校级重点学科 (AKXK20102鄄1) 资助项目
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: shwang70@ yahoo. com. cn
收稿日期: 2012-02-17, 2012-09-13 接受发表
作者简介: 何庆元 (1978-) 男, 助理研究员, 在读博士, 主要从事豆科植物遗传育种研究。 E鄄mail: heqingyuan1@ 163. com
摇 遗传标记, 特别是分子标记已经广泛应用
于动物、 植物和微生物的遗传多样性评价和连锁
图谱或重要农艺性状的 QTL 定位研究 (Collard
等, 2005; 周荣等, 2010)。 自 Grodzicker 等 (1974)
开发出 RFLP标记以来, 已开发大量的基于 south鄄
ern杂交和 PCR技术手段的分子标记, 如 RAPD、
SSR和 AFLP等 (Williams等, 1990; Tautz, 1989;
Vos等, 1995)。 然而, 这些标记扩增的是非编
码区域或随机分布于基因组中, 标记位点一般与
目标性状基因距离较远, 导致 QTL 定位时, 分
子标记在应用上与其目标有一定的偏差。 随着结
构及功能基因组学的飞速发展, 基于目的基因开
发形成的目的基因标记和功能性分子标记成为一
类新型分子标记类型。
随着许多物种的基因组序列的公布, 这些数
据将为新型分子标记的开发奠定坚实的基础
(Holland 等, 2001)。 最近, 已经开发了许多基
于表达序列的分子标记, 能够缩短标记性状与基
因之间的距离, 如: SRAP、 SCoT、 EST 标记
(SSR鄄EST、 EST鄄RFLP)、 TRAP、 CORAP 等 (Li
和 Quiros, 2001; Collard 和 Mackiu, 2009; Hu 和
Vick, 2003; Wang 等, 2009)。 限制这些标记的
两个不利因素是高的经济成本和低的多态性, 如
SRAP只能标记 60%的表达序列 (Lu等, 2008)。
本研究以真核生物的起始密码子 ATG 为核
心序列, 以及启动子附近的保守序列设计上游引
物 (Kozak, 1984) 和以内含子富含 “AATT冶 序
列设计下游引物 (Joshi 等, 1997)。 该标记设计
以简单 PCR反应为基础, 上游是基因的 5忆端启
动子区域, 下游引物是内含子序列, 因此这种标
记扩增获得的片段是开放性阅读框的一部分, 具
有简单、 可靠、 更容易获得目标基因, 并且是共
显性的标记。
紫花苜蓿素有 “牧草之王冶 之称, 是世界
上栽培最广的牧草, 也是中国分布最广、 栽培历
史较长、 经营价值较高的豆科牧草。 其适应性广
泛, 饲料营养价值高, 具有较高的地上生物产量
(Michaud等, 1988)。 因其是多年生异花授粉同源
四倍体作物 (2n=4x=32), 由于自交不亲和性, 自
交严重衰退 (Armstrong, 1954; Busbice 和 Wilsie,
1966), 因此从个体到群体水平上苜蓿的遗传基础
都十分复杂, 具有丰富的遗传多样性。 从分子标记
研究苜蓿的遗传多样性能够为苜蓿育种提供理论指
导, 过去利用 SSR、 RAPD、 SCoT等分子技术研究
了苜蓿的遗传多样性 (Flajoulot 等, 2005; 毕玉芬
等, 2005; Vandemark 等, 2006; 何庆元等, 2011,
2012)。 本研究在开发新的标记技术基础上, 进一
步从基因组水平上系统考察了不同秋眠型的 34个
苜蓿品种的遗传多样性, 为明确不同品种间遗传
关系、 促进苜蓿合理引种及育种提供依据。
1摇 材料和方法
1. 1摇 植物材料
材料为 34 个苜蓿品种, 包括 32 个紫花苜蓿 (Medi鄄
cago sativa) 品种和 2 个南苜蓿 (M. hispida) 品种, 其
来源、 产地和秋眠型见表 1。
1. 2摇 引物设计
Kozak (1984) 和 Sawant 等 (1999) 研究表明在植
物的起始密码子有一段 AGCCACCATGGC 的保守序列,
根据这种保守序列, 以此段序列为核心序列, 在前面增
加 3 个 GCC的填充序列, 在后面加 3 个选择性的碱基设
计上游引物, 目的是锚定表达基因的启动子。 但如果仅
以此作为引物, 由于不同物种 “Kozak冶 序列具有一定
的差异, 不能得到非常好的多态性。 在此基础上, 依据
Li和 Quiros (2001) 的原则, 以内含子富含 “ AATT冶
的碱基 ( Lin 等, 1999) 为核心序列, 前面增加 11 个
GACTGCGTACG的填充序列, 后面为 3 个选择性碱基,
设计了 18 bp 的下游引物。 以上下游引物组成引物对,
分别进行扩增, 结合了启动子密码和内含子扩增产生较
好的多态, 引物序列见表 2。
1. 3摇 PCR和凝胶电泳
在 20 滋L 体系中含有 60 ng DNA 模板、 1. 4 滋L 25
mmol·L-1 Mg2+、 1. 0 U Taq 酶、 0. 15 mmol·L-1 dNTPs 和
