全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 2期 2016年 1月

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基于 UPLC的注射用活血通络指纹图谱研究及多成分定量测定
林 夏 1, 2, 3，崔培超 4，徐桂红 2, 3，李家春 2, 3，黄文哲 2, 3，王振中 1, 2, 3，萧 伟 1, 2, 3*
1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210000
2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
3. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
4. 江苏康缘生态农业发展有限公司，江苏 连云港 222001
摘 要：目的 建立注射用活血通络的指纹图谱，并进行多成分定量分析，提升注射用活血通络质量标准。方法 采用 Thermo
C18柱（100 mm×3 mm，1.7 μm），以甲醇-0.05%甲酸水溶液梯度洗脱，体积流量 0.4 mL/min，柱温 20 ℃，检测波长为 260
nm。结果 得到分离度和重现性良好的指纹图谱，确定 21个共有峰，其中 11个共有峰来自于赤芍药材，7个共有峰来自于
川芎药材，3 个共有峰来自桃仁药材。同时利用相似度软件对 10 批注射用活血通络指纹图谱进行分析，各批次样品相似度
在 0.98 以上；通过对照品比对，指认了 5 个成分，分别为苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸，并对其
进行定量分析。结论 UPLC建立的注射用活血通络指纹图谱检测和 5个指标成分定量分析方法，快速、简便、准确，能有
效评价该制剂的质量。
关键词：注射用活血通络；UPLC；指纹图谱；多成分定量测定；苦杏仁苷；羟基芍药苷；芍药内酯苷；芍药苷；阿魏酸
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)02 - 0262 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.02.014
Fingerprint and multi-components quantitative determination for
Huoxuetongluo Injection by UPLC
LIN Xia1, 2, 3, CUI Pei-chao4, XU Gui-hong2, 3, LI Jia-chun2, 3, HUANG Wen-zhe2, 3, WANG Zhen-zhong1, 2, 3,
XIAO Wei1, 2, 3
1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China
2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
3. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China
4. Jiangsu Kanion Ecological Agriculture Development Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
Abstract: Objective To establish a UPLC fingerprint of the compounds in Huoxuetongluo Injection, and to make a quantitative
analysis. Methods The Thermo C18 (100 mm × 3 mm, 1.7 μm) column was used with a mobile phase of methyl alcohol-0.05% formic
acid gradient elution, the flow rate was 0.4 mL/min, the column temperature was 20 ℃, and the detection wavelength was 260 nm.
Results The fingerprint chromatography included 21 mutual peaks, of which 11 mutual peaks from Paeoniae Radix Rubra, 7 mutual
peaks from Chuanxiong Rhizoma, and 3 mutual peaks from Persicae semen. The similarity among the batches was more than 0.98.
Based on the retention time, and UV absorption spectra of reference compounds, five components, amygdalin, oxypaeoniflorin,
albiflorin, paeoniflorin, and ferulic acid, were identified and quantified. Conclusion The method is rapid, simple, and accurate, and
can be used for the quality control of Huoxuetongluo Injection.
