全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 17 期 2016 年 9 月

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人参 PgMYB4 基因表达载体构建及其对拟南芥的抗旱性分析
孟祥宇，谢红梅，才可新，王思明，张丽轩，宋 岩，张 惠*
长春中医药大学 中医药与生物工程研究开发中心，吉林 长春 130117
摘 要：目的 构建人参 PgMYB4 基因表达载体，并研究该基因对拟南芥的抗旱功能。方法 采用 RT-PCR 技术克隆人参
PgMYB4 基因，构建表达载体，通过农杆菌介导的花序浸蘸法将其转化到拟南芥中，获得转基因拟南芥，以野生型拟南芥
作对照，检测植株与抗旱相关的生理指标。结果 获得的人参 PgMYB4 基因全长为 735 bp，编码 245 个氨基酸，预测其相
对分子质量为 27 914；在干旱胁迫条件下，转基因拟南芥的生长状态明显优于野生型拟南芥，与野生型相比，转基因拟南芥
叶片相对叶绿素量降低幅度小、脯氨酸量显著升高、水丢失率较低。结论 人参 PgMYB4 基因具有抗干旱胁迫的能力。
关键词：人参；PgMYB4 基因；表达载体构建；转基因拟南芥；干旱胁迫
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)17 - 3094 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.17.022
Construction of expression vector of PgMYB4 gene in Panax ginseng and analysis
on drought resisting
MENG Xiang-yu, XIE Hong-mei, CAI Ke-xin, WANG Si-ming, ZHANG Li-xuan, SONG Yan, ZHANG Hui
Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center, Changchun University of Traditional Chinese
Medicine, Changchun 130117, China
Abstract: Objective To construct the expression vector of PgMYB4 gene in Panax ginseng and study its function of the drought
resisting in Arabidopsis thaliana. Methods A P. ginseng gene PgMYB4 was cloned by RT-PCR analysis, further, recombinant
plasmid vector with PgMYB4 was transformed into wild-type plants of A. thaliana by Agrobacterium tumefacies-mediated Floral Dip
method. Transgenic A. thaliana with the expression of PgMYB4 was obtained, further compared with wild-type plants of A. thaliana,
their determination of physiologic index related to drought stress was detected. Results The cDNA (named a PgMYB4) contained a
735 bp open reading frame, encoded 245 amino acids and the predicted molecular weight was 27.914 KDa; Under the condition of
drought stress, the growth of transgenic A. thaliana was obviously better than wild-type A. thaliana. Compared with wild-type A.
thaliana, the decreased range of relative chlorophyll content in the leaves of transgenic plants of A. thaliana was smaller and the proline
content of transgenic plants of A. thaliana increased significantly. The water loss of transgenic plants of A. thaliana was less than that
of Wild-type transgenic plants of A. thaliana. Conclusion Ginseng PgMYB4 gene has the ability of resistance to drought stress.
Key words: Panax ginseng C. A Mey.; PgMYB4 gene; expression vector construction; transgenic Arabidopsis thaliana; drought stress

人参 Panax ginseng C. A Mey. 是多年生草本植
物，在我国有“百草之王”的美誉。近年来随着其
在多种行业中的广泛应用，市场需求量与日俱增，
然而人参的生长条件苛刻，在漫长的生长周期中极
易受到各种环境因素影响，尤其是在干旱条件下会
导致一系列病害发生，进而影响其产量和质量，因
此提高人参抗旱能力对人参增产增质至关重要。
大量研究表明植物中许多转录因子都参与植物
对激素和环境因子的应答，并对细胞分化、器官形
成、植物叶片形态建成及抗病等具有重要的调节作
用[1-6]。MYB 转录因子是植物转录因子家族中的最
大家族之一，几乎在所有真核生物中都有发现。
MYB转录因子在其N端都具有高度保守的DNA结
合结构域，通常由 1～4 个不完全重复序列（R）组
成[7-8]。根据含有 R 片段的个数不同，MYB 转录因
子家族又分为 4 个亚类[9]。MYB4 属于 R2R3-MYB