0. 5 滋mol·L-1浓度的引物。 PCR反应程序为 94 益预变性
3 min, 然后 94 益变性 1 min、 35 益退火 1 min、 72 益延伸
1 min、 5个循环, 接着 94 益 1 min、 50 益 1 min、 72 益 1
min、 再进行 35个循环, 最后 72 益延伸 10 min, 4 益保
存。 扩增产物经 8%非变性丙烯酰胺凝胶电泳, 200 V 稳
压电泳 1. 5 h。 电泳结束后进行银染: 10%乙醇和 0. 5%冰
乙酸混合水溶液固定 12 ~ 15 min、 0. 2%的 AgNO3中染色
10 min、 蒸馏水漂洗 2 次, 置显影液 (16 g·L-1 NaOH,
甲醛 10. 8 mL·L-1) 中显影, 直至条带清晰为止。
1. 4摇 数据获取和分析
将34个苜蓿品种上扩增的条带转化为 “0冶 和 “1冶 数
字符, 同一位置有条带处以 “1冶 表示, 无条带以 “0冶 表
示, 将其转化为 “0冶 和 “1冶 数字符, 经 Nei 氏距离比较
每对引物的扩增的结果 (Nei 和 Li, 1979), 经 NTSYSpc2. 1
941 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 何庆元等: 起始密码子区域相关序列多态性的开发及在苜蓿遗传多样性上的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
软件进行相似性分析, 并利用非加权组平均法 (unweighted
pair group with mathematic average, UPGMA) 对所有供试
苜蓿品种进行聚类分析后, 将结果转化为树状图谱。
2摇 结果与分析
2. 1摇 引物筛选和多态性分析
对 140 对引物进行扩增结果表明, 77 对引
物在 34 个苜蓿品种上能扩增出有效片段, 选取
15 对扩增片段多、 亮度大、 重复性好的引物,
用于分子标记和遗传分析。 共得到 175 个标记位
点, 其中 150 个为多态性位点, 多态性频率达
85. 71% 。 不同引物能扩增出 4 ~ 16 个不同的位
点, 片段大小从 50 ~ 2 000 bp, 平均每对引物产
生 11. 7个位点, 不同引物的多态性频率有较大的
表 1摇 供试的苜蓿品种
Table 1摇 Alfalfa cultivars in this experiment
序号
No. 品种名 Cultivar
秋眠级数
FDR
来源
Origin
序号
No. 品种名 Cultivar
秋眠级数
FDR
来源
Origin
1 四季旺 Siriver 9 Australia 18 阿尔冈金 Algonguin 2 Canada
2 新疆大叶 Xinjiang big leaf 5 China 19 WL323 4 America
3 维多利亚 Victoria 6 Germany 20 Nso鄄33 7 America
4 南苜蓿 (安徽)Medicago polymorpha Linn. (Anhui) 1 China 21 超人 Superman 4 America
5 路宝 Lobo 5 America 22 Abacus 4 America
6 FGC鄄8201 4 America 23 Magna601 4 America
7 爱株+Z Abilene+Z 5 America 24 威拉 Vela 6 America
8 Quadrella 4 America 25 顶点 Dingdian 4 America
9 超级阿波罗 Superapolo 4 America 26 胜利者 Victory 4 America
10 特瑞 Terri 7 America 27 射手 Archer 4 America
11 新牧 1 号 XinmuNo. 1 1 China 28 苜蓿王 Alfaking 4 America
12 WL414 6 America 29 超级 13R 13R Supreme 8 America
13 Rampage 1 America 30 驯鹿 Ac. caribou 1 America
14 AC. Norolica 4 America 31 德国大叶 German big leaf unkown China
15 南苜蓿 (江苏)Medicago polymorpha Linn. (Jiangsu) 1 China 32 FGC鄄401 4 Australia
16 寒苜 1 号 Cold muNo. 1 1 Australia 33 德宝 Derby 4 America
17 金皇后 Golden Empress 3 America 34 猎人河 Hunter River 7 Australia
表 2摇 SCRP所设计的引物
Table 2摇 SCRP primer sequences
引物编号
Primer code
正向引物
Forward primers (5忆寅3忆)
引物编号
Primer code
反向引物
Reverse primers (5忆寅3忆)