Key words: Huoxuetongluo Injection; UPLC; fingerprint; multi-components quantitative determination; amygdalin; oxypaeoniflorin;
albiflorin; paeoniflorin; ferulic acid


收稿日期：2015-07-20
基金项目：国家科技部重大新药创制“脑血栓形成急性期治疗药物——注射用活血通络的临床研究”（2011ZX091012-122）
作者简介：林 夏（1985—），女，本科，工程师，研究方向为中药质量标准研究。Tel: (0518)85521932 E-mail: linxia297125856@163.com
*通信作者 萧 伟（1959—），研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药制剂和创新中药的开发与研究。E-mail: wzhzh-nj@tom.com
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注射用活血通络（Huoxuetongluo Injection,
HXTL）为桃红四物汤简方，由桃仁、赤芍、川芎 3
味中药组成，具有活血化瘀、行气通络之功效，用
于中风中经络（脑血栓形成）之急性期证属痰瘀阻
络者、半身不遂、口舌歪斜、舌强语謇、头晕目眩、
舌泽暗淡等。桃仁、赤芍、川芎都含有丰富的化学
成分，并具有广泛的药理活性[1-3]。注射用活血通络
成分研究表明，其主要含苷类、有机酸类及糖类成
分。为了更好地控制产品质量，保证临床疗效，需
提升质量标准，建立能够更加全面评价该制剂质量
的方法。目前 UPLC法因其分离效率高、样品量小、
节省溶剂、节省时间等特点越来越多的应用于中药
注射剂质量研究[4-5]。本实验以苷类、有机酸类成分
为主要分析对象，采用 UPLC同时对注射用活血通
络进行了指纹图谱[6-7]研究和 5 个指标成分的定量
测定[8]，该方法可作为全面评价注射用活血通络质
量的有效方法之一。
1 仪器和材料
Agilent 1290超高压液相色谱仪，DAD紫外检
测器，美国 Agilent 公司；MettlerAE240 电子分析
天平，瑞士 Mettler Toledo公司；BSA224S-CW型
电子分析天平，德国 Sartorius 公司；Centrifuge
5415D 高速离心机，德国 eppendorf 公司；Milli-Q
Academic纯水机，美国Millipore公司；KQ-250DB
型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司。
注射用活血通络，江苏康缘药业股份有限公司
生产，批号分别为 120501、120601、120701、120801、
120901、130101、130401、130501、130601、130701；
苦杏仁苷对照品（批号 110820-201305，质量分数
以 85.8%计）、芍药苷对照品（批号 110736-201337，
质量分数以 94.9%计）、阿魏酸对照品（批号
111787-201002，质量分数以 100%计），均购自中国
食品药品检定研究院；芍药内酯苷对照品（批号
MUST-14031214，质量分数≥98.0%）、羟基芍药苷
对照品（批号MUST-14061108，质量分数≥98.0%），
均购自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇，色谱
纯，美国天地公司；水为超纯水，其余试剂均为分
析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 Thermo C18柱（100 mm×3 mm，1.7
μm）柱；流动相为甲醇-0.05%甲酸水溶液，梯度洗
脱，线性洗脱程序为 0～6 min，15%～28%甲醇；6～
12 min，28%～44%甲醇；12～20 min，44%～75%
甲醇；20～25 min，75%甲醇；体积流量 0.4 mL/min；
检测波长 260 nm；柱温 20 ℃；进样量 2 μL；理论
板数按芍药苷峰计算应不低于 100 000。
2.2 参照物的选择
选择保留时间适中、分离度较好的芍药苷作为
参照物。
2.3 供试品溶液的制备
取本品内容物适量，混匀，取约 0.2 g，精密称
定，置 50 mL量瓶内，加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，过 0.22 μm滤膜，即得。
2.4 精密度试验
取同一供试品（批号 120501）溶液连续进样 6
针，以芍药苷为参照峰，计算共有峰相对保留时间
及主要共有峰相对峰面积，结果 RSD均小于 1.8%。
又以第 1次进样所得指纹图谱作为参照计算后 5次
进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不
小于 0.99。
2.5 稳定性试验
取同一供试品（批号 120501）内容物适量，取
约 0.2 g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法
制备供试品溶液，精密吸取 2 μL，分别于 0、3、6、
9、12、18 h注入液相色谱仪。以芍药苷为参照峰（S），
计算共有峰相对保留时间及主要色谱峰相对峰面
积，结果 RSD均小于 2%。又以第 1次进样所得指
纹图谱作为参照计算后 5次进样所得指纹图谱的相
似度，结果相似度结果均不小于 0.99。
2.6 重复性试验
