全 文 ：ITS假基因对栎属系统学研究的影响及其对分子
系统学研究的启示*
马长乐1, 2 , 周浙昆1**
(1 中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明 650204;
2 中国科学院研究生院, 北京 100039)
摘要: 核糖体 rDNA ITS 是被子植物系统发育研究中应用最广泛的分子标记之一。以前人们认为同一物种
中的 ITS 序列因致同进化而使不同拷贝高度一致, 在分子系统学研究中常以 ITS1-518S- ITS2 序列作为构建
系统进化树的基础。近年来, 在对一些被子植物的研究中发现这段序列在同一物种中具有多态性, 有些拷
贝中的 518S 区不具编码功能, 人们把含有不具编码功能 518S 区的 ITS1-51 8S- ITS2 序列定义为 ITS 假基因序
列, 它对同源基因致同进化的假设形成了新的挑战。在诸多应用 ITS 序列重建系统进化关系的研究中, 栎
属系统学研究因 ITS 假基因的发现而倍受关注。本文以栎属为例回顾了 ITS 假基因的发现过程, 分析了其
对该属系统学研究的影响, 为分子生物学在植物系统进化研究中的应用提供一些新的参考。
关键词: ITS; 假基因; 栎属; 分子系统学
中图分类号: Q 75, Q 949 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2700( 2006) 02- 127- 06
Effect of ITS Pseudogene on the Phylogenetic Study of Quercus
( Fagaceae) and Its Revelation on the Plant
Molecular Phylogenetics
MA Chang-Le
1, 2
, ZHOU Zhe-Kun
1**
(1 Laboratory of Biodiversity and Biogeography , Kunming Insti tute of Botany , Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China;
2 Graduate School , Chinese Academy of Sci ences , Beijing 100039, China)
Abstract: Sequences of ITS in nrDNA is one of the widely used markers in angiosperm systematics. Many early reports of
ITS reg ion ( ITS 1, 518S and ITS 2) variation in flowering plants indicated that nrDNA arrays within individuals are homo-
geneous. However, recent studies have discovered that individuals often contain potentially non-functional nrDNA copies
( pseudogenes) . These findings suggest that complete concerted evolution should not be assumed when embarking on phylo-
genetic studies using nrDNA sequences. ITS pseudogene has been detected in the genus of Quercus L. and misled the
phylogenetic reconstruction, which made this genus frequently focused in the related studies. The authors take this genus
as an example to discuss the influence of the pseudogene on the phylogenetic study, conclude that combining application of
molecular evolution and classic taxonomy knowledge in plant systematics study may lead to more convincible results.
Key words: ITS; Pseudogene; Quercus ; Molecular phylogenetics
植物系统学以植物各类群之间的演化关系为
研究对象, 分子生物学与植物系统学相结合为植
物系统学研究带来了一次巨大的变革 ( Savolainen
and Chase, 2003)。大量的分子标记成为了研究
云 南 植 物 研 究 2006, 28 ( 2) : 127~ 132
Acta Botanica Yunnanica

*
** 通讯作者: Author for correspondence. E- mail: zhouzk@mail1kib1 ac1 cn
收稿日期: 2005- 01- 17, 2005- 09- 30接受发表
