全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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木豆叶提取物对 H2O2诱导的 H9c2细胞氧化损伤的保护作用及机制研究
孙 琳 1，柴 智 1*，张 涛 2
1. 山西中医学院，山西 晋中 030619
2. 山西省肿瘤医院，山西 太原 030000
摘 要：目的 研究木豆叶提取物（ECCL）对 H2O2诱导的 H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法 建立 H2O2
诱导的 H9c2细胞氧化损伤模型，于H2O2刺激前加入 PI3K信号通路阻断剂 LY294002（LY）预处理 10 min，加入 20、50 μg/mL
ECCL预处理 24 h。MTT法检测细胞存活率，比色法测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化
酶（SOD）的活性，Western blotting检测细胞内 p-Akt、p-eNOS蛋白表达。结果 与模型组比较，ECCL可明显增加 H9c2细
胞H2O2损伤后细胞存活率（P＜0.01），增加 SOD活力，降低MDA、LDH水平，增加 p-Akt和 p-eNOS蛋白表达（P＜0.05、
0.01），LY 可阻断 ECCL 对 H9c2 的上述作用。结论 ECCL 能够减轻 H2O2所致的 H9c2 细胞损伤，可能是通过激活 PI3K
通路促进其下游因子 Akt和 eNOS磷酸化发挥作用。
关键词：木豆叶提取物；H2O2；H9c2细胞；氧化应激损伤；PI3K
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)02 - 0297 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.019
Protective effects and mechanism of extract from Cajanus cajan leaves against
H2O2-induced oxidative injury on H9c2 cardiomyoblasts
SUN Lin1, CHAI Zhi1, ZHANG Tao2
1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China
2. Shanxi Tumor Hospital, Taiyuan 030000, China
Abstract: Objective To investigate the protective effects and mechanism of the extract from Cajanus cajan leaves (ECCL) against
H2O2-induced oxidative injury in H9c2 cardiomyoblasts. Methods A model of H2O2-induced injury in H9c2 cardiomyoblasts was
established. Cell viability was determined colorimetrically by MTT assay. The supernates and cells were collected, respectively, after the
different treatments for measuring the LDH, MDA, and SOD levels with the corresponding detection kit according to the manufacturer’s
instructions. Western blotting was performed to exam the expression of p-Akt and p-eNOS in H9c2 cells respectively. Results Compared
with H2O2 group, the cell viability was increased significantly in ECCL + H2O2 groups (P < 0.01). The activity of LDH in the culture
medium was decreased significantly (P < 0.05). The content of MDA in the culture medium was decreased significantly (P < 0.05). The
activity of SOD was increased significantly (P < 0.01). Treated with ECCL, the expressions of p-Akt and p-eNOS in H9c2 cells injured
from H2O2 were increased significantly (P < 0.01), When LY294002 (inhibitor of PI3K) was added, the effects of ECCL were cancelled.
Conclusion ECCL protects H9c2 cells against H2O2-induced oxidative injury partly through PI3K signaling pathway.
Key words: extract from Cajanus cajan leaves; H2O2; H9c2 cell; oxidative stress injury; PI3K

木豆Cajanus cajan (Linn.) Millsp系豆科木豆属
植物，木豆叶是海南省民间一种常用中药，具有清
热解毒、消肿止痛的功效，民间用于治疗外伤、烧
伤感染和褥疮等[1]。木豆叶中含有牡荆苷、异牡荆
苷、木犀草素等多种黄酮类成分[2]。有研究证实，
木豆叶中的主要成分牡荆苷能明显增强心肌细胞活
性，显著抑制由心肌缺血再灌注损伤引起的乳酸脱
氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）的释放[3]，改善缺

