全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 3 期 2015 年 2 月

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虎杖查耳酮合酶基因 RNAi 载体的构建及其遗传转化
柳忠玉 1，赵树进 2*
1. 长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025
2. 广州军区广州总医院，广东 广州 510010
摘 要：目的 构建虎杖查耳酮合酶（PcCHS1）基因的 RNA 干涉（RNAi）表达载体，获得 PcCHS1 表达下调的转基因虎杖
植株。方法 根据 GenBank 中已知的 PcCHS1 基因序列（EF090604），设计相应引物，克隆 PcCHS1 基因核心保守序列。以
PcCHS1 基因为靶基因，将长度 574 bp 保守序列片段通过正、反 2 个方向插入表达载体 pYLRNAi 中，构建 RNAi 表达载体
pYLRNAi-PcCHS1。通过根癌农杆菌介导法将其导入虎杖茎尖组织。对获得的转基因植株，利用 Northern blotting 检测 PcCHS1
基因表达水平，并应用 HPLC 法测定虎杖中白藜芦醇苷的量。结果 成功构建 PcCHS1 基因 RNA 干涉表达载体，获得了 5 株
转 PcCHS1 基因干涉载体的阳性植株。转基因虎杖 PcCHS1 基因表达水平显著下调，并且转基因植株中白藜芦醇苷量均得到
显著提高，其中最高量是对照植株的 3.8 倍（P＜0.05）。结论 成功获得了干涉 PcCHS1 基因表达下调的转化植株，抑制 PcCHS1
基因的表达显著增加了转基因虎杖中白藜芦醇苷的量，为有效利用该基因提高虎杖白藜芦醇苷量奠定基础。
关键词：虎杖；查耳酮合酶；白藜芦醇苷；RNA 干扰；转基因
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)03 - 0412 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.03.020
Construction of RNA interference vector of Polygonum cuspidatum chalcone
synthase gene and its genetic transformation
LIU Zhong-yu1, ZHAO Shu-jin2
1. College of Life Sciences, Yangtze University, Jingzhou 434025, China
2. General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China
Abstract: Objective To construct the RNAi expression vector of Polygonum cuspidatum chalcone synthase (PcCHS1) gene, and to
obtain the transgenic plants in which PcCHS1 expression was down-regulated. Methods According to known sequence (EF090604)
of PcCHS1 gene in GenBank, right primers were designed and the conserved sequence was cloned. The conserved fragment (574 bp)
targeting at PcCHS1 gene was inserted into the expression vector pYLRNAi in both forward and reverse directions, and RNA
interference (RNAi) expression vector pYLRNAi-PcCHS1 was constructed. Using the method of Agrobacterium-mediated
transformation, the expression vector was used to transform the shoot tips of P. cuspidatum, and transgenic plants were obtained. The
expression of PcCHS1 was confirmed by Northern blotting and the accumulation of polydatin was detected by HPLC. Results RNAi
expression vector of PcCHS1gene was constructed successfully, and five transgenic plants were obtained. Northern blotting analyses
indicated that the expression levels of PcCHS1 were significantly down-regulated in the transgenic plants. Polydatin concentration in
the transgenic plants was up to 3.8 times higher than that in non-transformed control plants. Conclusion Transgenic P. cuspidatum
plants with down-regulated expression of PcCHS1 gene were obtained successfully. The content of polydatin in the transgenic P.
cuspidatum was significantly increased by RNAi against PcCHS1. This work might establish an experimental basis for the effective
application of PcCHS1 in improving polydatin accumulation in P. cuspidatum.
Key words: Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.; chalcone synthase; polydatin; RNA interference; transgene

虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. 是蓼
科多年生草本植物，根或根茎入药，是重要的白藜
芦醇药源植物之一。白藜芦醇及白藜芦醇苷具有抗
肿瘤、抗衰老、保护心血管系统等广泛的生物学功