F1 GCCAGCCACCATGGCATG R1 GACTGCGTACGAATTAAC
F2 GCCAGCCACCATGGCACT R2 GACTGCGTACGAATTACG
F3 GCCAGCCACCATGGCACG R3 GACTGCGTACGAATTAGC
F4 GCCAGCCACCATGGCACC R4 GACTGCGTACGAATTATG
F5 GCCAGCCACCATGGCACA R5 GACTGCGTACGAATTGAC
F6 CCCAGCCACCATGGCGCA R6 GACTGCGTACGAATTGCA
F7 CCCAGCCACCATGGCGAC R7 GACTGCGTACGAATTTAG
F8 CCAAGCCACCATGGCTGC R8 GACTGCGTACGAATTTGA
F9 CCAAGCCACCATGGCTAG R9 GACTGCGTACGAATTAAT
F10 CCAAGCCACCATGGCGCA R10 GACTGCGTACGAATTTGC
F11 GCCAGCCACCATGGCGAA
F12 GCCAGCCACCATGGCGAC
F13 GCCAGCCACCATGGCGAG
F14 GCCAGCCACCATGGCGAT
05摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
差异, 为 20. 0% ~100. 0% (表 3, 图 1, 2), 说
明 SCRP能够应用于遗传多样性分析。
表 3摇 15 对引物在 34 个苜蓿品种上扩增的结果
Table 3摇 Amplification results from 15 pair of primer
among thirty鄄four alfalfa cultivars
引物名称
Name
of the
primer
标记数
Number of
amplified
bands
多态数
Number of
polymorphic
bands
多态频率
Frequency of
polymorphic
bands / %
F9 -R2 9 9 100. 0
F4 -R3 12 7 58. 3
F1 -R3 10 10 100. 0
F3 -R4 4 4 100. 0
F9 -R5 12 12 100. 0
F6 -R5 14 14 100. 0
F3 -R5 12 12 100. 0
F7 -R6 13 3 23. 1
F8 -R7 12 12 100. 0
F5 -R7 10 2 20. 0
F2 -R7 15 15 100. 0
F8 -R9 10 10 100. 0
F1 -R9 16 15 93. 8
F9 -R10 15 15 100. 0
F13 -R10 11 10 90. 9
Total 175 150
Average 11. 7 10. 0 85. 7
2. 2摇 遗传多样性分析
遗传的一致性和遗传距离是衡量群体遗传多
样性的两个重要指标, Nso鄄33 和超人之间的相
似性最高, 相似系数达到 0. 92, 四季旺和来自
江苏的南苜蓿之间以及爱株+z和来自安徽的南苜
蓿之间的相似性最低, 相似系数为 0. 64。
34 个苜蓿品种的聚类分析结果见图 3。 从安
徽凤阳和江苏南京采集的野生南苜蓿在相似系数
0. 67 处单独聚为一类, 其余 32 个品种在相似系
数 0. 703 附近分为 3 个亚群。 第 1 亚群包括四季
旺和新疆大叶苜蓿 2 个品种, 第 3 亚群包括驯
鹿、 德国大叶 FGC鄄401, 德宝, 猎人河, 一共 5
个品种, 其余的 23 个品种都归为第 2 亚群。 并
且这些苜蓿品种的分类和地域来源没有太大的关
系, 同一地域来源的苜蓿品种被分别归到不同的
类型中, 说明育成的苜蓿品种材料来源较丰富,
不能用单一的地域来源来判断其亲缘关系。
3摇 讨论
3. 1摇 目的基因型分子标记开发
利用随机 DNA标记, 如 RAPD, SSR或 RFLP
标记进行遗传作图和QTL定位时, 经常发生标记和
基因或 QTL 间发生重组和交换, 导致标记和 QTL
间低的连锁水平 (Andersen 和 Lubberstedt, 2003)。
目的基因标记基于等位基因之间的差异开发而成,
主要是通过开放阅读框特征和利用 EST序列来开发
获得的一类标记。 一个标记位点可以代表一个特
定的基因, 甚至与某种特定农艺性状联系起来。
图 1摇 引物 F5 -R7在 34 份苜蓿品种上的扩增电泳图谱
图中各泳道电泳图为表 1 序号所对应样品的扩增产物, 下同
Fig. 1摇 The profile of amplification products of the primer pair F5 -R7 in 34 cultivars of alfalfa.
The profile of lane in figure is sample爷s amplification products of No. in table 1, as fellow
151 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 何庆元等: 起始密码子区域相关序列多态性的开发及在苜蓿遗传多样性上的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 引物 F5 -R6在 34 份苜蓿品种上的扩增电泳图谱
