全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 14 期 2016 年 7 月

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• 药材与资源 •
甘草 microRNA 及其靶基因的生物信息学预测
李华云，王 宁，韦春香，张 彤，付晨熙，高 飞*，周宜君
中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081
摘 要：目的 利用生物信息学手段预测甘草 Glycyrrhiza uralensis 的 microRNA（miRNA），并实验验证其存在，确定相应
的靶基因，为理解甘草 miRNA 的生物学功能奠定基础。方法 下载公共核酸数据库中的甘草高通量测序序列和表达序列、
标签序列，使用Trinity和Assembler等软件拼接以获得转录本数据。基于miRNA前体序列在植物物种间的保守性，将miRBase
数据库中的已知植物miRNA前体与甘草转录组序列进行Blast比对，按照miRNA前体应具备的标准进行筛选。通过 stem-loop
qRT-PCR 实验验证 miRNA。使用 psRNATarget 软件进行 miRNA 的靶基因预测，并对靶基因进行功能分析。结果 序列拼
接获得 88 263 条甘草转录组数据。使用这些数据预测到分属于 17 个家族的 49 个 miRNA 序列，以及相应的 30 个茎环结构
前体，随机选取其中 12 个，经实验验证，确实存在。这些 miRNA 靶向的 172 个基因主要参与基因转录调控、信号转导、
发育调控和防御反应等生物学过程。结论 新预测的甘草 miRNA 及其靶基因为进一步研究 miRNA 在甘草中的生物学功能
奠定了基础。
关键词：甘草；miRNA；靶基因；生物信息学；转录组
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)14 - 2506 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.020
Bioinformatic prediction of microRNAs in Glycyrrhiza uralensis and their target genes
LI Hua-yun, WANG Ning, WEI Chun-xiang, ZHANG Tong, FU Chen-xi, GAO Fei, ZHOU Yi-jun
College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081, China
Abstract: Objective To provide a good start for understanding the roles of micoRNA in Glycyrrhiza uralensis, the microRNAs and their
target genes were predicted using bioinformatic approach. Methods The deep sequencing data and EST sequences downloaded from
public database were assembled using the Trinity and Assembler softwares to establish the transcriptome database. Since most of the plant
miRNAs were conserved in plant species, all plant miRNAs stem-loop precursors were aligned to the assembled transcriptome database
and the putative miRNA precursors were identified according to a rigorous criterion. psRNATarget was employed to predicted the targets
of miRNA. Results A general transcriptome database with 88 and 263 sequences was obtained. Based on the transcriptomic sequences,
49 miRNA, classified into 17 families, arising from 30 stem-loop precursors, were identified. A total of 172 genes were predicted to be
regulated by these miRNA, and these genes were involved into diversified biological processes including gene transcription regulation,
signal transduction, development regulation, and defense response. Conclusion The miRNAs and the corresponding target genes
identified in this study will provide a solid basis for understanding their biological functions in G. uralensis.