收稿日期：2016-01-06
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（81503212）；吉林省省级经济结构战略调整引导资金专项项目（2014N155）
作者简介：孟祥宇（1990—），女，在读硕士，研究方向为中药学。Tel/Fax: (0431)86172300 E-mail: 794451770@qq.com
*通信作者 张 惠，女，助理研究员，博士研究生，研究方向为中药学。Tel/Fax: (0431)86172300 E-mail: 114193536@qq.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 17 期 2016 年 9 月

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亚类，是调控非生物胁迫应答反应的关键转录因子
之一。2005 年，Monica 等[10]研究表明，水稻 Osmyb4
过表达能够诱导转基因拟南芥体内 P5CS 基因表达
量升高，导致脯氨酸量增多，从而提高转基因植物
抵抗干旱胁迫的能力，同时在该基因过表达的植物
体内积累了大量糖类等能量物质，更加增强了该植
物抵御干旱胁迫的能力。2008 年，Gemma 等[11]将
水稻 Osmyb4 转化到苹果植物中，由于该基因的过
表达改善了植物在干旱及低温环境下生理和生化的
适应能力，并积累大量代谢产物，提高了对干旱及
低温的耐受性。
前期实验通过对人参进行转录组测序，建立了人参
转录组数据库，从而得到人参MYB4 基因（PgMYB4）
序列，本实验在此基础上构建表达载体并将其转入到
拟南芥中，对转基因拟南芥的抗旱性进行检测，以期
为人参 PgMYB4 基因的开发与利用提供科学依据。
1 材料
样品采自吉林省抚松县人参种植产业基地，经笔
者鉴定为 5 年生人参 Panax ginseng L.；拟南芥
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 种子由本实验室保
存。植物表达载体 pCAMBIA1303、二抗（AP 标记的
羊抗兔 IgG）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公
司；PgMYB4 多克隆抗体定制于吉尔生化有限公司；
琼脂糖胶回收试剂盒购自天根公司；T4 DNA 连接酶、
PCR 试剂盒、反转录试剂盒、克隆载体 pMD18-T、
各种限制性内切酶均购自 TaKaRa 公司。
2 方法
2.1 PgMYB4 基因表达载体的构建
采用改良的 Trizol 法提取人参总 RNA。参考
TaKaRa 反转录试剂盒说明书反转录合成 cDNA。设
计特异性引物 MYB4-F：TGCTCTAGAATGGTGA-
GAGCTCCTTGCTGTG，MYB4-R：CGCGGATCC-
GAATTCAGGTAAGTCCCCAGCT，以 cDNA 为模
板进行 PCR 扩增。构建克隆载体 pMD18-T-PgMYB4，
并转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，筛选阳性
克隆进行测序鉴定，用限制性内切酶 Xba I 和 BamH
I 酶 切 重 组 质 粒 pMD18-T-PgMYB4 和 载 体
pCAMBIA1303，分别回收目的基因片段和表达载
体片段，经 T4 DNA 连接酶 16 ℃过夜连接，转化
到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，并通过 PCR、酶
切和测序进行鉴定。
2.2 转基因拟南芥的获得及分子鉴定
2.2.1 转基因拟南芥的获得 通过冻融法将重组质
粒转化到农杆菌 Agl0 感受态中，利用花序浸蘸法对