Fig. 2摇 The profile of amplification products of the primer pair F5 -R6 in 34 cultivars of alfalfa
图 3摇 34 个苜蓿品种的 SCRP分析聚类树状图。 图中编号为表 1 序号所对应的品种
Fig. 3摇 UPGMA dendrogram of 34 cultivars of alfalfa based on 175 SCRP bands using Nei鄄Li爷s genetic similarity coefficients
Corresponding to 1-34 cultivars in Table 1 respectively
摇 摇 SCRP技术的上游引物是锚定开放性阅读框
的启动密码子 ATG 区域, 下游引物是根据内含
子富含 “AATT冶 开发的一种新型目的基因型分
子标记, 这些序列在基因序列内部具有共通性,
25摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
即在启动子附近和内含子内这些碱基有很高的出
现频率 (Lin 等, 1999; Bevan 等, 1998)。 该标
记获得的扩增片段是一个完整开放性阅读框的部
分序列, 不同家系或基因型间产生的多态性反映
了该基因本身的差异。 因为它能够锚定到特定的
基因位置, 其 PCR 扩增获得的片段与表达基因
有密切的相关。 并且扩增的是启动子到内含子之
间的一段, 在扩增区域内, 基因内部大于 5 bp
的 indel的突变都可表现为产物的多态性。 因此
这种技术能够更好的鉴定遗传较为密切的不同物
种之间的亲缘关系。
3. 2摇 标记的稳定性
一般认为引物长度在 18 ~ 24 bp 时, PCR 具
有较高的稳定性 Gillings和 Holley (1997), TRAP
标记技术认为 18 bp 的引物设计具有更好的稳定
性 (Hu和 Vick, 2003)。 SCRP 上下游都采用 18
bp的引物, 因此认为它比 RAPD 等具有更高的
稳定性。 我们利用这种技术在大豆重组自交系中
进行检测, 同样获得了很高的稳定性。
以往的研究表明引物的长度和扩增的退火温
度是影响依赖 PCR 扩增的分子标记稳定性最重
要的因素。 退火温度是影响 PCR 扩增的重要因
素, SCRP扩增程序采用 SRAP 的扩增程序, 能
够保证起始阶段有一定的错配, 然后在较高的退
火温度 (50 益) 下保证扩增的稳定性。 我们也
试验了 CoRAP 的扩增程序, 但是扩增的结果并
不理想。 这种显著的不一致表明 PCR 扩增需要
选择合适的退火温度。
3. 3摇 SCRP的应用前景和优势
SCRP结合了 SRAP 和 ScoT 标记的优点, 是
一种简单、 有效和可靠的 DNA标记技术。 并且先
前无需知道基因序列, 具有快速简便的优点。 它
锚定的是 ATG启动子转录到下游内含子之间的一
段区域, 因此能够直接反映基因内部的多态性,
有望被广泛而高效地应用于高密度图谱的构建,
QTL检测, 基因定位以及分子标记辅助育种等。
利用新的 SCRP标记增加遗传图谱位点的数
目, 填补原有图谱在基因富集区的空缺, 促进连
锁图谱的加密, 进一步对目的基因进行加密, 提
高了基因精细定位的效率, 乃至图位克隆。 它也
可以在遗传资源的评价, 遗传多样性研究上发挥
重要的作用, 并且能更加合理的反映不同基因型
品种表达基因之间的遗传基础。
3. 4摇 苜蓿的遗传多样性
紫花苜蓿异花授粉的同源四倍体, 由于其自
交衰退严重, 品种的选育多以集团选择为主, 同
一个品种, 各个个体间是异质的, 是一个平衡群
体, 其同源四倍体特性, 进一步增加了其遗传的
复杂程度, 在一个杂合个体中, 每个等位基因都
存在有 4 个复等位基因, 因此不但在不同品种
间, 在同一品种内, 乃至一个自交系中都存在丰
富的遗传变异, 利用不同类型的分子标记对其进
行研究, 能够进一步了解其遗传基础, 为苜蓿育
种服务。
也参摇 考摇 文摇 献页
Andersen JR, Lubberstedt T, 2003. Functional markers in plants
[J] . Trends in Plant Science, 8 (11): 554—560
Armstrong JM, 1954. Cytological studies in alfalfa polyploids [ J] .
Canadina Journal of Botany, 32 (4): 531—542
Bevan M, Bancroft I, Bent E et al., 1998. Analysis of 1. 9 Mb of
contiguous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana
[J] . Nature, 391 (29): 485—488
