全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 16 期 2014 年 8 月

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党参转录组中 SSR 位点信息分析
王 东，曹玲亚，高建平*
山西医科大学药学院，山西 太原 030001
摘 要：目的 采用生物信息学方法分析党参转录组文库 EST 序列简单重复序列（SSR）位点，快速、大规模鉴定党参功
能性 SSR。方法 使用 MicroSAtellite（MISA）软件分析党参高通量转录组 SSR 的分布频率和重复基元的类型特征，利用
软件 Primer3 设计引物，并通过 SSRFinder 校验 SSR，筛选 SSR 引物。结果 从 45 511 条 Unigenes 中共搜到 7 327 个 SSR
位点，分布在 6 017 条 Unigenes 序列中，发生频率为 12.22%，共有 415 种重复基元，平均每 4 520 bp 含 1 个 SSR 位点，二
核苷酸重复占主要地位，发生频率为 58.67%，在所有重复基元中，AG/CT 出现频率最高。共获得 4 329 条 SSR 引物。结论
大规模的 SSR 分子标记开发将有助于党参遗传多样性与分子育种研究。
关键词：党参；转录组；SSR；MicroSAtellite 软件；引物
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)16 - 2390 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.021
Data mining of simple sequence repeats in Codonopsis pilosula transcriptome
WANG Dong, CAO Ling-ya, GAO Jian-ping
College of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract: Objective To rapidly and largely identify the functional simple sequence repeat (SSR) in transcriptome dataset of
Codonopsis pilosula based on bioinformatics analysis. Methods MicroSAtellite (MISA) sofeware was used to analyze the
distributing frequency of high-flux transcriptome SSR and the basic characteristics of repeat motifs. Primers were designed using
Primer3, and SSRFinder was used to check SSR and screen the SSR primers. Results SSR loci (7 327) were obtained from 45 511
unigenes, distributed in 6 017 unigenes (12.22%). There are 415 kinds of repeat motifs existing in C. pilosula transcriptome. On
average, SSRs occurred every 4 520 bp in length. Dinucleotid repeats predominated with an occurrence frequency of 58.67%, and
AG/CT was the most frequent one among all the repeat types. A total of 4 329 primer pairs were designed for marker development.
Conclusion The large number of SSR genetic markers developed in the present study should contribute greatly to research into
genetic diversity and germplasm characterization in C. pilosula.
Key words: Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf; transcriptome; simple sequence repeat; MicroSAtellite; primer

