全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

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显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因 cDNA 克隆及蛋白质序列分析
付 明，魏 麟，余 娟，余小林
怀化学院 生命科学系，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实
验室，湖南 怀化 418008
摘 要：目的 对显齿蛇葡萄 Ampelopsis grossedentata 查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克
隆的植物基因的保守序列设计一对引物，以显齿蛇葡萄总 RNA 为模板，采用 RT-PCR 的方法扩增 CHS 基因序列并连接到
pMD18-T Simple 载体上，阳性克隆经 PCR 检测后进行测序。结果 得到一段 1 173 bp 的序列，序列分析表明，该片段编码
390 个氨基酸，与其他高等植物 CHS 基因氨基酸序列同源性在 67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了 CHS 基因，
为有效利用该基因奠定了基础。
关键词：显齿蛇葡萄；查耳酮合成酶；基因克隆；序列分析；保守序列
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)01 - 0085 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.01.016
cDNA cloning and protein sequence analysis of chalcone synthase gene
in leaves of Ampelopsis grossedentata
FU Ming, WEI Lin, YU Juan, YU Xiao-lin
Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plant and Ethnobotany of Hunan Higher Education, Key Laboratory of Research and
Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Department of Life Sciences, Huaihua University, Huaihua
418008, China
Abstract: Objective To clone and analyze the chalcone synthase (CHS) gene sequence from the leaves of Ampelopsis grossedentata.
Methods A pair of primers were designed on the basis of the conserved sequences of the cloned plant CHS gene. Using total RNA in the
leaves of A. grossedentata as template, the sequence of CHS gene was cloned by reverse transcription polymerase chain reaction
(RT-PCR) and then the gene was ligated with pMD18-T Simple vector. The positive clone was sequenced after the identification of clone
by PCR. Results A fragment of 1 173 bp was cloned. The sequence analysis indicated that the fragment encoded 390 amino acids and
shared sequence homology of more than 67.9% with CHS gene sequences from other higher plants. Conclusion It is the first report that a
novel CHS gene is cloned from the leaves of A. grossedentata. This work lays a foundation for the effective application of CHS gene.
Key words: Ampelopsis grossedentata (Hand.-Mazz.) W. T. Wang; chalcone synthase; gene clone; sequence analysis; conserved sequence

显齿蛇葡萄 Ampelopsis grossedentata (Hand.
-Mazz.) W. T. Wang 系葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤
本植物，为粤蛇葡萄 A. cantoniesi (Hook. Et Arn.)
planch. 的变种。主要分布于湖南、湖北、广东、广
西、江西、福建、云南、贵州等省区[1-3]。其味甘、
淡、性凉，具有清热解毒、祛风湿等功效，用于治
疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疱疔等症，
已有数百年历史[2-4]。显齿蛇葡萄具有调节人体免疫
机能、抗氧化、降低血糖、调血脂、保肝护肝、抗
血栓、抗病毒等作用，对因烟酒过度、油腻过多等
引起的咽喉炎、消化功能障碍等病症功效独特[5]。此
外还有止咳祛痰、阻断艾滋病病毒感染等多种药理
活性[6]。民间将其幼嫩茎叶经类似茶叶加工的方法制
成“保健茶”，可日常冲泡饮用，清凉解渴，是典型
的药食两用植物，其应用和开发价值引起了广大学
者的关注。研究表明，其有效成分主要是次生代谢
产物黄酮及挥发油[2-14]，其中黄酮的质量分数高达
45.52%[15-17]。植物体内通过莽草酸途径（shikimic

