全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 24 期 2014 年 12 月 ·3565·
ISC-HPLC 法同时测定桃红四物汤中酚类物质
杨 辉，张 季，刘丰熙，杨建明，郭春燕*
河北北方学院 药学系，河北 张家口 075000
摘 要：目的 建立离子抑制高效液相色谱（ISC-HPLC）法测定桃红四物汤中酚类物质的方法。方法 采用 ISC-HPLC 法
测定桃红四物汤中羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和绿原酸的量，分光光度法测定桃红四物汤中总酚酸的
量。结果 桃红四物汤中羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和绿原酸分别在 5.00～80.00、1.25～20.00、0.60～
9.60、0.90～14.40、1.00～16.00 μg/mL 与峰面积呈良好线性关系；平均回收率分别为 98.50%、97.17%、97.17%、98.45%、
97.16%（n＝9）。结论 ISC-HPLC 方法简便、准确、快速、重复性好，可用于桃红四物汤中酚类物质的质量控制。
关键词：桃红四物汤；离子抑制高效液相色谱法；羟基红花黄色素 A；阿魏酸；没食子酸；原儿茶酸；绿原酸；总酚酸
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)24 - 3565 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.24.012
Simultaneous determination of phenols in Taohong Siwu Decoction
by ISC-HPLC
YANG Hui, ZHANG Ji, LIU Feng-xi, YANG Jian-ming, GUO Chun-yan
Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China
Abstract: Objective To determine the contents of phenols in Taohong Siwu Decoction (TSD) by ISC-HPLC. Methods The
ISC-HPLC was used to determine the contents of hydroxysafflor yellow A, ferulic acid, gallic acid, protocatechuic acid, and
chlorogenic acid. Spectrophotometric method was used to determine the contents of total phenolic acids. Results The contents of
hydroxysafflor yellow A, ferulic acid, gallic acid, protocatechuic acid, and chlorogenic acid in TSD had good linear relationships with
the peak area in the ranges of 5.00—80.00, 1.25—20.00, 0.60—9.60, 0.90—14.40, and 1.00—16.00 μg/mL, respectively, and the average
recoveries (n = 9) were 95.82%, 94.98%, 96.52%, 97.16%, and 98.14%, respectively. Conclusion ISC-HPLC method is simple,
rapid, accurate, and reproducible, and can be used for the quality control of TSD.
Key words: Taohong Siwu Decoction; ISC-HPLC; hydroxysafflor yellow A; ferulic acid; gallic acid; protocatechuic acid; chlorogenic
acid; total phenolic acids

桃红四物汤出自《医宗金鉴》，由四物汤加桃仁、
红花组成，是活血化瘀代表方之一，具有养血活血
双重功效[1]。临床用于妇科疾病、冠心病、动脉粥
样硬化、糖尿病并发症、肝肾疾病和骨科疾病的治
疗。现代药理实验证实，桃红四物汤具有镇痛、抗
炎、扩张血管、改善微循环、调节免疫功能，其药
理活性涉及的多个领域均与清除自由基有关[2-5]。有
研究表明，桃红四物汤的抗氧化作用与其所含酚酸
及苷类成分有一定关系[6-7]。本实验应用离子抑制色
谱法（ion suppression chromatography，ISC）检测
桃红四物汤中羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子
酸、原儿茶酸和绿原酸的量，通过在流动相中加入
酸性添加剂，改变 pH 值，抑制溶质电离。ISC-HPLC