党参为桔梗科党参属党参 Codonopsis pilosula
(Franch.) Nannf、素花党参 C. pilosula Nannf. var.
modesta (Nannf.) L. T. Shen 或川党参 C. tangshen
Oliv. 的干燥根，性平、味甘，具有补中益气、健脾
益肺之功效[1]。党参产地众多，种类各异，主产于
山西、甘肃、陕西、四川、湖北等省，主要为栽培
品，少量为野生。目前我国党参资源破坏严重，野
生资源逐渐变得稀少，急需对药源进行保护[2]。利
用分子标记对其遗传学背景进行研究，研究结果可
对制定合理有效的保护策略提供科学依据。
目前尚缺乏党参遗传和基因组信息研究，遗传
多样性研究和分子标记研究也只有张建清等[3]利用
RAPD 分析甘肃栽培的党参和素花党参在居群水平
上的遗传多样性；李忠虎等[4]利用 g-SSR 技术分析发
现党参野外居群具有较丰富的遗传多样性水平，并
且筛选出 5 对 g-SSR 引物能够在党参 4 个近缘物种
成功扩增；赵莎等 [5]曾采用党参药材中提取的
ITS/ITS2 序列对党参药材及其混淆品进行鉴定，但
不能成功鉴别党参 3 个基原物种；He 等[6]利用
ITS/ITS2 序列分析从甘肃和重庆搜集的 65 个党参样

收稿日期：2014-03-24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81072987）；国家“十二五”科技支撑计划（2011BAI07B07）
作者简介：王 东（1989—），男，山西阳曲人，在读硕士，研究方向为中药资源及其活性成分研究。
*通信作者 高建平（1963—），女，山西阳泉盂县人，教授，硕士研究生导师，研究方向为中药资源及其活性成分研究、中药鉴定新技术与
中药质量评价。Tel: (0351)4690345 E-mail: jpgao123@sina.com
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本，成功鉴别党参 3 个基原物种；苏强等[7]初步建立
党参 AFLP 分析体系。目前还缺乏能够大量应用于党
参种质鉴定、遗传图谱构建、功能基因定位等研究的
简便、高效、稳定且具有种属特异性的分子标记体系。
简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）又
称微卫星 DNA，SSR 标记是较为理想的遗传标记，
具有数量丰富、分布广泛、多态性强和共显性遗传易
于分析等特点[8]。SSR 按来源分，有基因组 SSR
（g-SSR）和转录组来源的 SSR（EST-SSR），相对于
g-SSR，EST-SSR 标记无需构建基因组文库、杂交、
测序，避免了大量人力、物力和时间的投入，同时
EST-SSR 多态性可能与基因功能直接相关，在相近植
物间具有良好通用性[9]，而且转化率也高。目前药用
植物中已有人参[10]、丹参[11]、西洋参[12]和金银花[13]
等借助现有测序数据开发了 EST-SSR。研究主要集中
于遗传多样性评价、种质鉴定、标记通用性等方面。
为此，本研究基于党参转录组文库高通量测序结果，
利用 MicroSAtellite（MISA）[14]软件搜索党参 SSR 位
点，分析其分布、组成特征，并进行初步可用性评价，
以期为党参遗传图谱构建、遗传多样性分析、功能基
因定位和比较作图等研究提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 党参转录组数据来源
转录组测序样本采自于山西省晋城市陵川县党
参 GAP 基地，原植物由山西医科大学药学院高建
平教授鉴定为党参 Codonopsis pilosula (Franch.)
Nannf。党参转录组数据来自于课题组前期利用
Illumina 高通量测序平台对党参进行的全转录组测
序，共有 45 511 条 Unigenes。
1.2 党参 EST-SSR 的筛选
为了检测党参中的 SSR 位点，使用软件
MISA[14]对组装得到的Unigene序列进行 SSR分析。
所检测 SSR 位点包括单核苷酸重复、二核苷酸重
复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复
和六核苷酸重复 6 类。判断标准为单核苷酸重复至
少 12 次；二核苷酸重复至少 6 次；三核苷酸重复、
四核苷酸重复至少 5 次；五核苷酸重复和六核苷酸
重复至少 4 次。
1.3 党参 EST-SSR 引物设计
使用软件 Primer3 对 SSR 重复单元前后的序列
设计引物，每条 SSR 产生 5 条引物。主要的引物设
置参数如下：扩增产物长度 80～300 nt，引物序列