处于花蕾期的野生型拟南芥进行侵染。将收获的 T0
代种子进行消毒，均匀播种于 MS 培养基（含 60
mg/L 潮霉素）中培养，待抗性植株生长至 4 叶期后
转至营养土中培养，收取 T3 代进行分子鉴定。
2.2.2 转基因拟南芥 RNA 检测 采用 CTAB-LiCl
法提取转基因拟南芥及野生型拟南芥总 RNA，反转
录成 cDNA。以 cDNA 作为模板，对 PgMYB4 基因
进行 PCR 检测。
2.2.3 转基因拟南芥Western-blotting检测 用蛋白
提取液（含 10 mmol/L Tris pH 8.0、0.05 mmol/L
SDS、10 mmol/L DTT、5 mmol/L EDTA）提取转基
因拟南芥及野生型拟南芥总蛋白。总蛋白经
SDS-PAGE 电泳进行分离，转至硝酸纤维素膜，再
用 3%奶粉封闭 1 h，一抗（以人参 PgMYB4 蛋白部
分肽段 CDNSGDTTDFNRGA 免疫家兔获得多克隆
抗体）4 ℃孵育过夜，二抗（AP 标记的羊抗兔 IgG，
1∶1 000 稀释）室温培养 1 h，BCIP/NBT 避光显色
15 min，检测 PgMYB4 蛋白表达。
2.3 转基因拟南芥抗旱性检测
2.3.1 干旱胁迫处理 4 周的转基因拟南芥在正常
光照下不给水 14 d，观察其表型变化，再正常给水
恢复 1 周观察其表型变化。
2.3.2 生理指标检测 在干旱胁迫第 5 天时，测量
植物莲座叶片叶绿素量及植物体内游离脯氨酸量，
叶绿素量用叶绿素测定仪测定，游离脯氨酸量参照
Bates 等[12]方法测定。
2.3.3 水丢失检测 将植物的地上部分放在培养
皿中，并置于人工气雾箱中培养（25 ℃，相对湿度
60%），每隔 20 min 测其质量，共监测 3 h。
3 结果与分析
3.1 PgMYB4 基因表达载体的构建
琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR 扩增片段在约
735 bp 处出现与预期大小一致的单一条带（图 1-a），
该片段与 pCAMBIA1303表达载体连接后经PCR检
测，在约 735 bp 处有明显条带，与图 1-a 一致；双
酶切结果显示，在约 735 bp 和 13 002 bp 处出现预
期大小的 2 条清晰条带（图 1-b）；测序结果显示，
PgMYB4 基因序列完全正确，未发生突变等变化。
上述结果表明载体构建成功。经测序得到 PgMYB4
基因的全长为 735 bp，其含有 1 个完整的编码区，
编码 1 条长度为 245 个氨基酸的多肽链，预测其相
对分子质量为 27 914。
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1-PgMYB4 基因 2-pCAMBIA1303-PgMYB4 双酶切 M-Marker
1-PgMYB4 gene 2-pCAMBIA1303-PgMYB4 digested with Xba I
and BamH I M-Marker
图1 PgMYB4基因PCR扩增 (a) 和pCAMBIA1303-PgMYB4
酶切鉴定 (b)
Fig. 1 P. ginseng PCR amplification of PgMYB4 gene (a)
and enzyme analysis on pCAMBIA1303-PgMYB4 (b)
3.2 转基因拟南芥的获得及分子鉴定
PCR 产物经凝胶电泳检测，结果显示转基因
拟南芥能扩增出目的基因条带，而野生型拟南芥
不能扩增出该条带（图 2-a）。Western-blotting 检
测结果显示，转基因拟南芥在 25 000～37 000 出
现清晰条带，而野生型拟南芥未见该条带（图
2-b）。以上结果表明导入拟南芥的 PgMYB4 基因
能够成功进行蛋白表达。