法用于易水解和电离的多酚化合物的分析具有简
便、准确、快速、重复性好的特点。羟基红花黄色
素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和绿原酸具有
多种药理活性[8-12]，通过本研究为桃红四物汤中酚
类物质的检测提供依据。
1 仪器与材料
Agilent 1100 型高效液相色谱仪，配置 G1311A

收稿日期：2014-07-28
基金项目：河北省教育厅重大项目（ZD2014075）；河北省卫生厅医学科学研究重点课题（20090588）
作者简介：杨 辉（1972—），男，副教授，研究方向为天然药物化学。Tel: (0313)4029286 E-mail: yangkcer@163.com
*通信作者 郭春燕，女，教授，博士，硕士生导师。E-mail: guochy0311@163.com
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QuatDump 四元梯度泵、G1322A Degasser 在线脱气
机、G1314 VWD 检测器，美国 Agilent 公司；ME235S
Sartorius 十万分之一分析天平，德国赛多利斯公司；
SAFIRE2 多功能酶标仪（TECAN Austria GmbH）。
羟基红花黄色素 A（批号 111637-201308）、没
食子酸（批号 110831-201204）、原儿茶酸（批号
110809-201205）、绿原酸（批号 110753-201314）和
阿魏酸（批号 110773-201313）对照品购自中国食
品药品检定研究院，供定量测定用。甲醇为色谱纯，
水为超纯水。红花（批号 20140101、20140201）、
桃仁（批号 20140107、20140203）、当归（批号
130709、140106）、川芎（批号 20140101、20140220）、
熟地（批号 140101、140211）、白芍（批号 20140101、
20140217），购自张垣中药饮片有限公司，均由河北
北方学院中医学院赵恒成教授鉴定，红花为菊科植
物红花 Carthamus tinctorius L. 的干燥花，桃仁为蔷
薇科植物桃 Prunus persica (L.) Batsch 的干燥成熟
种子，当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis
(Oliv.) Diels 的干燥根，川芎为伞形科植物川芎
Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根茎，熟地为玄
参科植物地黄 Rehmannia glutinosa Libosch 的干燥
块根，白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.
的干燥根，均为正品。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品储备液的制备 分别精密称取羟基红
花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和绿原
酸对照品适量，分别加 10%甲醇配成各单一对照品
储备溶液。
2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密吸取单一对照
品储备液适量，置同一量瓶中，加 10%甲醇制成混
合对照品储备液，羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没
食子酸、原儿茶酸和绿原酸的质量浓度分别为
80.00、20.00、9.60、14.40、16.00 μg/mL。
2.1.3 供试品溶液的制备 取桃仁、红花、当归、
川芎、熟地黄、白芍饮片，粉碎，过 60 目筛后，按
照 15∶15∶15∶10∶10∶10 比例混合均匀，精密称
定桃红四物汤饮片粉末 500.0 mg，加水 25 mL，回
流提取 2 次，合并滤液，定容至 50.00 mL，摇匀，
0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得桃红四物
汤供试品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱为 Thermo ODS-2 Hypersil（250 mm×
4.6 mm，5 μm）；检测波长 286 nm；体积流量 1
mL/min；柱温 35 ℃；进样量 20 μL；流动相为甲
醇-0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱条件：0～5 min，5%
甲醇；5～14 min，5%～32%甲醇；14～20 min，32%
甲醇；20～25 min，39%甲醇，维持 5 min。
2.3 专属性试验
在“2.2”项色谱条件下，羟基红花黄色素 A、
阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和绿原酸混合对照品
溶液及桃红四物汤供试品溶液中 5 种酚类成分达到
基线分离。羟基红花黄色素 A 来源于红花，阿魏酸
来源于桃仁、当归、川芎，没食子酸来源于白芍，