作者简介: 马长乐 ( 1976- ) 男, 博士研究生, 主要从事植物地理学与生物多样性方面的研究。
基金项目: 国家自然科学基金 ( 30540077) 和吴征镒先生 2001年云南省科学技术突出贡献奖资助自选项目 (KIB-WU-2001-01)
生物系统演化关系的重要依据 (邹喻苹等,
2001) , 分子技术和一些新的分析方法的引入也
为深入探索植物系统演化关系提供了可靠的基础
(Soltis等, 2000)。在众多的分子片段中核糖体
rDNA的转录间隔区 ( ITS) 序列已经成为了当前
被子植物系统学研究中最常用到的分子标记之一
(Alvarez and Wendl, 2003)。核糖体 rDNA 中的
18S、518S、28S基因序列是中度重复序列, 进化
缓慢而且相对保守, 但位于这 3个基因序列之间
的转录间隔区 ( ITS) 序列却进化的相当迅速。
以前, 一般认为因致同进化同一物种 ITS 序列的
不同拷贝高度一致 ( Bailey 等, 2003) , 在分子生
物学实验中又可以使用通用引物扩增得到 ITS1-
518S-ITS2的序列, 所以研究人员常以这段序列
作为构建进化树的基础。现在, ITS 序列已经成
为了研究较低分类群 (属间或种间) 系统关系的
重要标记 (田欣和李德铢, 2002)。
栎属 ( Quercus L. ) 是壳斗科中的一个大属,
在北半球有着广泛的自然分布, 具有重要的经济
价值 (Nixon, 1993) , 依据不同的分类系统该属
在全世界共有 300种 (陈焕镛和黄成就, 1998;
黄成就和张永田, 1999) 到 531种 ( Govaerts and
Frodin, 1998) , 此外对栎属所包括的种数还有一
些其它的观点 ( Lawrence, 1951; Elias, 1971)。
栎属有悠久的化石历史, 从第三纪起就是北半球
森林生态系统中的优势种和建群种, 已经成为了
植物系统演化、地史和全球气候变迁中的一个重
要研究对象 (周浙昆, 1992 a, b , 1993, 1999;
Manos等, 1999, 2001)。近年来, 曾有人基于栎
属植物叶器官形态结构特征进行分支分析 (普春
霞等, 2002) , 但分子系统学方法在栎属系统演
化研究中却发挥了重要的作用, 解决了许多传统
方法不易得到解答的问题。然而, 在应用 ITS序
列作为分子标记对栎属的系统学研究中发现该属
植物同一个体中的多个 ITS序列存在差异, 一部
分是假基因序列。这一发现成为了应用 ITS序列
做进化分析的一个新的挑战, 因为同源基因致同
进化的假设就不再成立, 相应的系统进化分析就
会因同一物种中多样化的序列类型而无法构建出
可靠的进化树 ( Bailey 等, 2003)。因栎属系统学
研究在 ITS 假基因发现过程中具有重要作用
(Alvarez and Wendel, 2003; Bailey 等, 2003) , 本
文以栎属为例回顾了 ITS假基因的发现过程, 为
分子生物学在植物系统进化研究中的应用提供一
些新的参考。
1 栎属中 ITS假基因的发现
Samuel等 ( 1998) 选择了 10 种栎属植物,
以核糖体 rDNA 的 ITS 序列为标记对该属的系统
进化关系进行了研究: 根据已知的 18SP26S序列
设计引物 ( Q1PQ2) 进行 PCR扩增, PCR产物胶
回收纯化后又对 Quercus ilex 和Fagus sylvatica 克
隆测序, 其它样品用 PCR产物直接测序, 测序
获得的序列与已发表的 ITS 序列相比对以确定间
隔区 ( ITS1PITS2) 与编码区 ( 518S)。Manos 等
(1999) 应用 ITS 作为分子标记对 25 个种, 包括
Samuel等 ( 1998) 所用的 8个种 (表 1) , 对壳斗
科的分子系统学进行了研究: 用 ITS4PITS5作为引
物, PCR产物直接用TA 克隆试剂盒克隆, 挑克隆
并用引物 ITS4PITS5进行PCR扩增检验, 在Biosys-
tems 373测序仪上测序, 测得的序列与已发表的被
子植物 ITS序列相比对, 确定间隔区 ( ITS1PITS2)
与编码区 ( 518S) , 还用 GPC 含量、序列长度、
序列的变异度以及信息位点的数量作为依据确定
所获序列为目的序列。两个研究组都获得了包括
ITS1、518S、ITS2的序列, 并用相同的方法构建
系统进化树, 分析得到的系统关系却有很大的不
同。Manos等 ( 1999) 认为造成这一结果的原因
是他们所用的技术方法不同。
表 1 Samuel ( 1998) 取样列表
Table 1 Sampled species in the study of Samuel (1998)
Outgroup Fagus sylvaica L. * Castanea sativa Miller*
Q1 suber L. Q1macrolepis Kotschy*
Q1 acutissima Carr. Q1 rubra L.
Ingroup Q1 virginiana Miller Q1 ilex L.
Q1 coccif era L. Q1 cerris L.
