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Identification of DNA barcoding in plants of Rehmannia Libosch. ex Fisch. et Mey. and origin of cultivated Rehmannia glutinosa

地黄属植物DNA条形码鉴定及地黄栽培起源研究



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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地黄属植物 DNA 条形码鉴定及地黄栽培起源研究
夏 至,王璐静,黄 勇, 李贺敏,张红瑞,高致明*
河南农业大学农学院,河南 郑州 450002
摘 要:目的 评价 DNA 条形码通用序列对地黄属植物 Rehmannia Libosch. ex Fisch. et Mey. 的鉴定作用,探讨中药地黄
R. glutinosa 的栽培起源。方法 对地黄属物种的 ITS、psbA-trnH、rbcL 和 matK 序列扩增和测序,比较各序列在种内和种间
变异。采用最近距离法、相似性搜索法、构建 Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果 对比地黄属
各种的 rbcL 和 matK 序列,结果显示 rbcL 序列完全一致,matK 序列同源性为 99.9%~100%。ITS 和 psbA-trnH 序列的平均
种间变异均大于平均种内变异,且 2 条序列的种间最小变异均大于种内最大变异。在 ITS 系统树上,地黄的所有样品与茄叶
地黄聚在一支,支持率为 96%;psbA-trnH 和联合树上,地黄的所有样品聚为一单系分支(支持率为 55%和 58%)。地黄与
茄叶地黄聚在的这一分支分别与裂叶地黄和高地黄聚在一支(在 ITS 和联合树上支持率为 55%和 68%),与裂叶地黄和天目
地黄聚在一支(在 psbA-trnH 树上支持率为 80%)。ITS 和联合树支持栽培地黄的 3 个品种与来源于河南温县、郑州、南阳
和北京野生地黄居群聚在一支,支持率为 51%和 69%。结论 叶绿体基因 rbcL 和 matK 不适合作为条形码对地黄属进行鉴
定,ITS 和 psbA-trnH 序列可以作为中药材地黄与同属近缘种进行鉴定的条形码序列。裂叶地黄和天目地黄可能是四倍体地
黄的 2 个亲本来源,栽培的地黄品种可能起源于河南温县区域的野生群体。
关键词:ITS;psbA-trnH;地黄;DNA 条形码;鉴定;起源
中图分类号:R282.12 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2016)04 - 0648 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.04.020
Identification of DNA barcoding in plants of Rehmannia Libosch. ex Fisch. et
Mey. and origin of cultivated Rehmannia glutinosa
XIA Zhi, WANG Lu-jing, HUANG Yong, LI He-min, ZHANG Hong-rui, GAO Zhi-ming
Agronomy College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Objective To evaluate the suitable candidate DNA barcoding of plants in Rehmannia Libosch. ex Fisch. et Mey., and
unravel the origin of cultivated R. glutinosa. Methods Nuclear DNA ITS and chloroplast gene psbA-trnH, rbcL, and matK sequences
of species in Rehmannia Libosch. ex Fisch. et Mey. were amplified and sequenced. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were
calculated. Identification analyses were performed using Nearest Distance, BLAST1, and Neighbor-Joining (NJ) methods. Results A
comparison on the sequences within species in Rehmannia Libosch. ex Fisch. et Mey. indicated that the rbcL sequences were identical,
the matK sequences were similar by 99.9%—100%. All inter-specific distances (ITS and psbA-trnH data) were far higher than all
intra-specific genetic distances. Minimum interspecific distance (ITS and psbA-trnH data) were higher than coalescent depth. The NJ
trees (ITS, psbA-trnH, and combined data) indicated that all population of R. glutinosa formed a monophyletic clade [Bootstrap (BS) =
96%, 55%, and 58%]. The clades including R. glutinosa and R. solanifolia were clustered with R. piasezkii and R. elata in ITS and
combined trees (BS = 55% and 68%), and clustered with R. piasezkii and R.chingii in psbA-trnH tree (BS = 80%). The NJ trees (ITS,
psbA-trnH, and combined data) supported that three cultivated varieties of R. glutinosa were clustered with wild populations from
Wenxian, Zhengzhou, Nanyang, and Beijing (BS = 51% and 69%). Conclusion Chloroplast genes rbcL and matK can not be used to
identify the medicinal plants of Rehmannia Libosch. ex Fisch. et Mey. ITS and psbA-trnH are two efficient barcodes for authentication
of R. glutinosa and its relative species. R. piasezkii and R. chingii may be as both parental species of tetraploid R. glutinosa.