原儿茶酸来源于川芎，绿原酸来源于桃仁和当归。
羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸
和绿原酸混合对照品、桃红四物汤供试品及阴性对
照品 HPLC 色谱图见图 1。
2.4 线性范围的考察
将上述混合对照品溶液倍比稀释，得混合标准
系列溶液，其中含羟基红花黄色素 A 系列质量浓度
分别为 5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg/mL；
阿魏酸系列质量浓度分别为 1.25、2.50、5.00、10.00、
20.00 μg/mL；没食子酸系列质量浓度分别为 0.60、
1.20、2.40、4.80、9.60 μg/mL；原儿茶酸系列质量
浓度分别为 0.90、1.80、3.60、7.20、14.40 μg/mL；
绿原酸系列质量浓度分别为 1.00、2.00、4.00、8.00、
16.00 μg/mL。在上述色谱条件下分别进样 20 μL 进
行测定。以混合对照品质量浓度为横坐标（X），峰
面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程，
没食子酸：Y＝40.22 X＋3.111，r＝0.999 7；原儿茶
酸：Y＝30.07 X＋12.660，r＝0.999 6；羟基红花黄
色素 A：Y＝22.69 X＋9.210，r＝0.999 0；绿原酸：
Y＝22.15 X＋8.340，r＝0.997 8；阿魏酸：Y＝54.34
X＋9.920，r＝0.999 5。羟基红花黄色素 A、阿魏酸、
没食子酸、原儿茶酸和绿原酸的线性范围分别为
5.00～80.00、1.25～20.00、0.60～9.60、0.90～14.40、
1.00～16.00 μg/mL。
2.5 精密度试验
精密吸取供试品溶液 20 μL，按上述色谱条件
连续进样 5 次，测得羟基红花黄色素 A、阿魏酸、
没食子酸、原儿茶酸和绿原酸峰面积的 RSD 分别为
2.2%、2.3%、2.1%、1.9%、2.0%，结果表明仪器精
密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取供试品溶液在室温下放置，分别在 0、
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1-没食子酸 2-原儿茶酸 3-羟基红花黄色素 A 4-绿原酸 5-阿魏酸
1-gallic acid 2-protocatechuic acid 3-hydroxysafflor yellow A 4-chlorogenic acid 5-ferulic acid

图 1 混合对照品溶液 (A)、桃红四物汤供试品溶液 (B)、阴性对照品 (缺没食子酸，C；缺原儿茶酸，D；
缺羟基红花黄色素 A，E；缺阿魏酸，F；缺绿原酸，G) 的 HPLC 图
Fig. 1 HPLC of mixed reference substance (A), TSD sample solution (B), and negative reference substance without
(gallic acid, C; protocatechuic acid, D; hydroxysafflor yellow A, E; ferulic acid, F; chlorogenic acid, G)

2、4、8、12 h 进样 20 μL，测得羟基红花黄色素 A、
阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和绿原酸峰面积的
RSD 分别为 2.1%、1.7%、1.9%、2.2%、2.0%，结
果表明供试品溶液中上述 5 个成分室温放置 12 h 内
稳定性良好。
2.7 重复性试验
精密称取样品粉末 5份，每份 500.0 mg，按“2.1”
项下方法平行制备成供试品溶液，分别进样 20 μL
进行测定。结果羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食
子酸、原儿茶酸和绿原酸质量分数的 RSD 分别为
1.9%、2.0%、1.7%、2.0%、2.3%，结果表明重复性
良好。
2.8 加样回收率试验
取已测定羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子
酸、原儿茶酸和绿原酸的样品 9 份，精密称定，分
为 3 组，分别精密加入羟基红花黄色素 A（3.000、
2.500、2.000 μg/mL）、阿魏酸（1.800、1.500、1.200
μg/mL）、没食子酸（1.380、1.150、0.920 μg/mL）、
原儿茶酸（0.840、0.700、0.560 μg/mL）和绿原酸
（0.540、0.450、0.360 μg/mL）混合储备液适量，按
“2.1.3”项下方法操作，制备供试品溶液，在上述色
谱条件下分别进样进行测定，计算回收率。结果羟
基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿茶酸和
绿原酸的平均回收率分别为 98.50%、97.17%、
97.17%、98.45%、97.16%，RSD 分别为 2.0%、2.0%、