收稿日期：2014-09-18
基金项目：广东省自然科学基金资助项目（10151001002000012）；长江大学博士启动基金项目（801100010122）
作者简介：柳忠玉（1978—），女，博士，讲师，研究方向为中药生物技术。E-mail: zyliu2004@126.com
*通信作者 赵树进，教授，博士生导师，研究方向为生物制药。E-mail: gzzsjzhs@163.com
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能[1]。白藜芦醇及其糖苷属于次生代谢产物，其大规
模的应用受到产地、季节等因素的影响，从而大大限
制了其药用价值的推广。如何提高植物中白藜芦醇及
其糖苷的量成为许多学者研究的热点。人们不再局限
于利用物理或化学方法促进药用成分的生物合成，而
是越来越多地转向于利用分子手段干预其生物合成
途径，以此提高药用成分的量、改善植物营养价值，
例如将白藜芦醇合酶基因转入白杨、油菜、猕猴桃等
物种，均能促进白藜芦醇苷的合成[2-4]。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是与靶
基因同源双链 RNA 引发，在动植物和真菌中普遍
存在序列特异的转录后基因沉默现象[5]。RNAi 技术
已广泛应用于基因功能、基因表达调控机制研究等
领域[6]。RNAi 可以有效的抑制特异基因的表达，因
此可用于对药用植物次生代谢产物的生物合成途径
进行调控，达到调控天然产物生物合成的目的，例
如 RNAi 技术在咖啡、黄连中的成功应用[7-8]。
白藜芦醇经由苯丙烷类代谢途径合成而来。该
途径中，白藜芦醇合酶和查耳酮合酶分别是白藜芦
醇生物合成和黄酮代谢途径上的关键酶，白藜芦醇
合酶和查耳酮合酶能利用相同的底物（对香豆酰辅
酶 A 和丙二酰辅酶 A）合成截然不同的产物，从而
形成苯丙烷类代谢途径上的 2 条分支途径[9]。尽管
查耳酮合酶不是白藜芦醇生物合成途径中的关键
酶，但它与白藜芦醇合酶竞争共同前体对香豆酰辅
酶 A 和丙二酰辅酶 A，间接影响了白藜芦醇代谢
流[9]。本研究利用 RNAi 技术构建虎杖查耳酮合酶
基因（PcCHS1）的 RNAi 表达载体，并将其成功导
入虎杖基因组中，以期为揭示 PcCHS1 基因在白藜
芦醇合成中的功能、提高白藜芦醇量提供理论依据。
1 材料与试剂
1.1 植物材料
虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. 植株
由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提
供，由该中心杨锦芬副教授鉴定。虎杖试管苗由本
课题组培育。根癌农杆菌 EHA105 和潮霉素抗性的
双元表达载体 pYLRNAi 由华南农业大学植物基因
组学与生物技术重点实验室提供。
1.2 试剂
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成。限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、pMD18-T
载体购自 TaRaKa 公司。总 RNA 提取试剂盒、cDNA
第一链合成试剂盒和凝胶回收试剂盒购自 Tiangen
公司。白藜芦醇苷对照品（批号 111575-200801）
购自中国食品药品检定研究院。
2 方法
2.1 虎杖叶片总 RNA 的提取及反转录
以野生虎杖叶片为材料，采用 Trizol 法提取总
RNA，用 cDNA 第一链合成试剂盒将总 RNA 反转
录成 cDNA 备用，严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.2 CHS1 基因正、反义片段的克隆与测序
根据 GenBank 中已知的虎杖查耳酮合酶基因
PcCHS1 序列（EF090604），设计相应引物，克隆
PcCHS1 基因保守序列，以该保守序列为干扰片段，
片段长度为 574 bp。并且根据表达载体 pYLRNAi
的限制性内切酶酶切位点，设计引物（P1、P2）扩
增正义片段，引物两端分别加上 BamH I 和 Hind III