Bi YF (毕玉芬), Che WG (车伟光), Li JR (李季蓉), 2005.
Genetic diversity analysis of weak鄄fall dormancy alfalfa [J] . Ac鄄
ta Agronomica Sinica (作物学报), 31 (5): 647—652
Busbice TH, Wilsie CP, 1966. Inbreeding depression and heterosis
in autotetraploids with application to Medicago sativa L [ J] .
Euphytica, 15 (1): 52—67
Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB et al., 2005. An introduc鄄
tion to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and mark鄄
er鄄assisted selection for crop improvement: the basic concepts
[J] . Euphytica, 142 (1-2): 169—196
Collard BCY, Mackill DJ, 2009. Start Codon Targeted (ScoT) poly鄄
morphism: a simple, novel DNA marker technique for generating
gene鄄targeted markers in plants [J] . Plant Molecular Biology Re鄄
porter, 27 (1): 86—93
Flajoulot S, Ronfort J, Baudouin P et al., 2005. Genetic diversity a鄄
mong alfalfa (Medicago sativa) cultivars coming from a breeding
program, using SSR markers [J] . Theoretical and Applied Genet鄄
ics, 111 (7): 1420—1429
Gillings M, Holley M, 1997. Amplification of anonymous DNA frag鄄
ments using pairs of long primers generates reproducible DNA fin鄄
gerprints that are sensitive to genetic variation [ J] . Electrophore鄄
sis, 18: 1512—1518
Grodzicker T, Anderson C, Sharp PA et al., 1974. Conditional le鄄
thal mutants of adenovirus 2鄄simian virus 40 hybrids 玉. host
range mutants of Ad2 + ND1 [ J ] . Journal of Virology, 6:
351 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 何庆元等: 起始密码子区域相关序列多态性的开发及在苜蓿遗传多样性上的应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
1237—1244
He QY (何庆元), Wu P (吴萍), Zhang XH (张晓红) et al.,
2011. A study on optimization and primer screening of a SRAP
reaction system and genetic diversity of different fall dormancy
alfalfas [J] . Acta Prataculturae Sinica (草业学报), 20 (2):
201—209
He QY (何庆元), Wang WB (王吴斌), Yang HY (杨红燕) et
al., 2012. Optimization of SCoT reaction system and genetic di鄄
versity of different fall dormancy alfalfa [J] . Acta Prataculturae
Sinica (草业学报), 21 (2): 133—140
Holland JB, Helland SJ, Sharopova N et al., 2001. Polymorphism of
PCR鄄based markers targeting exons, introns, promoter regions,
and SSRs in maize and introns and repeat sequences in oat [J] .