Furthermore, it appears that native wild populations are involved in the origin of cultivated R. glutinosa in Wenxian county.
Key words: inter-transcibed spacer; psbA-trnH; Rehmannia glutinosa (Gaert.) Libosch. ex Fisch; DNA barcode; authentication; origin

收稿日期:2015-06-21
基金项目:国家自然科学基金河南联合基金项目(U1404302);河南省基础与前沿计划研究项目(152300410198)
作者简介:夏 至(1974—),男,河南固始人,副教授,博士,研究方向为中药资源的分子鉴定。
Tel/Fax: (0371)63554995 E-mail: xiazhiemail@126.com
*通信作者 高致明,教授,主要从事中药资源的规范化种植研究。E-mail: gaozhiming672@shou.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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玄参科(Scrophulariaceae)地黄属 Rehmannia
Libosch. ex Fisch. et Mey. 植物在我国有 6 种,全部
产于我国[1]。其中,中药材地黄来源于该属植物地
黄 Rehmannia glutinosa (Gaert.) Libosch. ex Fisch,全
国各地均有分布,在河南焦作地区广为栽培,是著
名的“四大怀药”之一[2]。《中国药典》2010 年版
中地黄以块根入药,药材分为鲜地黄、生地黄和熟
地黄,具有清热生津、凉血、止血;补血滋阴、益
精填髓等功效。用于热病伤阴、舌绛烦渴、温毒发
斑、吐血、衄血、咽喉肿痛、骨蒸劳热、肝肾阴虚,
腰膝酸软等症的治疗[3]。植物化学和药理学的研究
表明地黄属植物活性成分为环烯醚萜苷类化合物,
主要包括梓醇和毛蕊花糖苷等[3-4],具有降血糖、抗
炎、保肝、利尿和缓泻、调节免疫功能的作用[5],
临床应用十分广泛。作为河南栽培的主要药材品种,
野生和栽培的中药材地黄种内遗传变异显著,形态
上有较大差异,与同属近缘种类很难区分,从而影
响鉴定的准确性,造成传统鉴定困难[6]。此外,除
正品地黄外,同属的一些植物(如湖北地黄等)在
地方也作为中药材地黄入药[7],常有混淆现象,直
接影响临床用药的安全。而目前,对该属的鉴定研
究主要集中在形态性状和 RAPD(random amplified
phlymorphic DNA)分析等[8]。DNA 条形码鉴定仅
局限于对 ITS2 单条序列研究[9],缺乏对其他几个常
用 DNA 条形码候选序列 [intemal transcribed
spacer(ITS)、psbA-trnH、rbcL 和 matK] 在地黄
属鉴定作用的评价和分析,且没有在整个属的水
平取样,进行系统的鉴别分析。而在地黄属内,
中药材地黄和茄叶地黄均为四倍体(2n=56),而
其他种类均为二倍体(2n=28)[6]。目前,对于
四倍体地黄是否来源于该属其他二倍体种类的异
源或同源加倍后形成,尚不明确,且栽培地黄品
种起源也不清楚。
近年来,随着分子生物学的快速发展,DNA 条
形码技术(DNA barcoding)为中药材物种鉴定及中药
材物种的系统进化研究提供了方便快捷的方法[10]。
DNA 条形码技术是利用标准的、有足够变异的、易
扩增且相对较短的 DNA 片段对物种进行快速、准
确的自动鉴定,并通过构建中药材物种及其近缘种
类的亲缘关系,探讨中药材物种的系统演化及栽培
品种的起源[11]。目前,DNA 条形码鉴定研究广泛
应用于多个科属的药用植物及中药材鉴定[12-15]。因
此,本研究通过实验并结合 GenBank 数据库数据,
分析 ITS、psbA-trnH、rbcL 和 matK 4 条常用条形
码序列对地黄属物种的鉴别能力,以筛选能鉴别
地黄属药用植物的优选序列及为地黄属植物的分
子鉴定提供依据,并通过上述序列构建中药材地
黄及其近缘种类的亲缘关系,探讨中药材地黄的
栽培起源。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料的收集包括地黄属 5 个种共 13 个样
品,其中地黄栽培品种 3 个样品,地黄野生材料 6
个样品,地黄属其他种 4 个样品,实验材料由中国