酶切位点。设计引物（A1、A2）扩增反义片段，引
物两端分别加上 Mlu I 和 Pst I 酶切位点。引物序列：
P1：5’-CGGGATCCGACAGACACTCACTTGG-
A-3’（BamH I）；P2：5’-CCCAAGCTTGTGATGAG-
CAACTGGTAC-3’（Hind III）；A1：5’-CGACGCGTG-
ACAGACACTCACTTGGA-3’（Mlu I）；A2：5’-TGCA-
CTGCAGGTGATGAGCAACTGGTAC-3’（Pst I）。
采用 25 μL 反应体系，PCR 扩增条件：94 ℃
预变性 4 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72
℃延伸 45 s，循环 35 次，72 ℃后延伸 5 min。将
PcCHS1 基因正、反义片段的 PCR 产物纯化后分别
连接 pMD18-T 载体，将 PCR 验证正确的阳性重组
子进行酶切验证并测序。分别将测序正确的重组子
命名为 pMD18-T-P 和 pMD18-T-A。
2.3 RNAi 载体 pYLRNAi-PcCHS1 的构建
利用BamH I和Hind III对分别测序正确的重组
克隆质粒 pMD18-T-P 和 pYLRNAi 进行双酶切，用
回收的片段进行正义连接，16 ℃连接过夜，转化大
肠杆菌 DH5α 感受态细胞。选取长出的单菌落做
PCR 检测。检测出的阳性克隆摇菌提取质粒，将提
取出的质粒和测序正确的 pMD18-T-A，进行 Mlu I
和 Pst I 双酶切，用回收的片段做反义连接，获得
RNAi 载体 pYLRNAi-PcCHS1。将其转化大肠杆菌，
将已转化大肠杆菌的载体 pYLRNAi-PcCHS1 进行
菌落 PCR 扩增鉴定和酶切鉴定。
2.4 RNAi 载体导入农杆菌 EHA105 感受态细胞及
介导的遗传转化
用 CaCl2冻融法将 RNAi 载体 pYLRNAi-CHS 导
入农杆菌 EHA105 中，用于植物转化。采用农杆菌
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介导法转化虎杖茎尖组织，参照本课题组已经建立
的方法[10]进行。虎杖无菌苗的茎尖组织经过侵染、
筛选获得抗性芽，然后转至根诱导培养基使其长成
完整植株。
2.5 转基因虎杖的 PCR 检测
根据载体 pYLRNAi-PcCHS1 上潮霉素基因序
列设计引物用于阳性植株的检测。采用 CTAB 法提
取转基因虎杖叶片的基因组 DNA，并以其为模板，
利用潮霉素基因特异引物 HPTf（5’-CGCCGATGG-
TTTCTACAA-3’）和 HPTr（5’-GGCGTCGGTTTC-
CACTAT-3’）进行 PCR 检测。
2.6 转基因植株的 Northern-blotting 杂交检测
提取虎杖叶片总 RNA，用甲醛变性凝胶进行电
泳，之后将凝胶中的 RNA 转移至尼龙膜上，交联
5 min 固定 RNA。以引物（P1、P2）扩增的 PcCHS1
基因特异片段作为探针模板，探针标记、杂交及检
测参照本课题组已经建立方法[11]。
2.7 白藜芦醇苷的测定[11]
采用 HPLC 法测定转基因和对照植株叶片中白
藜芦醇苷的量，比较分析白藜芦醇苷量差异。取虎
杖叶片 0.3 g，经液氮研磨后，加入 3 mL 80%甲醇
避光浸提 12 h 后，待测。色谱柱为 SunFireTM C18
（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（25∶
75），体积流量为 1.0 mL/min，检测波长为 306 nm，
柱温为 25 ℃。测定重复 3 次，结果数据用 SPSS19
软件进行统计分析。
3 结果与分析
3.1 正义片段和反义片段的克隆
以 cDNA 为模板，用引物（P1、P2）对正义片
进行 PCR 扩增，用引物（A1、A2）对反义片段进行
PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果
显示扩增条带与预期 574 bp 的片段大小一致，初步
表明已获得这 2 个干扰片段（图 1）。