Genome, 44: 1065—1076
Hu JG, Vick BA, 2003. Target region amplification polymorphism
(TRAP): a novel marker technique for plant genotyping [ J] .
Plant Molecular Biology Reporter, 21 (9): 289—294
Joshi CP, Zhou H, Huang XQ et al., 1997. Context sequences of
translation initiation codon in plants [J] . Plant Molecular Biolo鄄
gy, 35 (6): 993—1001
Kozak M, 1984. Compilation and analysis of sequences upstream from
the translational start site in eukaryotic mRNAs [ J] . Nucleic
Acids Research, 12 (2): 857—872
Li G, Quiros CF, 2001. Sequence鄄related amplified polymorphism
(SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:
its application to mapping and gene tagging in Brassica [ J] .
Theoretical and Applied Genetics, 103 (2-3): 455—461
Lin XY, Kaul S, Rounsley S et al., 1999. Sequence and analysis of
chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana [ J] . Nature,
402: 761—768
Lu CR, Yu SX, Yu JW et al., 2008. Development and appraisement
of functional molecular marker: intron sequence amplified poly鄄
morphism (ISAP) [J] . Hereditas, 30 (9): 1207—1216
Michaud R, Lehman WF, Rumbauch MD, 1988. World distribution
and historical development [A]. In: Hanson AA, Barnes DK,
Hill RR ( eds.), Alfalfa and Alfalfa Improvement, Agronomy
Monograph Number 29 [M]. Madison, WI: ASA, CSSA, SS鄄
SA: 25—91
Nei M, Li WH, 1979. Mathematical model for studying genetic varia鄄
tion in terms of restriction endonucleases [J] . Proceeding of the
National Academy of Sciences USA, 76 (10): 5269—5273
Sawant SV, Singh PK, Gupta SK et al., 1999. Conserved nucleotide
sequences in highly expressed genes in plants [ J] . Journal of
Genetics, 78 (2): 123—131
Tautz D, 1989. Hypervariabflity of simple sequences as a general
source for polymorphic DNA markers [ J] . Nucleic Acids Re鄄
search, 17 (16): 6463—6471
Vandemark GJ, Ariss JJ, Bauchan GA et al., 2006. Estimating ge鄄
netic relationships among historical sources of alfalfa germplasm
and selected cultivars with sequence related amplified polymor鄄
phisms [J] . Euphytica, 152 (1): 9—16
Vos P, Hogers R, Bleeker M et al., 1995. AFLP: a new technique
for DNA finger printing [J] . Nucleic Acids Researchs, 23 (21):
4407—4414
Wang QH, Zhang BL, Lu QS, 2009. Conserved region amplification
polymorphism ( CoRAP), a novel marker technique for plant
genotyping in Salvia miltiorrhiza [J] . Plant Molecular Biology
Reporter, 27 (2): 139—143
Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ et al., 1990. DNA polymor鄄
phisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic mark鄄
ers [J] . Nucleic Acids Research, 18 (22): 6531—6535
Zhou R (周荣), Ren JJ (任吉君), Wang Y (王艳), 2010.
Taxonomy study by fingerprint of POD and PPO isozymes in
Brassica Vegetables [J] . Acta Scientiarum Naturalum Universi鄄
tatis Sunyatseni (中山大学学报) (自然科学版), 49 (4):
106—110
45摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