长度 18～28 nt（最适宜长度为 23 nt），退火温度为
55～65 ℃（最佳退火温度为 60 ℃），GC 量为
40%～65%（最适宜为 50%）。
1.4 党参 EST-SSR 引物筛选
将设计出的引物通过以下方式筛选：（1）引物
不能存在 SSR；（2）将获得的引物比对到 Unigene
序列，引物的 5’端允许有 3 个碱基的错配，3’端允许
有 1 个碱基的错配；（3）去掉比对到不同 Unigene
上的引物，筛选唯一匹配的引物；（4）使用 SSRFinder
校验 SSR，使用产物序列来寻找 SSR，检验结果是
否与 MISA 结果相同，并筛选出相同的 SSR 产物。
2 结果与分析
2.1 党参转录组中的 SSR 位点的数量与分布
利用软件 MISA 对党参转录组中的 45 511 条
Unigenes 的 cDNA 序列进行搜索。结果显示，7 327 个
SSR 分布于 6 017 条Unigenes 序列中，SSR 发生频率
（含有 SSR 的Unigene 数目与总Unigene 的数目之比）
为 12.22%，出现频率（检出 SSR 个数与总Unigene 数
目之比）为 16.10%。平均每 4 520 bp 就含有 1 个 SSR
位点（表 1）。其中 5 006 条Unigenes 只包含单个 SSR
位点，1 011 条Unigenes 包含 2～4 个 SSR 位点。
党参 EST-SSR 重复类型丰富，单核苷酸至六核
苷酸重复都可以发现。从 SSR 位点数量上看，出现
最多的为一至三核苷酸重复，占到总 SSR 位点数量
的 94.1%。其中二核苷酸重复比例最高，可以占到
58.7%；其次为三核苷酸和单核苷酸重复，分别为
21.6%和 13.8%。四、五、六核苷酸重复类型的数量
很少，总计不足 6%（表 1）。
表 1 党参 EST-SSR 不同重复基元分布情况
Table 1 Distribution of different repeat motifs in C. pilosula transcriptome
重复类型 SSR 数 占总 SSR 比例 / % 发生频率 / % 平均长度 / bp 总长度 / bp 平均距离 / kb
单核苷酸 1 012 13.81 2.22 15.42 15 601 32.74
二核苷酸 4 299 58.67 9.45 16.03 68 896 7.71
三核苷酸 1 585 21.63 3.48 16.75 26 547 20.91
四核苷酸 71 0.97 0.16 20.85 1 480 466.70
五核苷酸 109 1.49 0.24 20.64 2 250 304.00
六核苷酸 251 3.43 0.55 24.00 6 024 132.01
总计 7 327 100.00 16.10 16.49 120 798 4.52
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党参转录组中 SSR 位点的序列总长度达到
120 798 bp，SSR 位点平均长度为 16.49 bp，各类
型 SSR 位点的平均长度分别为 15.42、16.03、16.75、
20.85、20.64、24.00 bp。党参转录组中 SSR 位点重
复次数以 6 次（1 466）最多，占总 SSR 的 20%；
其次为重复次数 7、5、10、9 和 8 次，SSR 位点个
数在 706～1 006。统计 4～10 次重复的 SSR 位点共
有 6 101 个，占 83.2%；11～24 次重复的 SSR 位点
共有 1 226 个，占 16.7%（图 1）。
2.2 党参 EST-SSR 的特性
在党参转录组7 327个SSR位点中，共发现到415
种重复基元，其中一至六核苷酸重复基元分别有 2、4、
10、18、48 和 122 种（表 2）。以二核苷酸重复基元
AG/CT 最多，总 SSR 的 43.78%；其次为二核苷酸
重复基元 AC/GT 和单核苷酸重复基元 A/T，分别占

图 1 党参 EST-SSR 重复次数分布图
Fig. 1 Distribution of EST-SSR repeat frequency
in C. pilosula transcriptome
11.83%和 10.65%；二核苷酸重复基元中，以AG/CT、
AC/GT 和 AT/AT 出现的数量最多，三者共占二核苷
酸 SSR 的 99.88%，CG/CG 出现次数最少，仅占到
二核苷酸 SSR 的 0.12%。在三核苷酸重复基元中，
表 2 党参 EST-SSR 重复基元的类型
Table 2 EST-SSR repeat motifs in C. pilosula transcriptome
重复类型 重复基元 重复个数 发生频率 / % 所占比例 / %
A/T 780 1.71 10.65 单核苷酸