M-Marker 1-正义片段的 PCR 产物 2-反义片段的 PCR 产物
M-Marker 1-PCR products of sense fragment 2-PCR products of
anti-sense fragment
图 1 正反义片段的 PCR 产物
Fig. 1 PCR products of sense and anti-sense fragments
3.2 重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 的酶切鉴定
首先对重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 进行菌
落 PCR 鉴定，将鉴定正确的菌液提取质粒 DNA。
将阳性重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 用 Bam HI 和
Hind III 内切酶酶切，切出大小 574 bp 的正义片
段；将重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 用 Mlu I 和 Pst I
内切酶酶切，切出大小 574 bp 的反义片段（图 2）。
将重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 用 Bam HI 和 Mlu I
内切酶酶切，切出大小约 1 400 bp 的片段，符合
内含子（250 bp）加上正义片段和反义片段长度
（图 2）。以上结果表明目的片段已和 pYLRNAi 载
体成功连接。

M-Marker CK-重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 1-Bam HI 和 HindIII 酶切产物 2-MluI 和 PstI 酶切产物 3-BamHI 和 MluI 酶切产物
M-Marker CK-recombinant plasmid pYLRNAi-PcCHS1 1-Bam HI and HindIII digestion products 2-MluI and PstI digestion products 3-BamHI and MluI digestion products
图 2 重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 酶切验证
Fig. 2 Digestion verification of recombinant plasmid pYLRNAi-PcCHS1
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
574 bp
M 1 2
M CK 1 2 M 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp

200 bp
574 bp
1 400 bp
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3.3 转基因虎杖的 PCR 检测
取从抗性虎杖植株叶片中提取的 DNA 作为扩
增模板，用潮霉素基因特异引物 HPTf 和 HPTr 进行
PCR 扩增，电泳结果（图 3）表明，所检测的 5 个
株系在约 500 bp 处扩增到潮霉素基因特异片段，而
野生虎杖 DNA 样品未见目的带，初步验证这 5 个
株系为阳性植株。

M-Marker P- 重组质粒 pYLRNAi-PcCHS1 WT- 野生植株
C1～C5-转基因植株
M-Marker P-recombinant plasmid pYLRNAi-PcCHS1 WT-wild
type plant C1～C5-transgenic plants
图 3 转基因植株 PCR 检测
Fig. 3 PCR detection of transgenic plants
3.4 转基因虎杖 Northern-bloting 检测
为了考察 PcCHS1 基因 RNA 干涉效果，进一
步取虎杖叶片抽提总 RNA，以 PcCHS1 基因特异
片段为探针进行 Northern-bloting 分析。杂交结果显
示（图 4），对照植株有较强的杂交信号，而转基因
植株的杂交信号明显减弱，说明 PcCHS1 基因表达
在转基因虎杖中被抑制。

CK-空载体 pYLRNAi 转化植株 C1～C5-转基因植株
CK-plant transformed with pYLRNAi blank vector C1—C5-transgenic plants
图 4 转基因植株 Northern blotting 检测
Fig. 4 Northern blotting analysis of transgenic plants
3.5 转基因虎杖白藜芦醇苷的测定
利用 HPLC 法测定转基因虎杖植株叶片中白藜
芦醇苷的量（图 5）。结果显示，转基因植株叶片中
白藜芦醇苷积累量相比对照植株都显著提高，最高