收稿日期：2012-09-03
基金项目：湖南省“十二五”植物学重点建设学科资助（2010212）；湖南省高校科技创新团队支持计划资助（2010212）；怀化学院民族药用
植物资源研究与利用湖南省重点实验室资助项目（SYSXM200902）
作者简介：付 明（1966—），女，湖北荆门人，副教授，主要从事植物生物化学研究。E-mail: fm6988@163.com
网络出版时间：2012-12-25 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20121218.1013.002.html
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acid pathway）和苯丙氨酸代谢途径（phenylalanine
metabolic pathway）生成查耳酮，再转化为黄酮类
化合物。查耳酮合成酶（chalconesynthase，CHS）
是黄酮类化合物生物合成的关键酶。近年来，挥发
油和黄酮类物质合成酶基因的克隆、分离、表达和
调控成为研究热点。
鉴于显齿蛇葡萄 CHS 基因还未见报道，本研究
拟应用RT-PCR的方法克隆显齿蛇葡萄CHS基因片
段，并对其序列进行生物信息学分析，为有效利用
该基因及合理开发显齿蛇葡萄奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
显齿蛇葡萄 Ampelopsis grossedentata (Hand.-
Mazz.) W. T. Wang 完整植株样品采集于湖南省八面
山国家级自然保护区。由怀化学院伍贤进教授鉴定
后摘取新鲜叶片用乙醇擦拭及焦碳酸二乙酯
（DEPC）水漂洗后，立即放入液氮中保存，回实
验室后于−80 ℃冰箱保存备用。
克隆载体 pMD18-T Vector，TakaRa LA Taq 酶，
M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 试剂盒，Trizol
试剂，Gel Extraction Kit 试剂盒，质粒提取试剂盒、
DNA Marker，T4 DNA Ligase；其他试剂均为分析
纯。菌种 JM109 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 应用 Oligo 6 软件，比对
已报道的葡萄 CHS 基因的核苷酸序列（X75969、
EF192464、XM002276910），进行引物设计。上游
引物 F：5’-ATGGTGTCAGTTGCGGAAAT-3’；下游
引物 R：5’-TCAGTGAGCCGCTGGTGCAG-3’由生
工生物工程（上海）有限公司合成。
1.2.2 总 RNA 的提取 叶片总 RNA 提取方法按照
Trizol 试剂说明书进行，提取后进行电泳检测和纯
度及浓度测定；并于−80 ℃保存备用。
1.2.3 cDNA 链合成 根据试剂盒说明书进行，反
转录产物分离纯化后置于−20 ℃保存备用。
1.2.4 PCR 扩增 在 30 μL 反应体系中，加入反转
录产物 4 μL，PCR 缓冲液（Mg2+ Plus，2.5 mmol/L）
15 μL，dNTP mixture（2.5 mmol/L）3 μL，F 和 R
引物（均为 10 μmol/L）各 0.7 μL，TakaRa LA
TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，加去离子水至
30 μL，混匀后扩增。反应条件为：预变性 94 ℃、4 min，
30 个循环（94 ℃ 1 min，58 ℃、45 s，72 ℃、90 s），
后延伸 72 ℃、10 min。
1.2.5 扩增片段的克隆、测序和序列分析 对 PCR
产物进行回收，连接载体 pMD 18-T Vector，并转化
JM109 感受态细胞，通过蓝白筛选后，挑选白色菌
落过夜培养，提取质粒，PCR 方法鉴定重组子，然
后测序（由上海生工生物工程公司完成）。采用
DNAStar 软件包分析与处理序列，在 NCBI 网站上
Blast 比对及 BioEdit 软件分析，并用 Mega 4 软件进
行 UPMAG 聚类分析。
2 结果与分析
2.1 总 RNA 的提取及检测
以显齿蛇葡萄叶片为材料提取的总 RNA，经过
琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示 28 S rRNA 和 18 S
rRNA 条带清晰（图 1），说明所提取的 RNA 完整
性较好；经核酸蛋白检测仪测得 A260/A280 平均值为
1.98，表明 RNA 纯度较高。

图 1 显齿蛇葡萄总 RNA 的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA
from leaves of A. grossedentata
2.2 PCR 扩增
以总 RNA 反转录所得到的第一链 cDNA 为模
板，用引物 F 和 R 进行 PCR 扩增。扩增产物经检
测发现约在 1 170 bp 处有一条亮带（图 2），且上下

M-Marker 1～3 为显齿蛇葡萄 CHS 基因 PCR 扩增产物
M-Marker 1—3-PCR amplification of CHG gene in leaves
of A. grossedentata
图 2 PCR 产物凝胶电泳
Fig. 2 Gel electrophoresis of PCR product
28 S
18 S


5.8 S
M 1 2 3
1 173 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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无杂带，与推测的目的片段的大小一致。
2.3 阳性克隆的鉴定
将回收纯化的目的片段连接到 pMD18-T Simple
克隆载体上，转化 JM109，随机挑取阳性克隆，培养
后提取质粒进行 PCR 扩增，经检测片段大小约为
1 173 bp（图 3），与前面 PCR 结果一致，可进行测序。
2.4 序列分析
将重组 pMD18-T Simple 质粒进行测序，得到
一段长度为 1 173 bp 的序列，含一个完整的开放阅