C/G 232 0.51 3.17
AG/CT 3 208 7.05 43.78
AC/GT 867 1.91 11.83
AT/AT 219 0.48 2.99
二核苷酸
CG/CG 5 0.01 0.07
AAG/CTT 439 0.96 5.99
ACC/GGT 311 0.68 4.24
ATC/ATG 226 0.50 3.08
AGG/CCT 180 0.40 2.46
AGC/CTG 122 0.27 1.67
AAC/GTT 112 0.25 1.53
CCG/CGG 72 0.16 0.98
AAT/ATT 59 0.13 0.81
ACG/CGT 33 0.07 0.45
三核苷酸
ACT/AGT 31 0.07 0.42
AAAG/CTTT 13 0.03 0.18
ACAT/ATGT 12 0.03 0.16
AAAT/ATTT 7 0.02 0.10
AGCC/CTGG 7 0.02 0.10
AAAC/GTTT 5 0.01 0.07
四核苷酸
剩余四核苷酸 27 0.06 0.37
AAAAG/CTTTT 10 0.02 0.14
AAAAT/ATTTT 10 0.02 0.14
AAAAC/GTTTT 8 0.02 0.11
AAGAG/CTCTT 8 0.02 0.11
AAATC/ATTTG 6 0.01 0.08
五核苷酸
剩余五核苷酸 67 0.15 0.91
AAAGAG/CTCTTT 11 0.02 0.15
AAAAAG/CTTTTT 7 0.02 0.10
AAGAGG/CCTCTT 7 0.02 0.10
AAGCCC/CTTGGG 7 0.02 0.10
AAGGAG/CCTTCT 7 0.02 0.10
六核苷酸
剩余六核苷酸 212 0.47 2.89
1 600
1 200
800
400
0
SS
R
位
点
个
数

4 5 6 7 8 9 10 11～24
重复次数
346
1 024
1 466
1 006
706 707 756
1 226
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AAG/CTT 出现次数最多占三核苷酸 SSR 的 27.7%；
其次是 ACC/GGT、ATC/ATG 和 AGG/CCT，分别
为 19.62%、14.26%和 11.36%。其他四核苷酸、五
核苷酸和六核苷酸重复基元类型较多，数量较少，
出现频率均较低。
2.3 党参 EST-SSR 的可用性评价
SSR 分子标记的多态性是判断其可用性的重要
依据[15]。SSR 的长度是影响其多态性高低的重要因
素，当 SSR 长度大于或等于 20 bp 时多态性较高，
长度在 12～20 bp 的 SSR 多态性中等，而长度在 12
bp 以下时多态性极低[16]。党参 EST-SSRs 的长度在
12～25 bp，其中长度在 12～20 bp 的 SSR 有 6 483
条，占 SSR 总数的 88.48%，这类 SSR 位点具有中
等多态性；而长度在 20 bp 以上的 SSR 达到 844 条，
占 SSR 总数的 11.52%，这类 SSR 具有较高多态性。
此外，根据 Dreisigacker 等[17]的发现，高级基元 SSR
多态性普遍比低级基元的低。经统计发现，长度在
20 bp 以上的党参 EST-SSR 中，包含低级基元一、
二、三核苷酸 SSR 共 564 条。可以预计这部分多态
性潜能高的 SSR 在党参上应具有较高的利用价值。
2.4 党参 EST-SSR 引物设计与筛选
为 进 一 步 在 实 验 中 利 用 筛 选 出 的 党 参
EST-SSR，本课题组使用 Primer3 软件对上下游序
列均不小于 150 bp 的 EST-SSR 设计引物，每条序
列产生 5 对引物，共有 1 484 条党参 EST-SSR 序列
获得 7 420 对引物。通过去除不符合条件的引物，
并将产物序列利用 SSRFinder 校验，检验结果是否
与 MISA 结果一致，最终筛选出引物。结果表明，
共有 848 条党参 EST-SSR 序列成功设计出 4 329 对
引物（表 3），占到党参 EST-SSR 总数的 8.6%。其
中 20 bp 以上 EST-SSR 序列且包含低级基元一、二、
三核苷酸共设计 226 对引物。
表 3 党参 EST-SSR 引物序列
Table 3 EST-SSR primer sequences in C. pilosula
重复基元及类型 上游引物 (5’-3’) 下游引物 (5’-3’) 产物长度 / bp
TCA (3*5) TAAAGAATCACTTGGGGAGTCTG ATGGACAGAACATTGCAAAACTT 127
AG (2*9) GAGAATTATGACCTTGAGAAGCG GATTCTGCGCTACAATCAAAATC 128