科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验
室王印政研究员鉴定,凭证标本保存于中国科学院
植物研究所标本馆(PE)和河南农业大学。实验材
料来源于植物新鲜叶片,经硅胶快速干燥后保存于
−80 ℃冰箱,实验材料详细信息及 GenBank 登录号
见表 1。
1.2 方法
1.2.1 样品 DNA 的提取、扩增和测序 采用北京
天根生化植物 DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech
Co.,China)提取样品 DNA,ITS 序列扩增使用
Wendel 等[16]设计的引物 ITS1(5’-AGAAGTCGTA-
ACAAGGTTTCCGTA-3’)和 ITS4(5’-TCCTCCG-
CTTATTGATATGC-3’);psbA-trnH、rbcL 和 matK
序列扩增使用 DNA 条形码通用引物[17],引物由上
海生工生物技术服务有限公司合成。PCR 反应条件
及扩增程序参考 Xia 等[18]和陈士林等[17]的研究。
PCR 产物纯化后,用 ABI 3730X 测序仪(Applied
Biosystems Co.,美国)进行双向测序,测序结果在
GenBank 注册序列号(表 2)。
1.2.2 数据处理 测序所得的峰图采用 CodonCode
Aligner V3.0 软件(CodonCode Co.,美国)对序列
峰图进行校对拼接,去除引物区和低质量的序列,
同时,本研究从 GenBank 数据库中搜集并下载地黄
属 ITS、rbcL 和 matK 序列 49 条(表 2),整合处
理后结合样品序列分析。用 PAUP* version 4.0b10
( Florida State University , 美 国 ) 计 算 K2P
(Kimura-2-Parameter)距离,基于 K2P 模型进行遗
传距离分析,对不同序列种间、种内变异大小进行
比较。统计不同序列种间、种内遗传距离的分布频
度。利用软件 PAUP* version 4.0b10 构建邻接
(Neighbor-Joining,NJ)系统发育树,利用 Bootstrap
(BS,1 000 次重复)检验各分支的支持率。利用
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表 1 植物样品来源
Table 1 Origins of plant samples
GenBank 登录号 种名 凭证标本 采集地
ITS psbA-trnH rbcL matK
裂叶地黄 Rehmannia piasezkii XZ-2004-04-001 湖北宜昌 EF363670 KR424760 FJ172721 KR424746
湖北地黄 R. henryi XZ-2004-04-002 湖北兴山 EF363671 KR424761 FJ172722 KR424747
茄叶地黄 R. solanifolia XZ-2004-04-003 重庆城口 EF363672 KR424762 FJ172723 KR424748
天目地黄 R. chingii XZ-2004-04-004 浙江临安 EF363673 KR424763 FJ172724 KR424749
地黄 R. glutinosa XZ-2004-04-005 北京香山 EF363674 KR424764 FJ172725 KR424750
地黄(栽培金九) XZ-2013-06-jin9 河南温县 KR424730 KR424752 KR424766 KR424738
地黄(栽培北京 3 号) XZ-2013-06-bj3 河南温县 KR424731 KR424753 KR424767 KR424739
地黄(栽培 85-5) XZ-2013-06-85-5 河南温县 KR424732 KR424754 KR424768 KR424740
地黄 XZ-2013-05-DH1 河南洛阳 KR424733 KR424755 KR424769 KR424741
地黄 XZ-2013-09-DH2 河南林州 KR424734 KR424756 KR424770 KR424742
地黄 XZ-2014-05-DH3 河南南阳 KR424735 KR424757 KR424771 KR424743
地黄 XZ-2013-06-DH4 河南温县 KR424736 KR424758 KR424772 KR424744