Key words: Glycyrrhiza uralensis Fisch.; microRNA; target gene; bioinformatics; transcriptome

甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 为 豆 科
（Leguminosae）甘草属 Glycyrrhiza L. 多年生草本植
物，是中国传统大宗补益中草药，药用部位是根及
根茎。甘草具有祛痰止咳、清热解毒、抗癌和免疫
调节等诸多功能，已被列入多国药典（《中国药典》
2010 年版、《日本药典》JP16、《美国药典》USP34
和《欧洲药典》Ph. Eur. 7）[1]。甘草主要分布于新
疆、宁夏、内蒙古和甘肃等省区的干旱、半干旱的

收稿日期：2016-01-05
基金项目：国家自然科学基金资助（31370356）；中央民族大学学术团队建设项目（2015C8）；国家大学生创新创业训练计划（GCCX2014110045）
作者简介：李华云（1990—），男，硕士在读，研究方向为生物化学与分子生物学研究。Tel: (010)68932633 E-mail: lihuayun0331@163.com
*通信作者 高 飞，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事生物化学与分子生物学研究。Tel: (010)68932633 E-mail: gaofei@muc.edu.cn
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荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带，根系发达，
耐逆性强，具有防风固沙的功能，对于我国西北部
荒漠地区生态环境的保护和改善具有重要意义[2]。
microRNA（miRNA）是一类在真核生物中发
现的长度约为 21 nt 的单链非编码小分子 RNA。最
早发现的 miRNA 是秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis
elegans 的 lin-4 和 let-7[3-4]。miRNA 的成熟形式主
要在细胞质中通过与靶基因的碱基互补配对，进而
介导靶基因的降解或翻译抑制，在转录后水平对基
因表达进行调控[5]。在植物中，miRNA 通过负调控
转录因子和其他重要的功能基因，广泛参与植物器
官的生长发育、形态建成、逆境胁迫应答和次生代
谢调控[6]。
目前已经鉴定了超过 72 种植物的 7 385 种
miRNA，在每种植物中发现的 miRNA 种类数介于
几十个到几百个之间[7]。整体说来，对于拟南芥、
水稻、毛果杨等模式植物的 miRNA 研究较多，对
于中草药等植物的研究相对较少。中草药在中国传
统医药中具有重要地位。miRNA 在植物体内发挥重
要的调控作用，参与植物环境逆境应答以及次生代
谢产物的生物合成，研究药用植物 miRNA 的生物
学功能对于理解药用成分形成和积累的生态调控机
制，培育高产优质的中药材具有重要意义。近年来，
对药用植物 miRNA 的研究正在迅速开展起来，研
究人员利用高通量测序、miRNA 芯片、生物信息分
析等方法研究了人参、毛地黄、半夏、千里光等中
草药的 miRNA[8-9]。但迄今为止，未见甘草 miRNA
的相关研究。本研究拟应用生物信息学工具，基于
甘草转录本序列鉴定 miRNA，并确定其靶基因，为
进一步研究 miRNA 在甘草逆境应答和次生代谢途
径调控中的作用奠定基础。
1 材料
甘草种子来自内蒙古自治区鄂尔多斯市，经中
央民族大学生命与环境科学学院刘博博士鉴定为甘
草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的根及根茎。
Trizol 试剂购自美国英杰生命技术有限公司
（Invitrogen），逆转录试剂和荧光定量 PCR 试剂盒
购自天根生化科技（北京）有限公司，引物由生
工生物工程（上海）股份有限公司合成。其余试
剂均为分析纯。
2 方法
2.1 甘草核酸数据的获取和转录本数据拼接
在 NCBI 网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下
载甘草的高通量测序数据和 EST 序列。高通量数据
登录号为 DRR006519、DRR006520、DRR006521、
DRR006522、DRR006523、DRR006524、DRR006525
和 DRR006526。表达序列标签（EST）数据有 55 942
条。数据过滤软件使用 Trimmomatic（http://www.
usadellab.org/cms/index.php?page＝trimmomatic）[10]
和 solexaQA（http://solexaqa.sourceforge.net/）[11]。拼
接软件使用 Trinity（http://trinityrnaseq.github.io/）[12]
和 iAssembler（v1.3.2，http://bioinfo.bti.cornell. edu/
tool/iAssembler/）[13]，拼接采用默认参数进行。聚
类去冗余软件使用 CD-HIT（http://weizhong- lab.