Q1 robur L. Q1petraea (Matt) . Liiebl . *
标有* 的种类为仅 Samuel (1998) 中有, 而在Manos (1999) 没有。
究竟是什么原因造成这样的不同呢? Mayol
and Rossello ( 2001) 对这两个研究组所得的序列
的长度、G+ C 含量、应用 MFOLD ( versions 213
和 310) 软件构建的RNA的二级结构的热动力学
稳定性进行了分析, 发现 Samuel等 ( 1998) 测得
的序列GC含量变异大, 在编码区 ( 518S) 长度
有变化, 碱基替代率高, 既使在高保守区情况也
128 云 南 植 物 研 究 28卷
是如此, RNA 二级结构稳定性较低, 表现出种
间差异大的特点, 认为他得到的是假基因序列。
而Manos等 ( 1999) 获得的序列经分析认为是功
能基因序列。Mayol and Rossello ( 2001) 认为造
成两者获得的序列不同的原因并不是因为不同的
实验方法造成的, 而是Samuel等 ( 1998) 试验得
到的是一个没有功能的平行进化的同源基因片
段, 即含有假基因的序列, 应用其得到的系统进
化分析结果不可靠。
Muir and SchlÊ tterer ( 1999) 对一份 Q1petraea
图 1 Quercus petraea和Quercus robur 的 70个不同的克隆的 ITS2和 518S序列构建的最大似然树 (Maximum- likel ihood tree) ;
以 Colombobalanus excelsa 和Trigonobalanus verticillata 作为外类群 (引自 Muir 等, 2001)
Fig. 1 Maximum-l ikelihood t ree of 70 combined 518S and ITS2 PCR clones from Quercus petraea and Quercus robur,
Colombobalanus excelsa and Trigonobalanus verticillata as the outgroup
1292期 马长乐等: ITS假基因对栎属系统学研究的影响及其对分子系统学研究的启示
材料用 PCR-clone 的方法实验得到了 518S ( 161
bp) 和 ITS2 ( 228 bp) 序列, 经过序列分析, 从
同一 PCR产物的 13个克隆中得到的序列可以分
为3种类型, 这就意味着在核仁组织区 ( Nucleo-
lus Organizer Regions, NORs) 有3种类型的 ITS序
列存在。在此之前 Zoldos等 ( 1999) 用荧光原位
杂交的方法确定了 Q1petraea 的 NORs 分布于不
同的染色体上。Muir等 ( 2001) 用在自然界中常
出现杂交的 Q1petraea 和 Q1robur 来研究 nrDNA
的演化, 发现这 2个种的 ITS2+ 518S序列都可以
分为3种类型 (图1) , 也就是一个具有 3种基因
类型的 nrDNA 家族, 其中只有 1 种序列类型的
518S区适用于系统进化分析。
由此可见, 无论是克隆测序或 PCR 产物测
序, 不同的研究者实验所得的相同物种的基因序
列因为有假基因的存在才出现差异, 因为假基因
与功能基因的进化速率不同, 不能反映真实的进
化速率 (至少是现在分子生物学的研究观点) , 所
以用假基因或包含有假基因的序列为依据构建的
系统进化树并不可靠, 这也正是 Samuel等 ( 1998)
与Manos等 ( 1999) 分析结果不同的原因。
2 ITS假基因的特性
在生命体漫长的演化进程中, 假基因不断的
产生、逐渐积累, 大量的假基因存在于动物、植
物、微生物中, 一般认为它们在进化上与正常的
功能基因相互关联。在基因的复制过程中, 基因
序列发生着不同形式的变化, 包括突变、片段的
漂移、插入、缺失等, 如果基因序列发生了剧烈
的变化而失去编码功能, 就成为假基因。大约
80%的假基因源自于逆转录, 另有 20%源自于
基因的复制 ( ISCID, 2004)。
因为 ITS1-518S-ITS2在一个或多个染色体位
点上的多个重复, rDNA 上基因位点在进化上易
发生变化, 造成了整个进化过程中并不是所有的
重复片段都具有功能, 其中的一部分退化成为假
基因 (Makalowski, 2000)。这些假基因并不会在
短时间内从基因组中消失, 虽然它们失去了转录
的功能, 却在多位点的致同进化中发生着变化。
这些假基因会存在于基因组的某个片段中, 或许
它们也以不同于功能基因的进化速率发生着独立
的变化 ( Bailey等, 2003)。nrDNA中 ITS假基因已
在被子植物的不同类群都有发现 ( Buckler 等,
1996; Yang 等, 1999; Kita and Ito, 2000; Mayol
and Rossello, 2001; Hartmannt等; Muir等, 2001)。
在对不同植物类群的 ITS假基因与功能基因对比
后发现它们的二级结构稳定性较低, 因去氨基过
程导致AT 含量增高, 在保守区内的碱基替代率
相对较高 ( Buckler 等, 1996; Alvarez and Wendel,