地黄 XZ-2008-05-DH5 河南郑州 KR424737 KR424759 KR424773 KR424745
崖白菜 Triaenophora rupestris XZ-2004-04-009 湖北兴山 EF363675 KR424765 FJ172726 KR424751
表 2 GenBank 序列来源序列号
Table 2 Accession numbers of GenBank database
基因序列 种名 GenBank 登录号
ITS 地黄 DQ069312、FJ770249、FJ770248、FJ770247、FJ770246、FJ770244、FJ770245、FJ770243、
FJ770242、FJ770241、FJ770240、FJ770239、FJ770238、FJ770237、FJ770236、FJ770235、
FJ770234、FJ770233、FJ770232、FJ770231、FJ770230、FJ770229、FJ770228、FJ770227、
FJ770226、FJ770225、FJ770224、FJ770223、FJ770222、FJ770221、FJ770220、FJ770218、
EU810386、EU810385、EU810384、EU810383、EU787018、EU787017、EU592019、FJ980430
湖北地黄 DQ272447
裂叶地黄 DQ069316
茄叶地黄 DQ069314
高地黄 DQ069315
天目地黄 DQ069313
rbcL 高地黄 HQ384874
地黄 GQ436719
matK 高地黄 HQ384505
地黄 GQ434277

相似性搜索( BLAST1 )、最近距离( Nearest
Distance)、构建 NJ 系统发育树等方法评价各序列
对地黄属的鉴定作用,并构建中药材地黄及其近缘
种类的系统发育关系。
2 结果与分析
2.1 不同 DNA 条形码的序列信息、种内种间差异
分析
本研究中地黄属叶绿体基因 matK 序列有 6 个
种,中药材地黄取样个体为 10 个,3 个栽培品种,
7 个野生种(包括来源于 GenBank 1 个样品),共计
15 条序列,matK 序列的扩增和测序成功率均为
100%。序列对比发现,matK 序列在地黄属内非常
保守,序列同源性为 99.9%~100%。所有序列长度
为 820 bp,6 个种 15 条序列,仅出现 2 个位点的差
异,分别为湖北地黄在 572 个位点发生 T 到 G 的颠
换,和高地黄在 660 个位点发生 G 到 T 的颠换,其
余种类茄叶地黄、裂叶地黄、天目地黄与地黄的野
生和栽培种类的 matK 序列同源性为 100%。同样,
叶绿体基因 rbcL 在地黄属内也极为保守,本实验取
样的 6 个物种,中药材地黄取样个体为 10 个,包括
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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3 个栽培品种,7 个野生种(包括来源于 GenBank 1
个样品),共计 15 条序列,rbcL 序列的扩增和测序
成功率均为 100%。所有序列的同源性均为 100%。
这表明,进化速率较慢的这 2 个国际通用叶绿体基
因的DNA条形码序列不适合地黄属内的种间鉴定,
因此,在后面分析直接舍弃这 2 条序列。
地黄属 ITS 序列有 6 个种,取样的中药材地黄
取样个体为 9 个,3 个栽培品种,6 个野生种,
GenBank 下载地黄物种 40 条序列,共计 49 条序列,
高地黄 1 个样品,其余 4 个种均为 2 个样品。中药
材地黄及其近缘种类的 6 个物种的 ITS 序列长度变
异范围为 613~615 bp。其中 ITS1 序列长度变异范
围为 223~224 bp,5.8 S 区域长度为 164 bp,6 个
物种序列完全一致。ITS2 序列长度变异范围为
224~227 bp。在 ITS 序列的矩阵中,本研究取样的
地黄实验样品的 3 个栽培品种,6 个野生种的 ITS
序列比对发现,仅河南林州采集的样品在 162 位点
处出现一个由 C 到 A 的颠换,结合 GenBank 的序
列,发现地黄属内各种间 ITS 序列具有丰富的变异。
地黄属叶绿体基因 psbA-trnH 序列有 5 个种,中药
材地黄 9 个样品包括 3 个栽培品种,6 个野生种,
其余 4 个种均为 1 个样品。在 psbA-trnH 序列的矩
阵中,裂叶地黄和天目地黄的 psbA-trnH 序列最长
为 516 bp,湖北地黄最短为 438 bp。湖北地黄对比