与 CK 比较：差异显著，*P＜0.05 CK-空载体 pYLRNAi 转化植株
C1～C5-转基因植株
CK-plant transformed with pYLRNAi blank vector C1—C5-transgenic
plants * P＜0.05 vs CK group
图 5 转基因虎杖白藜芦醇苷的测定
Fig. 5 Determination of polydatin in transgenic plants
约为未转化植株中白藜芦醇苷量的 3.8 倍。以上结
果初步表明 PcCHS1 转录水平的降低有利于虎杖中
白藜芦醇苷的积累，说明 PcCHS1 在虎杖白藜芦醇
苷生物合成中起着重要调控作用。
4 讨论
内含子的有无、启动子的强弱和目的片段的大
小等会影响 RNA 沉默的效率[12]。很多研究证明，
强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双元
载体是导致 RNA 沉默的基本结构。Helliwell 等[13]
研究表明 RNAi 片段长度在 98～853 bp 都能有效地
抑制基因的表达，抑制效率可达到 90%。本研究使
用的 pYLRNAi 载体具有强组成型 35 S 启动子和内
含子（25 bp），实验设计的 PcCHS1 基因干涉片段
长度为 574 bp，本研究载体构建均采用了较为理想
的实验方案，也达到了较好的沉默效果。
目前对白藜芦醇生物合成途径的调控研究多基
于正向调控策略，即通过过量表达关键酶基因白藜
芦醇合酶提高目标植物中白藜芦醇或白藜芦醇苷
量。例如，来源于中国野生葡萄的白藜芦醇合酶基
因在葡萄栽培品种过量表达后，葡萄中白藜芦醇的
量提高了 5.5 倍[14]。苗晓燕等[15]诱导获得转白藜芦
醇合酶基因虎杖毛状根，转基因毛状根白藜芦醇苷
的量均得到显著提高，最高量是未转基因毛状根的
5 倍。
而本研究基于反向调控策略，构建 PcCHS1 基
因 RNAi 表达载体，并将其导入虎杖基因组中，抑
制 PcCHS1 基因的表达，以 PCR 及 Northern blotting
为手段对转基因植株进行了分子检测。野生虎杖中
的二苯乙烯类物质主要有白藜芦醇苷和白藜芦醇 2
种，糖基转移酶可促使白藜芦醇迅速转化为白藜芦
M P WT WT C1 C2 C3 C4 C5
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 200 bp
800 bp
500 bp
200 bp
CK C1 C2 C3 C4 C5
CHS1
rRNA
1 200
1 000
800
600
400
200
0 CK C1 C2 C3 C4 C5
*
* *
*
*
白
藜
芦
醇
苷
/(μ
g·
g−
1 )

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醇苷的形式贮存[15]。相关研究表明，二苯乙烯类物
质在虎杖中的存在形式以白藜芦醇苷为主，并且在
虎杖的根、茎、叶中白藜芦醇的量都远远低于白藜
芦醇苷的量[16-17]。所以本研究主要针对转基因植株
的白藜芦醇苷量进行了检测。结果显示转基因植株
中白藜芦醇苷积累量相比未转化植株都显著提高，
最高约为未转化植株中白藜芦醇苷量的 3.8 倍。最
终确定虎杖中 PcCHS1 基因的沉默有利于白藜芦
醇苷的积累。同时，也为提高虎杖中白藜芦醇苷量
提供一条重要的路线。
查耳酮合酶基因可用于植物的花色修饰，例
如运用 RNAi 技术抑制烟草查耳酮合酶基因表达
导致花青素量显著降低，造成花色的改变[18]。采
用 RNAi 技术抑制紫色矮牵牛的查耳酮合酶基因
表达，同样导致花青素量不同程度的降低，甚至
产生白色花朵[19]。另外，查耳酮合酶基因也可以用
于修饰种皮色泽，例如拟南芥查耳酮合酶基因突变
后 tt4 突变体种皮变成了透明种皮。狄曙玲等[20]借
鉴拟南芥透明种皮的分子生物学研究成果开展了甘
蓝型油菜种皮色泽分子机制的研究。最近研究还发
现，抑制西红柿查耳酮合酶基因表达，导致总黄酮
量减少，当总黄酮量小于 5%，造成了果实体积变
小和无籽西红柿 [21]。抑制蒺藜状苜蓿 Medicago
truncatula Gaertn.查耳酮合酶基因的表达则阻碍苜
蓿毛状根根瘤的形成，并影响激素运输[22]。
本研究中观察到同对照植株相比，转基因虎
杖植株的茎杆表皮颜色明显变浅，此形态变异仍
然需要继续观察。同时，后续工作将会围绕转基
因植株生理表型的变化做深入研究，例如测定转
基因植株的总黄酮、花青素、柚皮素等成分的量，
更全面地考察查耳酮合酶基因对虎杖次生代谢途
径的影响。
目前，关于虎杖代谢网络的调控研究的相关报
道还不多，尤其对合成途径中查耳酮合酶基因的功
能以及该基因在生物合成途径中的作用知之甚少。
本研究的开展为白藜芦醇生物合成途径的深入了解
和虎杖资源的深度开发奠定基础。
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