全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月

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大花红景天再生体系的优化及抗性筛选
王莉莎 1，蔡翠萍 1，常 凯 2, 4，廖志华 2, 3，兰小中 1*
1. 西藏大学农牧学院，西藏 林芝 860000
2. 西南大学 天然产物与代谢工程实验室，重庆 400715
3. 重庆市甘薯工程技术研究中心，重庆 400715
4. 成都军区总医院 临床实验医学研究与保障中心，四川 成都 610083
摘 要：目的 优化大花红景天再生体系并建立抗性筛选最佳条件，为建立大花红景天高效遗传转化体系奠定基础。方法 以
大花红景天叶片为外植体，观察再生过程各阶段在不同配比的 6-BA、NAA、IBA 诱导下的诱导率及生长状况，并利用梯度
筛选出外植体对卡那霉素（Kan）和抗潮霉素（Hyg）的抗性。结果 MS＋3.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro
为叶片不定芽分化的最佳培养基，分化率达到 92%；MS＋700 mg/L L-Pro 为根培养基；200 mg/L Kan、10 mg/L Hyg 为大花
红景天遗传转化的最佳筛选压；培养过程中添加 10 mg/L Vc 能有效抑制酚类物质的外泌。结论 优化了大花红景天植株再
生体系，筛选出适宜于大花红景天遗传转化体系的 Kan 和 Hyg 筛选压。
关键词：大花红景天；再生体系；褐化；抗性筛选；遗传转化
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2014)04 - 0558 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.04.020
Optimization of regeneration system and resistance screening of Rhodiola crenulata
WANG Li-sha1, CAI Cui-ping1, CHANG Kai2, 3, LIAO Zhi-hua2, 3, LAN Xiao-zhong1
1. Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University, Linzhi 860000, China
2. Laboratory of Natural Products and Metabolic Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China
3. School of Life Sciences, Chongqing Engineering & Technology, Research Center for Sweetpotato, Chongqing 400715, China
4. Center of Clinical Laboratory Medicine Research and Services, General Hospital of Chengdu Military Command, Chengdu 610083, China
Abstract: Objective To optimize the regeneration system of Rhodiola crenulata, to establish the optimal conditions for resistance
screening, and to lay the foundation for the establishment of the efficient genetic transformation system of R. crenulata. Methods The
leaves of Rhodiola crenulata were used as explants. The influences of different ratios of 6-BA, NAA, and IAA in the medium on callus
induction and growth conditions were observed, and the implant resistance of Kanamycin (Kan) and hygromycin (Hyg) was screened
by gradient method. Results MS + 3.0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA + 700 mg/L L-Pro was the optimal medium for the differentiation
of leaf adventitious bud and the differentiation ratio of adventitious bud reached 92%; MS + 700 mg/L L-Pro was the medium for
adventitious roots; The best selection of genetic transformation system for R. crenulata was 200 mg/L Kan and 10 mg/L Hyg; Adding
10 mg/L Vc could effectively inhibit the phenolic substances secretion. Conclusion The regeneration system of R. crenulata, is
optimized, and the pressure of Kan and Hyg for genetic transformation system of R. crenulata is screened.
Key words: Rhodiola crenulata (Hook. f. & Thomson) H. Ohba; regeneration system; browning; resistance screening; genetic transformation

大花红景天 Rhodiola crenulata (Hook. f. &
Thomson) H. Ohba 是景天科（Crassulaceae），红景
天属 Rhodiola L. 多年生的草本，具有肉质匍匐根
状茎，为珍稀的药用植物。大花红景天的主要药用
成分是红景天苷和酪醇，被誉为“高原人参”[1]。
药理研究表明，大花红景天具有抗缺氧、抗疲劳、