取同一供试品（批号 120501）内容物适量，取
约 0.2 g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法
制备供试品溶液，平行制备 6份，测定，计算。以
芍药苷为参照峰，计算共有峰相对保留时间及主要
色谱峰相对峰面积，结果 RSD均小于 2%。又以第
1 次进样所得指纹图谱作为参照计算后 5 次进样所
得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于
0.99。
2.7 指纹图谱研究
2.7.1 指纹图谱的建立与技术参数 根据 10 批注
射用活血通络检测所得图谱，标定 21个共有峰，采
用国家药典颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价
系统》2012年版进行分析，以中位数法建立对照指
纹图谱，见图 1。10批所测供试品色谱图与对照指
纹图谱相似度分别为 0.987、0.995、0.989、0.997、
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0.991、0.991、0.989、0.980、0.987、0.988。
2.7.2 指纹图谱中共有峰的归属与指认 取赤芍药
材、桃仁药材、川芎药材粉末（过三号筛）各约 0.5
g，精密称定置具塞锥形瓶内，加 50%甲醇 50 mL
超声 60 min，取续滤液，过 0.22 μm滤膜，即得。
按“2.1”项下色谱条件进样分析，通过保留时间和
DAD扫描分析，指纹图谱中标定的 21个共有峰中
3、4、5、9、11、12、14、16、17、20、21号峰来
自赤芍药材，1、2、10、13、15、18、19号峰来自
川芎药材，6、7、8号峰来自桃仁药材。见图 2。通
过与混合对照品图谱比对，其中 8号峰为苦杏仁苷，
9号峰为羟基芍药苷，12号峰为芍药内酯苷，14号
峰为芍药苷，15号峰为阿魏酸。
2.8 已指认共有成分的定量测定
2.8.1 色谱条件 同“2.1”项下色谱条件。色谱图
见图 3。
2.8.2 混合对照品溶液的制备 取羟基芍药苷、苦
杏仁苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸对照品适量，



图 1 10批注射用活血通络指纹图谱及其对照指纹图谱
Fig. 1 UPLC fingerprint and control fingerprint for 10 batches of Huoxuetongluo Injection



图 2 注射用活血通络指纹图谱中各共有峰归属色谱图
Fig. 2 Chromatogram of each common peak attribution in fingerprint of Huoxuetongluo Injection
1 2
3 4 5
6
7
8
9
10
11 12
13
14 (S)
15
16
17
18
19
20
21
对照指纹图谱
120901
120701
120601
120501
120801
130601
130701
130401
130501
130101
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
t/min
3 4 5
9
1 2
6 7 8
9
1 2 3 4
11 12
14
16
17
20
21
赤芍药材
10 13 15
18
19
14 18
川芎药材
桃仁药材
对照指纹图谱 5
6 7
8
8
9
10 11
12 13 15 16
17
19
12
14
15
20
21
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
t/min
混合对照品
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1-苦杏仁苷 2-羟基芍药苷 3-芍药内酯苷 4-芍药苷 5-阿魏酸
1-oxypaeoniflorin 2-amygdalin 3-albiflorin 4-paeoniflorin
5-ferulic acid
图 3 混合对照品 (A) 和注射用活血通络样品 (B) 的
HPLC图
Fig. 3 HPLC of mixed reference substances (A) and
Huoxuetongluo Injection sample (B)

精密称定，加水制成含苦杏仁苷 1 082.4 μg/mL、羟
基芍药苷 60.3 μg/mL、芍药内酯苷 121.4 μg/mL、芍
药苷 1 502.2 μg/mL、阿魏酸 22.4 μg/mL的混合对照
品溶液。
2.8.3 供试品溶液的制备 同“2.3”项供试品溶液
的制备方法。
2.8.4 线性关系的考察 取混合对照品溶液，依次
精密量取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置 1 mL
量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取 2
μL，注入液相色谱仪，测定，以进样浓度为横坐标
（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回
归方程分别为苦杏仁苷 Y＝0.168 1 X－1.04，r＝
0.999 8；羟基芍药苷 Y＝10.434 X＋1.413 3，r＝
0.999 8；芍药内酯苷 Y＝0.676 2 X－0.346 7，r＝
0.999 9；芍药苷 Y＝0.437 8 X＋0.786 7，r＝0.999 9；