其他种序列,在 79 个位点有 1 个 T 到 G 的转换,
165 位点处有 1 个 G 到 T 的转换,在 200 和 459 位
点各有 1 个碱基的缺失,在 223~299 位点处有 77
个碱基的大范围缺失。茄叶地黄对比其他种序列,
在第 200 位点处有 1 个碱基的缺失,在 232~236
位点处、286~290 位点处,各有 5 个碱基的缺失。
中药材地黄种内,psbA-trnH 序列共有 4 个单倍型,
河南温县栽培品种(金九、北京 3 号、85-5)3 个
样品与来源于河南温县、郑州和南阳野生地黄的
psbA-trnH 序列同源性为 100%,序列长度为 502 bp,
共享 1 个单倍型。其余 3 个单倍型来源于北京、洛
阳和林州的野生地黄样品。
种内种间差异是分析 DNA 条形码序列的重要
指标。理想的条形码序列具有较大的种间变异、较
小的种内变异,以便准确鉴别同属不同种的物种。
本研究从平均种间变异、种间最小变异、平均种内
变异、种内最大变异分析 ITS 和 psbA-trnH 序列的
种内种间差异(表 3)。结果表明,ITS 和 psbA-trnH
序列的平均种间变异(0.017 96 和 0.005 15)均大于
表 3 不同 DNA 条形码序列的种内和种间的变异分析
Table 3 Analysis on intra- and inter-specific variation of
different DNA barcodes
基因片段 ITS psbA-trnH
种内最大变异 0.003 64±0.008 15 0.000 81±0.001 82
平均种内变异 0.006 12±0.003 64 0.001 24±0.001 62
种间最小变异 0.004 93±0.005 11 0.001 71±0.001 89
平均种间变异 0.017 96±0.007 98 0.005 15±0.002 75

平均种内变异(0.006 12 和 0.001 24),且 2 条序列
的种间最小变异(0.004 93 和 0.001 71)均大于种内
最大变异(0.003 64 和 0.000 81)。因此,ITS 和
psbA-trnH 序列是鉴别中药材地黄及同属近缘种比
较理想的条形码序列。
2.2 地黄属 DNA 条形码序列的鉴定分析
应用 BLAST1 对地黄属种类进行鉴定分析,结
果表明 ITS 和 psbA-trnH 序列可以准确鉴别中药材
地黄与其同属近缘种类。应用 PAUP* version 4.0b10
软件构建中药材地黄与其同属近缘种类的 ITS 和
psbA-trnH 序列的 NJ 系统发育树(图 1、2),外类
群选择与地黄属近缘的崖白菜属。在 ITS 序列构建
的分子系统树上(图 1),中药材地黄的 49 个样品与
茄叶地黄的 2 个样品聚为一单系分支,支持率 96%,
其中,茄叶地黄的 2 个样品聚为一单系分支,支持
率为 63%,这表明地黄与茄叶地黄亲缘关系较近。
高地黄与裂叶地黄聚为一单系分支,支持率为
100%,湖北地黄和天目地黄的 2 个个体均各自聚为
一单系分支,支持率为 100%和 69%。ITS 序列构建
的NJ树可以将中药材地黄与除茄叶地黄外的其他地
黄属种类很好区分开。
在 psbA-trnH 序列构建的分子系统树上(图 2),
中药材地黄的 9 个样本单独聚为一单系,支持率为
55%,可以很好地与地黄属其他种类区分开,其中
来源于洛阳和林州 2 个野生居群聚为一单系分支,
支持率为 66%,其余 3 个栽培品种与来源于河南温
县、河南郑州、南阳和北京野生地黄居群聚在一支,
支持率为 51%。与 ITS 系统树一致的是茄叶地黄与
地黄聚在一起,支持率为 55%,支持二者亲缘关系
较近。与 ITS 系统树不同的是在 ITS 系统树上,地
黄与茄叶地黄二者构成的单系分支,与裂叶地黄和
高地黄构成的单系分支聚在一起,支持率为 55%,
但在 psbA-trnH 系统树上,地黄、茄叶地黄二者构
成的单系分支,与裂叶地黄和天目地黄构成的单系
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分支上部数值表示NJ分析的BS分析对该分支的支持强度(>50%),
下同
BS values of NJ (> 50%) are shown above and below branches, same
as below
图 1 基于 NJ 法 (ITS 序列) 构建系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic tree constructed based on NJ methods (ITS data)