2.0%、2.0%、2.1%。
2.9 样品测定
取桃红四物汤供试品溶液，在“2.2”项色谱条
件下进样分析，精密吸取供试品溶液 20 μL，注入
液相色谱仪，记录色谱图，代入回归方程计算桃红
四物汤中羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、
原儿茶酸和绿原酸的量，测定结果见表 1。结果表
明，各批次药材中上述五种酚类物质定量测定精密
度良好，说明本实验建立的方法简便可行。
2.10 样品中总酚酸定量测定[13-14]
2.10.1 检测原理 酚酸化合物在碱性条件下能够
还原钨钼酸生成蓝色化合物，在 760 nm 处有强吸
收，吸光度（A）值与酚类化合物质量浓度呈正相
关。以没食子酸为对照品确定样品中总酚酸的量。
2.10.2 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒定质
量的没食子酸对照品 5.0 mg 置于 50 mL 棕色量瓶
中，用超纯水溶解、定容至刻度，摇匀，得 0.10
mg/mL 的没食子酸对照品溶液。精确吸取没食子酸
对照品溶液 0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL 于
25 mL 棕色量瓶中，加入蒸馏水至 6.0 mL，依次加
入福林试剂 0.50 mL、75 g/L Na2CO3 溶液 4.0 mL，
加水定容至刻度，充分混匀后于 30 ℃静置 40 min，
以不加对照品的溶液为空白对照，于 760 nm 处测
定 A 值。采用最小二乘法以 A 值对没食子酸质量浓
度进行线性回归分析，得回归方程为 A＝99.89 C＋
1
2 3
4 5
1
2
3
4 5 5 1
3 4 5
2
3
4
0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30
4 5 1
2
2
1
3
4 1
2
3
5
A B C D
E F G
0 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 30
t / min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 24 期 2014 年 12 月 ·3568·
表 1 桃红四物汤 5 种酚类物质定量测定结果 ( x ±s, n = 6)
Table 1 Quantitative determination of five phenols components in TSD ( x ±s, n = 6)
质量分数 / (mg·g−1) 批次
没食子酸 原儿茶酸 羟基红花黄色素 A 绿原酸 阿魏酸 总酚酸
1 1.140±0.015 0.701±0.011 2.54±0.04 0.450±0.003 1.511±0.016 26.3±0.5
2 0.987±0.016 0.900±0.013 2.12±0.04 0.571±0.004 1.504±0.017 28.3±0.6
3 0.896±0.015 0.922±0.012 2.34±0.06 0.412±0.004 1.479±0.016 24.1±0.6
4 1.007±0.017 0.876±0.014 2.69±0.06 0.597±0.004 1.604±0.017 30.3±0.6
5 1.067±0.019 0.698±0.012 2.58±0.05 0.467±0.005 1.577±0.016 26.6±0.7
6 1.222±0.021 0.711±0.013 2.51±0.04 0.656±0.005 1.522±0.018 27.5±0.5

0.011 8，r＝0.999 8，线性范围为 1～16 μg/mL。
2.10.3 样品测定 取桃红四物汤供试品溶液，按
“2.10.2”项方法操作并测定，结果见表 1。结果表
明，6 个批次药材中总酚酸的量均在 24～30 mg/g。
3 讨论
羟基红花黄色素 A、阿魏酸、没食子酸、原儿
茶酸和绿原酸均为取代芳香化合物，可以产生 K 吸
收带，所以紫外有强吸收。200～410 nm 扫描显示
其最大吸收波长不同，但是在 286 nm 均有较强吸
收，所以本实验选择 286 nm 为紫外检测波长。
溶液酸度显著影响羟基红花黄色素 A、阿魏酸、
没食子酸、原儿茶酸和绿原酸的解离程度，从而影
响保留因子、保留时间和分离度。本研究加入少量
乙酸作为离子抑制剂，调节流动相的 pH 值，应用
ISC-HPLC 测定上述 5 种酚类物质的量，所建立的
ISC-HPLC 法简便、快速、准确，为桃红四物汤提
取物的质量评价提供了实验依据。
没食子酸、原儿茶酸与羟基红花黄色素 A、绿
原酸、阿魏酸的极性差异较大，采用等度洗脱分离
时，羟基红花黄色素 A、绿原酸和阿魏酸保留时间
显著延长，而采用甲醇-水梯度洗脱系统可以在 30
min 内取得好的分离效果。本实验建立的 ISC-HPLC
法快速、准确、稳定性好，是一种测定桃红四物汤
中没食子酸、原儿茶酸、羟基红花黄色素 A、绿原
酸、阿魏酸量的可靠方法，可为桃红四物汤质量控
制提供实验依据。
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