收稿日期：2015-07-11
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（81303262）；山西中医学院博士科研启动基金；山西中医学院方药药效及其作用机制研
究重点科技创新团队（20150401）
作者简介：孙 琳（1984—），女，博士，讲师。Tel: (0351)3179903 E-mail: sunlin115@aliyun.com
*通信作者 柴 智（1979—），男，博士，副教授。E-mail: chaizhi008@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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血心肌病理性损伤，对心肌缺血再灌注损伤具有保
护作用[4-5]。本实验利用 H2O2诱导H9c2细胞，建立
氧化损伤模型，应用木豆叶提取物（extract from
Cajanus cajan leaves，ECCL）进行干预治疗，并选用
PI3K途径作为研究对象，利用 PI3K通路特异性阻断
剂LY294002（LY），研究AECCL对H2O2诱导的H9c2
细胞氧化损伤的保护作用及其可能的作用机制。
1 材料
1.1 细胞
H9c2（2-1）大鼠成肌细胞系，由香港浸会大学
中医药学院惠赠。
1.2 药物与试剂
木豆叶提取物（购于广州中医药大学第一附属医
院，批号 091103，为木豆叶药材经蒸馏水回流提取 1
h所得浸膏，主要含牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素等
黄酮类成分，制成片剂，每片 0.25 g，每片含牡荆苷
0.08 mg）；H2O2（分析纯，天津市江天化学试剂厂）；
高糖DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司）；MTT
（Sigma公司，D-Hank’s液配制成 5 mg/mL溶液，4 ℃
避光保存）；LDH、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化
酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；p-Akt、
p-eNOS Polyclonal Antibody、PI3K inhibitor（LY）、
RIPA Buffer（CST公司）。
1.3 仪器
CO2 恒温培养箱（SANYO）；倒置显微镜
（OLYMPUS）；酶标仪、电泳仪、凝胶成像系统
（Bio-rad）；电泳槽、电转槽（上海天能科技有限公
司）；转移脱色摇床（江苏海门麒麟医用仪器厂）。
2 方法
2.1 细胞培养、分组及药物处理
H9c2细胞采用高糖DMEM培养基加 10%的胎
牛血清，置于 37 ℃的 CO2培养箱中培养。将 H9c2
细胞随机分为 5组：对照组，不加干预措施，正常
培养；模型组，培养液中加入终浓度为 200 μmol/L
的 H2O2培养 4 h；ECCL 高、低剂量组，于 H2O2
刺激前加入 20、50 μg/mL ECCL培养 24 h；LY组，
于 H2O2刺激前加入 LY（10 μmol/L）培养 10 min；
LY＋ECCL组，于 H2O2刺激前加入 LY（10 μmol/L）
培养 10 min，再加入 50 μg/mL ECCL 培养 24 h。
2.2 MTT法测定细胞存活率
细胞以（密度 1×105个/mL）接种于 96孔板，
培养于 5% CO2、37 ℃条件下培养 24 h。分组及药
物处理同“2.1”项，吸弃培养基，加入 MTT 溶液
20 μL 继续孵育 4 h，吸弃上清，加入 150 μL DMSO
溶解紫色结晶。每组设 5个复孔，平行设不加细胞
只加培养液的空白孔，比色时以空白孔调零，心肌
细胞存活率以 492 nm处吸光度（A）值表示。
2.3 MDA水平及 LDH、SOD活性的测定
细胞以（密度 1×105个/mL）接种于 96孔板，
培养 24 h。实验分为 5组：对照组、模型组、ECCL
（50 μg/mL）组、LY（10 μmol/L）组、LY＋ECCL
组，药物处理方法同“2.1”项。收集上清液，试剂
盒检测各组细胞培养液中MDA、LDH及SOD水平。
2.4 Western blotting 检测心肌细胞内 p-Akt、
p-eNOS蛋白表达
细胞以（密度 1×105个/mL）接种于 96孔板，
培养 24 h。分组及药物处理同“2.3”项。收集细胞，
在裂解缓冲液中裂解，冰浴下超声匀浆，冰上孵育
20 min，4 ℃、10 000 r/min离心 10 min，取上清液，
测定蛋白浓度，制成浓度相等的样品，取 20 μL 进行
聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转印至 PVDF膜，5%脱脂
奶粉封闭 2 h后分别滴加兔抗鼠 p-Akt、p-eNOS抗体
（1∶1 000）、GAPDH鼠抗鼠单克隆抗体（1∶1 000），
4 ℃孵育过夜。洗膜后以相应辣根过氧化物酶标记
的二抗室温孵育 2 h，显色，于凝胶自动成像分析系
统下成像，用 Quantity One分析软件、以 GAPDH为
内参对 p-Akt、p-eNOS进行灰度值半定量分析。
2.5 统计学处理
结果以 ±x s表示，数据采用 SPSS 16.0软件进
行统计学分析，正态性及方差齐性检验，各组采用
单因素方差（one-way ANOVA）分析。
3 结果
3.1 对 H2O2损伤 H9c2细胞存活率的影响
H2O2处理 H9c2细胞后其存活率较对照组下降
（P＜0.05）；ECCL组 H9c2 细胞存活率较模型组显
著升高（P＜0.01）；LY＋ECCL组存活率较 ECCL 50
μg/mL组明显下降（P＜0.05），说明LY减弱了ECCL
的保护作用，结果见图 1。
3.2 对MDA、LDH水平及 SOD活性的影响
H2O2处理 H9c2 细胞后其 SOD 活性较对照组显
著下降，MDA、LDH 水平显著增高（P＜0.01）；与
模型组比较，ECCL组 SOD活性显著增高（P＜0.05），
MDA、LDH 水平明显降低（P＜0.05、0.01）；LY＋
ECCL组与ECCL组比较，SOD活性显著下降，MDA、
LDH水平显著增高（P＜0.05、0.01）；LY组 SOD、
MDA、LDH水平与模型组差异不显著，见表 1。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：##P＜0.01；与 ECCL
50 μg·mL−1组比较：▲P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; ##P < 0.01 vs model group; ▲P < 0.05 vs
ECCL 50 μg·mL−1 group
图 1 LY对 ECCL增加H2O2损伤H9c2细胞存活率的影响
( x±s, n = 5)
Fig. 1 Effects of ECCL and LY294002 on viability of H9c2
cells injuried by H2O2 ( x±s, n = 5)
表 1 各组 H9c2细胞 SOD活性和MDA、LDH水平比较
( x±s, n = 5)
Table 1 Comparison on activities of SOD, and levels of
MDA and LDH in H9c2 cells ( x±s, n = 5)
组别 SOD/(U·L−1) MDA/(nmol·L−1) LDH/(U·L−1)
对照 138.48±28.39 1.53±0.45 149.06±28.63
模型 84.19±19.03** 3.92±0.63** 370.58±27.04**
ECCL 119.82±23.55# 1.91±0.58## 298.49±30.51#
LY 81.62±21.44 3.81±0.72 374.25±23.46
LY＋ECCL 83.12±21.95▲ 3.55±0.54▲▲ 368.85±24.37▲
与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；
与 ECCL组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01，下同
**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group;
▲P < 0.05 ▲▲P < 0.01 vs ECCL group, same as below
3.3 对 p-Akt、p-eNOS蛋白表达变化的影响
Western blotting 检测显示，与对照组比较，
H2O2处理使 p-Akt、p-eNOS 蛋白表达略有变化，
但变化不显著；与模型组比较，ECCL能够明显增
加 p-Akt和 p-eNOS蛋白水平（P＜0.01）；与 ECCL
组比较，加入 LY 后 p-Akt 和 p-eNOS蛋白表达显
著降低（P＜0.01），结果见图 2。
4 讨论
氧化应激（oxidative stress）是心肌损伤性疾病
的重要病理反应过程[6-7]。机体内主要的氧化剂是活
性氧（ROS），正常生理条件下，机体内 ROS的产
生和清除处于动态平衡状态。当机体处于氧化应激
状态时，细胞中的氧化还原平衡向氧化方向偏移，
导致体内组织细胞 ROS量升高，过量的 ROS可直
接发挥细胞毒性作用损伤细胞，导致机体产生氧化
应激损伤。H2O2是一种重要的 ROS，极易透过细胞
膜，导致一系列反应，由于其易于获得且性质相对
稳定，故已成为研究细胞氧化损伤的重要工具。
本实验通过H2O2损伤H9c2细胞建立氧化损伤
模型，结果表明，ECCL 可提高 H2O2损伤的 H9c2
细胞的存活率；降低 H2O2 损伤状态下 H9c2 细胞
MDA水平；使培养液中 LDH的漏出量减少；提高
培养液中 SOD 的活力。研究结果显示，对抗氧自
由基损伤可能是木豆叶心肌保护作用的机制之一。
PI3K 信号转导途径是细胞内重要的信号转导
通路，是促进抗细胞凋亡作用的重要调节因子。Akt
是 PI3K下游重要的靶蛋白，可经 PI3K/Akt信号途
径的磷酸化作用生成 p-Akt 而被激活，抵抗心肌细
胞的缺氧/复氧损伤[8]，而 PI3K抑制剂 LY能够抑制
这种作用[9]。
本研究应用LY阻断PI3K信号通路，结果发现，
AECCL作用 24 h后，能够上调 p-Akt和 p-eNOS的
表达，合用 LY组 p-Akt、p-eNOS蛋白的生成量减
少。以上结果说明木豆叶提取物的保护作用部分依
赖于 PI3K/Akt通路。