分支聚在一起,支持率为 80%。依据 ITS 和
psbA-trnH 序列构建的分子系统树可将中药材地黄
与其同属近缘种类明显地区分开。
在 ITS 和 psbA-trnH 序列联合构建的分子系统
树上(图 3),中药材地黄的 9 个样本单独聚为一单
系,支持率为 58%,其中来源于河南洛阳和林州 2
个野生居群聚为一单系分支,支持率为 52%,其余
3 个栽培品种与来源于河南温县、郑州、南阳和北
京野生地黄居群聚在一支,支持率为 69%。与 ITS
和 psbA-trnH 系统树一致的是,茄叶地黄与地黄聚

图 2 基于 NJ 法 (psbA-trnH 数据) 构建系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on NJ methods
(psbA-trnH data)

图 3 基于 NJ 法 (ITS 和 psbA-trnH 联合数据) 构建系统
发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree constructed based on NJ method
(combined ITS and psbA-trnH data)
在一起,支持率为 99%,支持二者亲缘关系较近。
ITS 和 psbA-trnH 序列联合构建的分子系统树支持
地黄,茄叶地黄二者构成的单系分支,与裂叶地黄
构成的单系分支聚在一起,支持率为 68%,随后与
天目地黄聚在一起,支持率为 82%。
3 讨论
3.1 基于 DNA 条形码序列对地黄属分子鉴定评价
本研究通过对国际通用的 DNA 条形码候选序
列对比分析发现,虽然叶绿体基因 matK 和 rbcL 在
地黄属扩增和测序成功率均能达到 100%,但这 2
个基因序列在该属内极度保守,进化速率较慢,种
地黄 FJ770244
地黄 FJ770247
地黄 FJ770226
茄叶地黄 EF363672
茄叶地黄 DQ069314
地黄 FJ770230
地黄 EU810385
地黄 FJ770239
地黄 FJ770232
地黄 FJ770227
地黄 FJ770221
地黄 KR424733
地黄 FJ770228
地黄 FJ770220
地黄 FJ770234
地黄 FJ770248
地黄 FJ770240
地黄 FJ770246
地黄 FJ770233
地黄 EU810384
地黄 EU787017
地黄 EF363674
地黄 FJ770249
地黄 FJ770242
地黄 DQ069312
地黄 FJ770223
地黄 FJ770231
地黄 EU810386
地黄 FJ770235
地黄 FJ770229
地黄 FJ770236
地黄 FJ770245
地黄 EU810383
地黄 FJ770225
地黄 FJ770243
地黄 EU787018
地黄 FJ770218
地黄 EU592019
地黄 FJ770222
地黄 FJ770238
地黄 FJ770224
地黄 FJ770241
地黄 FJ770237
地黄 FJ980430
地黄 栽培‘北京三号’KR424731
地黄 栽培‘85-5’KR424732
地黄 栽培‘金九’KR424730
地黄 KR424735
地黄 KR424734
地黄 KR424736
地黄 KR424737
高地黄 DQ069315
裂叶地黄 DQ069316
裂叶地黄 EF363670
湖北地黄 DQ272447
湖北地黄 EF363671
天目地黄 DQ069313
天目地黄 EF3636735
崖白菜 EF363675
地黄 KR424757
地黄 栽培‘金九’KR424752
地黄 栽培‘北京三号’KR424753
地黄 KR424746
地黄 栽培‘85-5’KR424754
地黄 KR424758
地黄 KR424759
地黄 KR424755
地黄 KR424756
茄叶地黄 KR424762
裂叶地黄 KR424760
天目地黄 KR424763
湖北地黄 KR424761
崖白菜 KR424765 96
55
59
100
100
80
55
55
51
82
68
99
58
69
地黄(南阳)
地黄(北京)
地黄栽培‘金九’
地黄栽培‘北京三号’
地黄(温县)
地黄(郑州)
地黄栽培‘85-5’
地黄(林州)
地黄(洛阳)
茄叶地黄
裂叶地黄
天目地黄
湖北地黄
崖白菜
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 4 期 2016 年 2 月