收稿日期：2013-11-05
基金项目：国家科技支撑计划（2011BAI13B06）；国家中医药管理局公共卫生专项（20120716-540000）
作者简介：王莉莎（1990—），女，硕士研究生，研究方向为高原生理生态研究。E-mail: lisa0894@163.com
*通信作者 兰小中 E-mail: lanxiaozhong@163.com
网络出版时间：2014-01-08 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.html
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抗辐射、抗病毒、抗肿瘤[2]、改善心血管系统等多
种功效，此外还具有延缓机体衰老，防止老年疾病
之功效，是一种具有广阔的发展前途的适用于特殊
地区开发的环境适应性药物。
近年来，随着对大花红景天的过度开发利用，
野生状态的大花红景天资源受到了严重的威胁。采
用组织培养技术，快速繁育大花红景天植株幼苗是
解决资源短缺的重要途径[3]。本实验以大花红景天
无菌苗为实验材料，优化再生体系，建立抑制褐化
方法并筛选出叶片对卡那霉素（Kan）、抗潮霉素
（Hyg）的抗性临界点，为大花红景天代谢工程与次
生代谢相关研究及叶盘法的遗传转化提供了基础。
1 材料
样品采自西藏林芝地区色季拉山，经西藏大学
兰 小 中 副 教 授 鉴 定 为 大 花 红 景 天 Rholdiola
crenulata L. 的种子。
2 方法
2.1 种子消毒及无菌苗组培苗的获得
挑选粒大饱满的大花红景天种子，经过 4 ℃低
温放置 3周，用无菌水浸泡 24 h，经 75%乙醇和 0.6%
NaClO消毒后，接种到含 700 mg/L L-脯氨酸（L-Pro）
的 MS 固体培养基上，置于温度为（20±3）℃的恒
温培养室中光照培养。3～5 d 后长出 2 片子叶，发
芽率达 99%，且无污染。
2.2 愈伤组织的诱导与出芽
将 20 d 苗龄的大花红景天无菌苗剪去根部，切
成 0.5～1.0 cm2 小块，用不同质量浓度的生长素
NAA（1.0、2.0、3.0 mg/L）与细胞分裂素 6-BA 组
合诱导的培养基（浓度均为 3.0 mg/L）或用不同浓
度的 6-BA（0.5、1.0 mg/L）与生长素 NAA 组合诱
导的培养基（质量浓度均为 2.0 mg/L）培养。
2.3 生根培养
丛生芽长到 5～7 cm 时切下，放置在加入 MS＋
700 mg/L L-Pro、MS＋0.5 mg/L NAA、MS＋0.2 mg/L
IBA＋0.1 mg/L NAA 培养基诱导生根。
2.4 培养条件的优化
由于大花红景天自身伤口分泌酚类有色物质，
致使材料褐化死亡，采用以下解决方案：在 MS 基
本培养基中分别添加抗氧化剂维生素 C（Vc）：5、
10、15、20 mg/L；添加活性碳：0.5、1.0、1.5 mg/L；
在 MS 基本培养基中添加灭菌的滤纸培养[4]。
2.5 大花红景天对抗生素的敏感性的测定
将大花红景天叶片切成 0.5～1 cm2 小块，分别
放置到含不同浓度 Kan、Hyg 的再生培养基 MS＋
3.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro
上，观察不同浓度的 Kan、Hyg 对大花红景天愈伤
组织诱导和分化的影响，以确定最优的筛选压，筛
选出合适的浓度用于遗传转化。Kan 的浓度设定为
50、100、200、300 mg/L，Hyg 的浓度为 5、10、
15、20 mg/L，40 d 后统计筛选的效果。
2.6 培养条件
以 MS 为基本培养基，培养基的 pH 值均为 5.8，
附加蔗糖 30 g/L、琼脂 7.2 g/L。培养温度为 20 ℃，
每日光照 14 h，培养周期为 28 d，光照强度为 3 000 lx。
3 结果与分析
3.1 不同激素浓度对红景天再生芽的诱导
实验结果表明（表 1）在所选 MS＋3.0 mg/L
6-BA＋1.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro 培养基中不
定芽的诱导率达到 92%，分化愈伤组织呈现出紫红
色，质地疏松，丛生芽较多，无褐化或玻璃化现象出
现。MS＋3.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA＋700 mg/L
L-Pro 培养基中不定芽的诱导率为 52%，分化愈伤组
织多为青绿色，质地紧密，丛生芽少，偶有褐化或玻
璃化现象。另两种培养基（MS＋3 mg/L 6-BA＋3
mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro和MS＋1 mg/L 6-BA＋2
mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro）的分化效率极低，分别
为 40%和 30%，且分化的愈伤组织质地紧密，玻璃
化与褐化现象严重，并伴有提前衰老的迹象。分析可
得，MS＋3.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋700 mg/L
L-Pro 培养基能够短时高效地诱导大花红景天的叶芽
分化，能够更好的应用于植物基因工程研究。
在大花红景天再生芽的诱导实验中发现存在
愈伤组织的色泽差异（图 1），表现出质地蓬松的
紫红色愈伤和质地略为紧密的绿色愈伤，通过显
微观察发现，几乎所有丛生芽的分化均始于紫红
色愈伤，长期继代发现紫红色愈伤生长迅速，含
水量大，而绿色愈伤组织生长缓慢，干燥，易老
化。由实验结果分析可见，随着 NAA 浓度的减少，
6-BA/NAA 浓度配比的增大，诱导率和愈伤的生
长状况均有极大地提升，表明较高浓度的细胞分
裂素 6-BA 有助于提高丛生芽的分化效率，这与
四裂红景天的相关研究一致[5]。L-Pro 在本研究中
合理的应用能够有效地提高植物愈伤组织质量，
延长继代时间，保持再生能力[6]。
3.2 不定根的诱导
在植株再生体系中，不定根的诱导至关重要[7]，
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表 1 6-BA 和 NAA 不同配比培养基中不定芽诱导情况
Table 1 Adventition induction in culture media with 6-BA and NAA at different ratios
编号 培养基成分 接种总数 诱导个数 诱导率 / %
1 MS＋3.0 mg/L 6-BA＋3.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro 50 20 40
2 MS＋3.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro 50 26 52
3 MS＋3.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro 50 46 92
4 MS＋0.5 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro 50 30 60
5 MS＋1.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA＋700 mg/L L-Pro 50 15 30