2003) , Bailey等 ( 2003) 已经对假基因的鉴别依
据与方法作了详细介绍, 本文就不再赘述了。
3 ITS序列在栎属系统学研究中的应用
尽管栎属 ITS序列存在假基因现象, 我们仍
然可以依据假基因的特性, 通过一定的实验设计
得到含有具有编码功能的 518S 区的 ITS1-518S-
ITS2序列。Manos 等 ( 1999) 综合了叶绿体 DNA
和 ITS序列的数据, 所得出的分支树清晰地分出
了 4个单系类群: ( Cerris-( Lobatae-( Protobalanus
+ Quercus sensu stricto ) ) ) , 这一结果与 Nixon
(1993) 依据形态数据的对栎属内的分类观点比
较, 其中的3个组的聚类是很吻合的, 只有 Cer-
ris group0 和 / Ilex group0 处于同一分支上而被
合并为Sect1Cerris。Manos and Standord ( 2001) 在
对壳斗科做系统进化研究时, 为避免假基因, 在
选择 ITS序列时遵从了以下的 3个原则: ( 1) 间
隔区 ( ITS1PITS2) 的差异最小和 518S 区的最大
的保守性; ( 2) 分支内部分异平均水平以及所有
样本的平均分异水平, 即每个分支内各序列的分
异以及所有样本的分异水平在一个适度的范围
内; ( 3) 经典的系统分类学知识, 同时还应用
BLAST 在 Genebank中与其它的 ITS 进行了比对,
将栎属 ITS序列提供的系统学信息与化石资料相
结合, 应用DIVA ( dispersa-l vicariance analysis) 分
析对栎属的分布模式研究表明: 栎属明显地分化
成为两支, 并与它们的地理分布相对应, 即新世
界分布和旧世界分布, 并且这两支在很早以前就
发生了间断, 随后分化成不同的种类, 其分布局
限于中纬度地区。他的研究结果与早先 Axelrod
(1983) 认为栎属中的主要类群是原衍生地独立
演化的观点相一致。
4 ITS假基因对分子系统学研究的启示
假基因在植物和动物分子系统学研究领域常
130 云 南 植 物 研 究 28卷
用的 nrDNA ( ITS) 和 mtDNA ( Zhang and Hewitt,
2003) 中的存在对分子进化研究产生了很大的影
响, 同时也给分子系统学研究带来了新的启示。
一方面, 随着分子生物学的深入发展, 人们通过
测序得到越来越多的基因序列, 并将它们保存在
Genebank中, 研究人员可以很容易地在 Genebank
中找到同源序列完成系统学分析中的序列比对、
引物设计等任务, 这样可以有效地避免将假基因
应用到系统学分析中。另一方面, 虽然一些单拷
贝的基因与 ITS相比同塑性指数不高, 但应用多
个单拷贝基因作为分子标记同样可以得到合理的
系统进化结果 ( Alvarez and Wendel, 2003)。对
nrDNA而言, 应用更多的 nrDNA序列 18S、26S、
IGS等序列进行统计、比较也可以得到可靠的结
果 ( Bailey 等, 2003)。栎属由于传统分类系统框
架不清晰, 其系统演化关系仍然是一个值得深入
研究的命题。在 Muir ( 2001) 的研究中选择了两
个分布于欧洲且两者种间杂交频繁的种, 它们都
是特例, 是不是只有少数种类或易杂交的种类才
会有 ITS假基因, 还是所有的栎属植物都有这一
特点还需要做进一步的研究。目前, 栎属的系统
学研究中已应用到的分子标记有核糖体 rDNA和
叶绿体 DNA中的几个片段, 在今后的研究中应
当尝试用更多的单拷贝的基因片段。另外, 从
ITS序列在栎属系统学研究的应用我们不难看出
分子系统学在植物系统进化研究中既有优势又有
不足, 优势在于可以利用分子标记提供的信息很
快地建立一个系统进化树以反映生物的系统进化
关系; 不足之处在于有些分子数据不具进化意
义, 不能提供有效的系统进化信息。有人曾探讨
过应用基因序列分类的可行性 ( Willem and Ferg-
uson, 2002) , 由 ITS 假基因的发现我们不难看
出, 应用单一的分子标记作为物种分类依据的风
险, 大量的实践已经证明传统的系统学理论在植
物系统进化研究中的重要作用, 只有二者的有机
结合应用才能获得更有说服力的结果。
那些不能表达成蛋白质的基因曾被人们认为
是存在于生物体内的 /分子化石0, 是生物在长
期的演化进程中产生的一些无用的基因片段。
Flam ( 1994) 认为这些基因也可能包含有一定的
信息, 只是人们并不完全知道这些基因真正的作
用。Makalowski ( 2000) 认为那些重复的无功能
的基因片段与和它们相邻近的基因相互作用而影
响着生物的进化。在后来的研究中, Hirotsune等
( 2003) 发现与Makorinl同源的假基因Makorin-l p1
能调控同源功能基因的表达。Lee ( 2003) 认为
演化是双向的, 一方面是在演化压力作用下, 从
已有的基因中产生新的基因; 但不完整的基因制
造过程也会产生有缺陷的基因片段, 这些基因片
段并没有永远失去作用, 相反的演化压力会赋予
它们新的任务。ITS 假基因是否也会有相似的作
用呢? 回答这一问题还需要做更多的研究。
1参 考 文 献2
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