图 2 ECCL对 H2O2损伤的 H9c2细胞 p-Akt、p-eNOS表达的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 2 Effects of ECCL on p-Akt and p-eNOS expression of H9c2 cells injured by H2O2 ( x±s, n = 3)
p-Akt
p-eNOS
GAPDH


对照 模型 ECCL LY LY + ECCL
##
120
100
80
60
40
20
0

细
胞
存
活
率
/%

对照 模型 20 50 LY LY＋ECCL
ECCL/(μg∙mL−1)
* *
##
##
▲
p-
A
kt
/G
A
PD
H


2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0

▲▲


p-
eN
O
S/
G
A
PD
H


2.4
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0

##
▲▲


对照 模型 ECCL LY LY + ECCL 对照 模型 ECCL LY LY + ECCL
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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本实验制备 H9c2 细胞氧化应激模型，选用
PI3K 途径作为研究对象，应用特异性阻断剂 LY，
从细胞及分子水平观察木豆叶提取物的作用。研究
发现 H2O2 诱导心肌细胞损伤，木豆叶提取物逆转
其损伤，发挥保护作用；LY可以部分阻断木豆叶提
取物的保护作用，即 PI3K 通路为木豆叶提取物发
挥保护作用的途径之一，其机制可能通过活化的
PI3K，激活 Akt，进而上调并激活依赖 Akt的 eNOS
蛋白的表达，产生保护作用。
参考文献
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