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间差异极小或没有差异,不适合作为 DNA 条形码
序列对该属属下种类进行分子鉴定研究。本研究对
地黄属进行全面取样,研究结果发现核基因片段
ITS(包括 ITS2)和叶绿体基因 psbA-trnH 在该属
内不仅扩增和测序成功率均能达到 100%,且这 2
条序列在地黄属内存在丰富的变异,支持陈士林
等[19]认为核基因 ITS2 的片段可以作为《中国药典》
2015 年版中药材地黄种内部分居群间的分子鉴定
的 DNA 条形码序列。基于 ITS 和叶绿体基因
psbA-trnH 序列对地黄属种间和种内的变异分析
表明,ITS 和 psbA-trnH 序列的平均种间变异均大
于平均种内变异,且 2 条序列的种间最小变异均
大于种内最大变异。NJ 分子系统树分析显示,核
基因片段 ITS 和叶绿体基因 psbA-trnH 联合可以
准确区分中药材地黄及其近缘种。因此,ITS 和
psbA-trnH 序列可以作为地黄属内中药材地黄及
其与同属近缘种进行鉴定的条形码序列。
3.2 中药材地黄物种形成及其栽培起源
基于 DNA 条形码技术的分子鉴定不仅能准确
鉴定中药材正品与伪品,还能准确构建药用植物与
其近缘种类的系统发育关系,是探讨药用植物物种
及其栽培品种起源的基础[11]。本研究对地黄属内种
间的系统关系的研究结果表明,茄叶地黄与地黄的
亲缘关系最近,与 Xia 等[18]和 Albach 等[20]的结果
完全一致。与中药材地黄和茄叶地黄的四倍体不同,
地黄属内其他 4 个种染色体 2n=28,均为二倍体[6,21]。
Albach 等[20]认为地黄种内 ITS 基因存在高度变异,
加上形态特征的多样性,推断中药材地黄为异源四
倍体[22]。本研究核基因 ITS 分子系统树显示,中药
材地黄与茄叶地黄构成的分支,与裂叶地黄和高地
黄构成的分支聚在一起,支持率为 55%,表明地黄、
茄叶地黄与裂叶地黄、高地黄亲缘关系较近。李宏
庆等[23]和夏至等[6-7]研究认为裂叶地黄与高地黄为
同一种,高地黄为裂叶地黄的异名,因此,ITS 分
子系统树支持地黄、茄叶地黄与裂叶地黄亲缘关系
最近。叶绿体基因 psbA-trnH 的分子系统树结果显
示,中药材地黄与茄叶地黄构成的分支,与裂叶地
黄和天目地黄构成的分支聚在一起,支持率为 55%。
相对于核基因的双亲遗传,叶绿体基因在被子植物
中是母系遗传[24],因此,推测四倍体地黄的物种形
成一定与二倍体裂叶地黄存在密切的联系,天目地
黄可能是四倍体地黄物种形成的另一个亲本来源。
中药材地黄的栽培具有悠久的历史,新老产
区均存在栽培品种混杂且来源并不清楚[2]。本研
究核基因 ITS 和基因 psbA-trnH 的取样既包括地
黄的野生类群,同时也包括部分栽培品种。在核
基因 ITS 和叶绿体基因 psbA-trnH 联合的分子系
统树上,发现河南温县取样 3 个栽培品种与河南
温县、郑州、南阳和北京取样的野生群体聚在一
起,支持率为 69%,而同样这一分支在叶绿体基
因 psbA-trnH 的分子系统树上也得到支持。对叶
绿体基因 psbA-trnH 的单倍型分析结果表明,地
黄野生和栽培品种有 4 个单倍型,河南温县取样
3 个栽培品种与河南温县、郑州和南阳取样的野
生群体共享 1 个单倍型,而其余 3 个单倍型分别
为河南洛阳、林州和北京的 3 个野生群体。这表
明对比野生地黄,栽培地黄的遗传多样性已明显
降低。遗传多样性降低的程度取决于人类栽培驯
化过程中参与栽培起源的野生群体的大小,以及
栽培驯化时间的长短,中药的栽培起源不像农作
物那样规模庞大,时间长,人们只是零星地种植
从本区域野外收集的药用植物,所以只有有限的
野生群体参与了中药的栽培起源[25]。因此推测,
取样的栽培地黄品种可能起源于分布于河南温县
区域的野生群体。本研究对地黄属的 DNA 条形码
鉴定及中药材地黄栽培起源研究进行初步探讨,
但鉴于中药材地黄的栽培品种众多,且中药材地
黄又是一个广布种,因此进一步在该属扩大取样
范围(特别是扩大野生地黄不同区域分布的群体
及栽培品种的数量),选取其他多基因片段开展分
子谱系地理学研究,方能全面探讨中药材地黄的
物种形成及其栽培起源,这将为地黄属的药用植
物的资源开发与利用、品种选育、引种栽培提供
可靠的理论依据。
志谢:中国科学院植物研究所系统与进化植物
学国家重点实验室提供本研究分子实验平台。
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