Col-0-野生型拟南芥 T-1～T-3-转基因拟南芥 M-Marker
Col-0-wild-type Arabidopsis thaliana T-1—T-3-transgenic
Arabidopsis thaliana M-Marker
图2 转基因拟南芥PCR检测 (a) 和Western-blotting检测 (b)
Fig. 2 PCR analysis (a) and Western blotting analysis (b)
on transgenic plants of A. thaliana
3.3 转基因拟南芥抗旱性分析
3.3.1 干旱胁迫下植株表观分析 持续不浇水 5 d，
转基因拟南芥和野生型拟南芥表型差异不明显，持
续不浇水 14 d，野生型拟南芥出现严重枯萎现象，
而转基因拟南芥仅出现黄叶现象（图 3），再正常给
水恢复 1 周，野生型拟南芥因严重缺水而没有恢复，
而转基因拟南芥则恢复正常。
3.3.2 生理指标检测 叶绿素量检测结果显示，在
正常条件下，转基因拟南芥与野生型拟南芥叶片相
对叶绿素量相似，二者无明显差异，干旱胁迫 5 d

T-转基因拟南芥 Col-0-野生型拟南芥，下同
T-transgenic A. thaliana Col-0-wild-type A. thaliana, same as below
图 3 干旱胁迫下拟南芥表型分析
Fig. 3 Phenotypic analysis on A. thaliana under drought stress
后，与胁迫前相比转基因拟南芥叶绿素量仅下降
2.62%，而野生型拟南芥则下降了 14.25%（图 4-a）。
脯氨酸量检测结果显示，在正常条件下，转基因拟
南芥与野生型拟南芥体内游离脯氨酸量相似，二者
无明显差异，干旱胁迫 5 d 后，二者脯氨酸量明显
增加，野生型拟南芥脯氨酸量增加了 1.33 倍，而转
基因拟南芥脯氨酸量则增加了 2.38 倍（图 4-b）。水
丢失检测结果显示：经 3 h 监测转基因拟南芥地上
部分水丢失率为 50.63%，而野生型拟南芥地上部分
水丢失率达到 64.23%（图 4-c）。
4 讨论
拟南芥是基因功能鉴定的模式植物，通过转基
因技术将基因转入拟南芥中进行相关检测，是鉴定
未知功能基因的一种常用方法[13]。本研究在前期工
作基础上成功构建了 PgMYB4 基因表达载体，并将
其转化到模式植物拟南芥中进行基因功能研究，大
大缩减了研究周期。
叶绿素是植物进行光合作用的重要功能物质，
1000 bp
700 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
1000 bp
700 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
1 M 2 M a b
1000 bp
700 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
5.0×104
3.7×104
2.5×104
2.0×104
a bCol-0 T-1 T-2 T-3 M Col-0 T-1 T-2 T-3
T Col-0 T Col-0 T Col-0
干旱前 干旱前 干旱 14 d 干旱 14 d 再浇水 再浇水
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与 Col-0-野生拟南芥比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs Col-0-wild-type Arabidopsis thaliana
图 4 干旱胁迫下拟南芥叶片相对叶绿素量 (a)、脯氨酸量 (b) 和水丢失率 (c)
Fig. 4 Relative chlorophyll content (a), proline content (b), and water loss rate (c) of A. thaliana under drought stress
其量的高低直接影响植物光合作用的强弱，叶绿素
量变化在一定程度上可以反映植物的生产性能和抵
抗逆境胁迫的能力，当植物叶片严重缺水时，叶绿
体片层结构受损，从而使叶绿素量降低，因此叶绿
素量变化可以指示植物对干旱胁迫的敏感程度[14]。
本研究显示，在干旱胁迫条件下，野生型拟南芥叶
绿素量明显降低，而转基因拟南芥叶绿素量降低幅
度较小，说明转基因植株耐旱能力更强。
脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，在逆境条件
下，植物体内脯氨酸的量显著增加，当受到干旱胁
迫时，抗旱性强的植物往往积累较多的脯氨酸，因
此脯氨酸量可以作为检测植物抗旱性的生理指标。
本研究显示，在干旱胁迫条件下，相比野生型，转
基因拟南芥中积累了更多的脯氨酸，说明转基因植
株能更好地对抗干旱胁迫。通过比较野生型和转基
因拟南芥地上部分的水丢失率，发现转基因拟南芥
的水丢失率明显低于野生型，由此推测可能是由于
PgMYB4 基因的导入促使叶片更多的气孔关闭，从
而减少水分流失，以提高干旱耐受性。综上，本研
究证明了 PgMYB4 基因能显著提高植株的耐旱能
力，可为人参抗旱育种提供候选基因。
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100
50
0
300
200
100
0
80
60
40
20
0
Col-0 Col-0 Col-0
T T T
干旱前 干旱 5 d 干旱前 干旱 5 d 0 60 120 180
t/min
相
对
叶
绿
素
量
/%

脯
氨
酸
量
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g·
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1 )
水
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率
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﹡
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