TGA (3*6) ATAAGGACAATACATCCACAGGG CTTCAAGTTCATTCAACTCGTCC 129
AACGAA (6*4) AGGACCCGTTCTTTGATGATATT CAATAGCAATGGCTGACTTATCC 154
GAA (3*5) GCACTTTATGGATATGATGCTCC GTGCTTCTGCTTCATCTCTGTTT 153
AG (2*9) GCGACATGAACTTGAAGAACTTT TGATCTAGTCATTCATGCTCTTCC 135
GAAGGA (6*4) GGTAGAAAAGACCTCCACCCTAA ACCCTTTTCTCTTTCCTTCTCCT 147
TCC (3*5) GGAATTCATCCTTACCATCAACA AAGAAGATCGTCCTAACCTCGTC 149
TCA (3*6) ACTTAGACTGCTCCACTTCATGC GGGTCCTAGAACCAACTTGAGAG 133
GA (2*9) AGTAAGTGGGATGATGAAAAGCA CGATTTCCTCCATTTCCTTCTAT 116
GAG (3*6) TTTTCTAAGGACAGTTGTGGTGG CTTATCATCAGTGCTGACCTGTG 132
TGG (3*5) GGAAGTAGACCAAGAGTGGGAGT TTGATTCTCAAACAAGTGTCACG 132
CAC (3*6) TCATCCATTGCAACCTAATCAGT TTAGAACTAGGAGCTGCACCATT 138
GA (2*10) TCTTGCTTCTCAAAGATACGACC CTAGCAGGTGAAAGCAAACACTA 134

3 讨论
党参转录组中共搜索到 7 327 个 SSRs，平均出
现频率为 1/4 520。与其他药用植物比较，党参 SSR
出现的频率低于丹参（1/2 100）[11]，高于人参[10]
（1/5 800）、金银花[13]（1/7 490）、西洋参[12]（1/7 500）
和杜仲[18]（1/11 610）；同时与模式植物比较，也高于
拟南芥（1/13 830）、大豆（1/7 400）、杨树（1/14 000）
和棉花（1/20 000）[19]等植物，这表明党参转录组
中 SSR 数量很丰富。
根据已有报道，大多数植物的 EST-SSRs 以三
核苷酸和二核苷酸重复类型为主，但主要的重复基
元类型有所差异[15]。研究发现党参 EST-SSR 以二核
苷酸为最多的重复基元，其次是三核苷酸重复，这
与人参、丹参以及茶树 EST-SSR 中的优势重复类型
是一致的。从出现的频率来看，各种不同的重复基
元出现最多的是 AG/CT，其次是 AC/GT 和 A/T。
GC 重复基元在多数植物中很难见到，但出现频率
都极低[15]。在党参转录组中仅找到 5 个 GC 重复，
出现频率也极低。此外，党参转录组中长度在 20 bp
以上的 SSR 达到 844 条，占 SSR 总数的 11.52%，
并且其中有 66.82%是多态性潜能高的低级基元一、
二、三核苷酸 SSR，这部分 SSR 可能具有较高的利
用价值。
对遗传学背景研究取决于合适的遗传分析工具
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的选择。而分子标记技术中，RAPD 技术重复性差、
不稳定；AFLP 虽然稳定可靠，但成本高、对 DNA
质量要求高，实验程序复杂、工作量大；ITS 条形
码仅可用于药用植物及其易混伪品的鉴定。相比之
下 SSR 标记具有共显性、高度可重复、多态性丰富、
对 DNA 质量要求低、可通过 PCR 快速检测，是遗
传学背景研究非常有效的工具。缺点是 SSR 标记
具有特异性，必须进行 PCR 检测，存在引物开发
问题[20]。本实验对所获得的党参 EST-SSR 利用软件
设计引物，方法快速、通量大、成本低，并通过筛
选共获得 4 329 对 SSR 引物，为党参的 SSR 分析奠
定数据基础。
本研究结果表明党参转录组数据是 SSR 重要
来源之一，与基因组 SSR 相比，EST-SSR 反映了基
因组的编码区域，可直接获得基因表达的信息，省
去了 SSR 引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分
利用了现有测序数据，降低了开发成本。同时也明
确了党参 EST-SSR 的基本特征，为进一步开发新的
党参功能基因 SSR 标记奠定了基础。党参 EST-SSR
对于党参功能基因资源的开发利用、遗传资源评价、
丰富其分子标记、种质资源改良和比较基因组学研
究都具有重要的价值。
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