A-无菌苗 B-再生芽点显微图 C-丛生芽 D-不定根诱导
A-sterile plants B-micrographs of regeneration buds C-bud clumps D-induction of adventitious root
图 1 大花红景天再生过程不同时期的生长状态
Fig. 1 Growth state of R. crenulata in different regeneration periods
本研究应用 4 种不同的培养基诱导生根（MS，
MS＋700 mg/L L-Pro、MS＋0.5 mg/L NAA、MS＋
0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L NAA），结果表明（表 2），
MS＋700 mg/L L-Pro 培养基诱导率高，生根迅速，
分枝多。MS 和 MS＋0.5 mg/L NAA 两种培养基虽
能有效的诱导不定根的生成，但存在分枝较少的缺
点，MS＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L NAA 培养基中，
诱导率仅为 16%，根分枝少，生长慢。NAA 具有促
进细胞分裂和不定根生成的作用，但在本实验中表
明MS培养基中添加0.5 mg/L NAA不能显著地提高
大花红景天不定根的诱导率，然而 700 mg/L L-Pro
的添加却有促进不定根生成的功效。在木本植物中
成功应用添加 IBA 和 NAA 的培养基不能促进根的
生成，相反，有着极大地抑制作用。表明木本植株
与草本植株的生根培养存在较大差异。
3.3 褐化现象的防止
在大花红景天培养过程中，创伤处时常分泌一
些黑褐色酚类物质，该物质直接影响叶片的生长及
愈伤组织的形成，最终导致叶片的死亡。为消除
该现象影响大花红景天的再生效率，设计 3 种常
用方法预防褐化现象：加入不同质量浓度 Vc、活
性炭和滤纸。结果表明（表 3），10 mg/L 的 Vc 能
表 2 不同培养基中诱导不定芽的生根情况
Table 2 Rooting situations of adventitious buds induced in different media
编号 培养基成分 接种总数 诱导个数 诱导率 / % 生长状态
1 MS 50 42 84 根分较少多，生长快，白色
2 MS＋700 mg/L L-Pro 50 48 96 根分之多，生长快，暗红色
3 MS＋0.5 mg/L NAA 50 41 82 根分枝较少，生长快，白色
4 MS＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L NAA 50 8 16 根分枝少，生长慢，白色