M-Marker 1～2 为 PCR 鉴定产物
M-Marker 1—2-PCR identification products
图 3 阳性克隆的 PCR 鉴定
Fig. 3 PCR identification of positive clones
读框架（ORF），共编码 390 个氨基酸（图 4），BLAST
比对结果显示，该片段与其他近缘植物的 CHS 基因
核苷酸序列的同源性在 90%以上，表明所克隆的
DNA 序列为显齿蛇葡萄的 CHS 基因序列。
2.5 显齿蛇葡萄 CHS 氨基酸序列基本特征的推导
利用 ExPASy 服务器在线软件对显齿蛇葡萄
CHS 进行理化性质分析，该蛋白编码一个含 390 个
氨基酸残基的蛋白，分子式为 C1902H3044N512O566S20，
其相对分子质量为 42 781.3，等电点预测为 6.18，
为膜外蛋白。预测其二级结构，发现 α-螺旋占
44.62%，β-转角占 7.95%，无规卷曲占 30.77%，延
伸链占 16.67%（图 5）。利用 SWISS-MODEL[18-20] 对
其三级结构进行预测，结果见图 6。
2.6 显齿蛇葡萄 CHS 氨基酸序列的同源性及亲缘
关系分析
推导氨基酸序列比较结果表明，显齿蛇葡萄 CHS
与沙梨（ADP09376.1）、桃（AEJ88217）、西红柿
（NP001234033）、玉米（NP001142246）、葛
（AFC87828）、虎杖（AFD64563）、水仙（AEN04070）
和圆叶牵牛（AAB62587）CHS 分子的同源性分别

图 4 显齿蛇葡萄 CHS 基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CHS gene from leaves of A. grossedentata
1 173 bp
M 1 2
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 bp
81 bp
161 bp
241 bp
321 bp
401 bp
481 bp
561 bp
641 bp
721 bp
801 bp
881 bp
961 bp
1 041 bp
1 121 bp
80 bp
160 bp
240 bp
320 bp
400 bp
480 bp
560 bp
640 bp
720 bp
800 bp
880 bp
960 bp
1 040 bp
1 120 bp
1 173 bp
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为 91.5%、90.5%、88.4%、83.1%、84.8%、81.8%、
84.1%和 67.9%，表明 CHS 氨基酸序列具有较高的
同源性，说明其在进化过程中，具有较高的保守性。
将序列进行聚类分析，结果显示显齿蛇葡萄与沙梨、
桃、西红柿的亲缘关系相对较近，而与圆叶牵牛亲
缘关系相对较远（图 7）。
蓝色-α-螺旋 红色-折叠 绿色-β-转角 紫色-卷曲
blue-α-helix red-tuin green-β-extended strand purple-coil
图 5 CHS 蛋白二级结构预测图
Fig. 5 Secondary structure prediction of CHS protein

图 6 CHS 蛋白三级结构预测图
Fig. 6 Tertiary structure prediction of CHS protein

图 7 显齿蛇葡萄与其他植物的 CHS UPGMA 进化树
Fig. 7 UPGMA dendrogram of CHS in A. grossedentata
and other plants
3 讨论
CHS 在苯丙氨酸合成途径和异黄酮合成途径
中发挥关键作用[21]，是黄酮类化合物合成途径的关
键酶和限速酶。CHS 在植物中广泛存在，在很多生
理生化活动中起着重要作用，是近年来植物生理生
化和分子生物学研究的热点之一。作为黄酮类化合
物合成的关键酶和限速酶，其活性高低与量的多少
决定着后续产物量的多少。随着植物黄酮类合成途
径中相关酶的分离与鉴定，利用酶表达改变黄酮类
物质的量是改变作物及中药品质的有效手段之一。
本研究利用 RT-PCR 技术首次克隆了显齿蛇葡
萄 CHS 基因的全长 cDNA 序列。克隆的显齿蛇葡
萄 CHS 基因的一个完整的 ORF，编码 390 个氨基
酸。对推导的氨基酸序列的结构和功能进行生物信
息学分析，发现显齿蛇葡萄 CHS 是 1 种膜外蛋白，
没有信号肽序列，提示 CHS 在催化黄酮类代谢反应
中产物合成的初始反应均在膜外进行。与其他植物
的氨基酸序列进行比较，结果显示，显齿蛇葡萄
CHS 蛋白同其他植物 CHS 蛋白具有较高的相似性，
说明 CHS 基因在进化过程中比较保守。这与其在植
物生命活动过程中——黄酮类物质合成途径中所发
挥的作用有关。
本研究首次成功克隆了显齿蛇葡萄的 CHS 基
因 cDNA 序列，将为进一步构建过表达载体和遗传
转化体系，为实现黄酮类主要成分在植株及细胞中
高效表达及其生物合成遗传改良提供基因资源和理
论基础，并为开展显齿蛇葡萄及类似以黄酮为主要
活性成分植物的遗传改良、提高药材品质具有十分
重要的理论意义和实践价值。
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0 50 100 150 200 250 300 350 400

桃
沙梨
显齿蛇葡萄
西红柿
水仙
玉米
葛
虎杖
圆叶牵牛
0.20 0.15 0.10 0.05 0
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《中草药》杂志最新佳绩
《中草药》杂志在 2011年荣获第二届中国出版政府奖（国家新闻出版行业的最高奖）基础上，2012年
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