阿魏酸 Y＝5.174 7 X－0.386 7，r＝0.999 8。结果苦
杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏
酸分别在 108.24～649.44、6.03～36.18、12.14～
72.84、150.22～901.32、2.24～13.44 μg/mL呈良好
的线性关系。
2.8.5 精密度试验 取同一供试品（批号 120501）
溶液连续进样 6次，以峰面积计算各指标成分RSD，
分别为苦杏仁苷 0.31%、羟基芍药苷 1.21%、芍药
内酯苷 0.26%、芍药苷 1.34%、阿魏酸 1.0%。
2.8.6 稳定性试验 取同一供试品（批号 120501）
内容物适量，取约 0.2 g，精密称定，按“2.3”项方
法制备供试品溶液，精密吸取 2 μL，分别于 0、3、
6、9、12、18 h注入液相色谱仪。以峰面积计算各
指标成分 RSD，分别为苦杏仁苷 1.03%、羟基芍药
苷 0.38%、芍药内酯苷 1.61%、芍药苷 0.55%和阿魏
酸 0.64%，结果表明供试品溶液中各成分在 18 h内
稳定性良好。
2.8.7 重复性试验 取同一供试品（批号 120501）
内容物适量，取约 0.2 g，精密称定，按“2.3”项方
法制备供试品溶液，平行制备 6份，测定，计算。
苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和阿
魏酸的平均质量分数分别为 107.0、5.9、10.0、147.0、
2.1 mg/g，RSD分别为 0.93%、2.84%、0.72%、1.04%、
1.96%，结果表明本方法重复性良好。
2.8.8 回收率试验 取同一供试品（批号 120501）
内容物适量，取约 0.1 g，精密称定 6份，分别置 50
mL 量瓶中，精密量取“2.8.2”项混合对照品溶液
10 mL置于以上 6份样品中，加水溶解稀释定容至
刻度，摇匀，过 0.22 μm滤膜，注入超高效液相色
谱仪，测定，计算回收率。结果苦杏仁苷、羟基芍
药苷、芍药内酯苷、芍药苷和阿魏酸的平均回收率
分别为 102.3%、102.0%、98.7%、98.0%、99.6%，
RSD分别为 0.59%、1.81%、2.76%、1.57%、2.97%。
2.8.9 样品定量测定结果 取 10 批注射用活血通
络，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”
项下色谱条件进样分析，分别计算 5种成分的量，
结果见表 1。
3 讨论
比较了甲醇-水、乙腈-水和甲醇-0.05%甲酸系

表 1 样品测定结果 (n = 2)
Table 1 Determination of five maker components (n = 2)
批号
质量分数/(mg·g−1)
羟基芍药苷 苦杏仁苷 芍药内酯苷 芍药苷 阿魏酸
120501 5.9 107.0 10.0 147.0 2.1
120601 6.1 100.4 8.9 151.0 2.0
120701 6.6 101.5 13.8 149.5 1.9
120801 6.8 112.3 12.4 158.3 2.2
120901 5.4 118.3 13.7 142.5 1.9
130101 5.2 110.5 12.9 155.6 2.0
130401 6.9 104.3 11.1 149.6 2.2
130501 5.3 116.7 10.2 152.2 1.9
130601 5.1 112.5 9.9 154.3 2.3
130701 6.0 113.6 8.6 149.8 2.1
1
3
2 4
5
1
2
3
4
5
A
B
0 5 10 15 20 25 30
t/min
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统对指纹图谱的影响，结果甲醇-0.05%甲酸流动相
系统所得指纹图谱峰形较好，基线较平稳。比较了
在常规液相上使用 Gemini C18 柱（250 mm×4.6
mm，5 μm）及在 UPLC上使用 Thermo C18柱（100
mm×3 mm，1.7 μm）和 Agilent C18柱（50 mm×3.0
mm，1.8 μm）对指纹图谱的影响，结果在 UPLC上
使用 Thermo C18柱（100 mm×3 mm，1.7 μm）分
析指纹图谱时其分离效率高、分离度较好，故选择
用该类型色谱柱分析注射用活血通络的指纹图谱。
比较了柱温在 15、20、25 ℃时所得图谱，结果柱
温为 20 ℃时所得指纹图谱中 5 个指标成分分离度
在 1.6 以上；比较了体积流量为 0.35、0.4、0.45
mL/min所得图谱，结果对色谱峰分离无显著影响。
通过 DAD检测器在 190～400 nm全扫描，结果 260
nm下色谱峰较多，因此选择 260 nm作为指纹图谱
检测和苦杏仁苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药
苷和阿魏酸定量测定的检测波长，并且对 5个指标
成分进行了峰纯度验证，结果表明在本实验所确定
的检测条件下样品中所测定的 5个成分不含其他干
扰成分。
本研究建立的注射用活血通络 UPLC指纹图谱
及多成分测定方法，对 21个共有峰进行了归属，并
对其中 5个成分进行了定量分析，能够较全面控制
注射用活血通络的质量，但是其他 16个共有峰的定
性分析还需要进一步研究。
参考文献
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