A
B
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表 3 不同培养基对褐变的影响
Table 3 Effects of different culture media on browning
编号 培养基成分 接种总数 褐化个数 褐化率 / %
1 MS＋5 mg/L Vc 50 8 16
2 MS＋10 mg/L Vc 50 1 2
3 MS＋15 mg/L Vc 50 6 12
4 MS＋20 mg/L Vc 50 7 14
5 MS＋0.5 mg/L 活性炭 50 9 18
6 MS＋1.0 mg/L 活性炭 50 3 6
7 MS＋1.5 mg/L 活性炭 50 6 12
8 MS＋滤纸 50 10 20

够有效防止叶片的褐化现象产生。随 Vc 质量浓度
的升高和降低，褐化率明显增高。活性炭能够吸
附酚类等有害物质，添加活性炭的 MS 固体培养
基能够降低叶片褐化率，但同时也会吸附培养基
中的营养物质，改变 pH 值与固体培养基硬度，影
响叶片的生长。滤纸能够吸附酚类物质，同时也
直接影响叶片对营养物质的吸收利用，不能有效
消除褐化现象[8]。
Vc 又名抗坏血酸，具有直接清除植物体内因
氧化代谢产生的活性氧，保护植物有机体及其正常
代谢免于氧化胁迫造成伤害的作用，通过还原作用
消除有害氧自由基的毒性，Vc 防止褐化的方法能够
有效的应用于多个物种：100 mg/L Vc 防止香蕉茎
尖褐变；500 mg/L 的 Vc 抑制无花果的褐化效果最
明显[9]，而在大花红景天中 10 mg/L 的 Vc 能够有效
防止褐化。
3.4 Kan 和 Hyg 抗性浓度的筛选
将外植体置于分别含有不同浓度的 Kan（图 2）
和 Hyg（图 3）的 MS＋3.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L
NAA＋700 mg/L L-Pro 培养基上培养 40 d 后观察致
死率，发现随着 Kan 浓度的增加，致死率增大，50
mg/L Kan 致死率 13.3%，100 mg/L Kan 致死率
77.7%，200 mg/L Kan 致死率 95.5%，300 mg/L Kan
致死率为 100%。Hyg 的结果为 5 mg/L Hyg 致死率
27%，10 mg/L Hyg 致死率 80%，15 mg/L Hyg 致死
率 100%，20 mg/L Hyg 致死率为 100%。考虑经济
因素，因而得到 Kan 和 Hyg 的最佳抗性浓度分别为
200 mg/L 和 10 mg/L。
农杆菌介导的植株转化方法已广泛应用于植物
基因工程，对带有抗性的转基因植株（载体携带）
进行筛选有助于提高转化效率，降低劳动成本。因

A-50 mg/L Kan B-100 mg/L Kan C-200 mg/L Kan D-300 mg/L Kan
图 2 Kan 的抗性筛选
Fig. 2 Resistance screening of Kan

A-5 mg/L Hyg B-10 mg/L Hyg C-15 mg/L Hyg D-20 mg/L Hyg
图 3 Hyg 的抗性筛选
Fig. 3 Resistance screening of Hyg
而 Kan 和 Hyg 抗性浓度的筛选工作显得尤为重要，
过高的浓度会抑制植株的生长，过低的浓度会失去
筛选的价值并增大后期检测的工作量。
4 讨论
西藏大花红景天生长于海拔约 4 500 m 的高海
拔地带，常年严寒、缺氧、强日照，条件恶劣，从
而造就了其强适应性的遗传特征[10]。这使得大花红
A B
C D
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C D
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景天的再生条件不同于多数草本植物，在各生长阶
况，6-BA/NAA 的较高浓度配比能够有效地促进大
花红景天的丛生芽分化，因而得到最佳丛生芽诱导
培养基为 MS＋3.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋
700 mg/L L-Pro。最佳生根培养基为 MS＋700 mg/L
L-Pro。
大花红景天叶片为肉质化叶片且富含多糖多
酚，在培养过程中会出现酚类物质外泌的现象，使
得叶片褐化最终死亡[11]。为有效防止褐化，最终发
现在培养基中添加 10 mg/L Vc 能够抑制这一现象。
在本研究中成功筛选出大花红景天叶片对 Kan
和 Hyg 抗性的浓度分别为 200 mg/L 和 10 mg/L。为
大花红景天应用于植物基因工程，培育出高产红景
天苷的转基因植株打下基础。
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