ucsd.edu/cd-hit/）[14]。
2.2 甘草 miRNA 的生物信息学预测
整体预测流程参考文献方法[15]进行。简言之，
首先从植物 miRNA 数据库（http://bioinformatics.c
au.edu.cn/PMRD）中下载 10 898 个植物来源的
miRNA 茎环结构前体，去除不同物种 miRNA 之间
的重复序列以及不可靠的数据后，剩余的 4 835 条
miRNA 前体序列作为预测甘草 miRNA 前体的参照
序列与拼接得到的甘草转录本序列进行同源比对分
析（Blastn），筛选出 E＜1e−6 的转录本序列。这些
转 录 本 序 列 去 除 冗 余 后 ， 用 Mfold 软 件
（http://mfold.rna.albany.edu/q＝mfold/RNA-Folding-
Form）[16]进行折叠，预测候选 miRNA 前体序列
的二级结构，分析是否有 miRNA 成熟形式存在茎
环结构上茎的部分，评价茎环结构的稳定性。
miRNA 前体的二级结构筛选标准参照 Zhang 等[17]
的方法。
2.3 甘草根中 miRNA 的检测
基于甘草的主要药用部位是根茎，选取培养了
8 周的甘草幼苗根部，用 Trizol 法提取根中的总
RNA，并分别用 Nano DropTM2000 分光光度计、琼
脂糖凝胶电泳验证总 RNA 的纯度、浓度、完整性。
随机选取生物信息学预测中的 12 条 miRNA，
并分别设计逆转录茎环引物及荧光定量 PCR 引物
（表 1），利用 stem-loop 荧光定量 PCR 验证 miRNA。
2.4 靶基因的预测和 GO 分析
将全部靶基因序列比对到拟南芥蛋白数据，
用拟南芥蛋白注释靶基因，以了解靶基因的生物
学功能，截取标准为 E＜1e−5。使用 agriGO
（http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/analysis.php）中
的 GO 分析工具对靶基因进行功能分类和富集
分析。
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表 1 待验证的 miRNAs 及其对应引物
Table 1 Selected miRNAs and their corresponding primers
miRNAs miRNA 序列 (5′-3′) 逆转录引物 (5′-3′) 正向引物 (5′-3′) 反向引物 (5′-3′)
gur-miR159e-3p UUUGGAUUGAAGG
GAGCUCUA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACAGAGCT
GTGGGTTTGGAT
TGAAGGG
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR390-5p AAGCUCAGGAGGG
AUAGCG
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACGGCGCT
GTTGAAGCTCAG
GAGGGAT
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR393b-5p UCCAAAGGGAUCG
CAUUGAUC
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACAATCAA
GTGTTCCAAAGG
GATCGCA
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR482a-3p UUCCCAAAGCCGC
CCAUUCCGA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACTCGGAA
TTGTTCCCAAAG
CCGCCC
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR164a-5p UGGAGAAGCAGGG
CACGUGCA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACTGCACG
GTTTTGGAGAAG
CAGGGCA
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR396i-5p UUCCACAGCUUUC
UUGAACUG
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACCAGTTC
GGGGTTCCACAG
CTTTCTT
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR156b-5p UUGACAGAAGAUA
GAGAGCAC
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACTGGATACGACGTGCTC
CCGCGTTGACAG
AAGATAGAGA
CAGTGCAGGGTC
CGAGGTA
gur-miR394b-5p UUUGGAUUGAAGG
GAGCUCAA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACCAGAGCCAACGGAGGT
GTTGGTTGGCATT
CTGTCC
GTGCAGGGTCCG
AGGT
gur-miR166g-3p UCGGACCAGGCUU
CAUUCCCC
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACTGGATACGACGGGGAA
CGGTCGGACCAG
GCTTCATT
CCAGTGCAGGGT
CCGAGGTATTC
gur-miR167b-5p UGAAGCUGCCAGC
AUGAUCUGA
GCGTGGTCCACACCACCTGAGCCGC
CACGACCACGCTCAGATCA
GAGCCGTGAAGC
TGCCAG
TCCACACCACCT
GAGCCG
gur-miR168a-5p UCGCUUGGUGCAG
GUCGGGAA
CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGGGTG
CTGCCGCTGAGTTCCCGACTTCCCG
CGGTGTGTCGCT
TGGTGC
GGCTGTCGTGGA
CCTGGGTG
gur-miR2118-3p UUGCCGAUUCCAC
CCAUUCCU
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG
TATTCGCACTGGATACGACTAGGAA
AAGGCGTTTCCG
ATTCCA
CAGTGCAGGGTC
CGAGGTAT

3 结果与分析
3.1 甘草转录本数据的拼接
首先用Trimmomatic软件对 Illumina HiSeq2000
测序所得数据进行滤过；用 solexaQA 对 EST 数据
进行滤过，获得去除测序接头、去除低质量数据、
去除冗余序列的可用于拼接的数据。然后分别用
Trinity 和 iAssembler 混合拼接 Illumina Heseq 2000
和 EST 数据。最后将上述 2 部分拼接好的数据用
CD-HIT 合并聚类。
本研究拼接获得的 unigene 的平均长度为 896
bp，略小于 Ramilowski 等[18]的拼接结果，但远大于
Li 等[19]的拼接结果。本研究的 unigene 的 N50（1 493
bp）和拼接总长度（67 122 825 bp）明显大于其他 2
个拼接结果。总的来看，本研究获得的转录本数据
覆盖度最高，质量较好，可以用于 miRNA 的生物
信息学预测等分析。
3.2 预测到的甘草 miRNA、前体及其二级结构
以已知植物 miRNA 前体序列为探针与拼接获得
的88 263条甘草转录本序列进行BLASTN比对分析，
筛选出 685 条候选 miRNA 前体序列。去除其中的蛋
白编码基因后，进一步对这些转录本进行手动筛选，
确定了其中能够用Mfold软件折叠形成稳定的茎环结
构，并符合相应筛选标准的核酸序列共 50 条，代表
30 个茎环前体序列（表 2 和图 1）。在这些前体序列
上分布着分属于 17 个不同家族的 49 个 miRNA 的成
熟序列（表 3）。其中，家族成员最多的是 miR156 家
族，有 8 个成员；其次为 miR159 家族，有 7 个成员。
在甘草中预测到的 49 条成熟 miRNA 的长度范
围为 20～24 nt，其中 21 nt 长度的 miRNA 最多
（31/49，63%），其次为 22 nt 的 miRNA（11/49），
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其他长度的 miRNA 数量较少。预测的 30 个
stem-loop 前体的序列长度介于 82～187 nt，这些前
体都能折叠成稳定的二级结构，最小自由能 MFE
介于−101.9～−30.4 kcal/mol，最小自由能指数 MFEI
介于 0.67～1.03（表 2）。
本实验考察了 49 个预测的甘草 miRNA 与其他
植物来源的同源 miRNA 的序列相似性（表 3）。71%
（35/49）的甘草 miRNA 与其他植物中对应 miRNA
的序列完全相同，10%（5/49）的甘草 miRNA 出现
1 个差异碱基，出现多于 1 个差异碱基的甘草
miRNA 共有 8 个，占 16%。这说明本研究预测的
miRNA 多数为保守 miRNA。还考察了 31 个预测的
甘草miRNA前体与其他植物来源的miRNA前体的
序列相似性（表 3）。发现所有前体与其他植物来源
的 miRNA 前体都有程度不同的相似性，E 值最大
为 3e−12，最小为 7e−42。这一结果说明，与蛋白
编码基因类似，同源 miRNA 的成熟形式和茎环结
构前体在序列上也具有保守性。
表 2 甘草中新发现的 miRNA 前体
Table 2 Precursors of miRNA newly discovered from G. uralensis
名称 茎环前体序列 前体同源物 E 值 MFE/(kcal·mol−1)MFEI
gur-MIR156a gagagacUGACAGAAGAGAGUGAGCACAugcugcuagugauuguaugaa
ggguauacaauugcgggugcguGCUCACUUCUCUUUCUGUCAGCuucuc
gma-MIR156a 2×10−25 52.80 1.12
gur-MIR156b ggugaugcugUUGACAGAAGAUAGAGAGCACagaugaugaaaugcauga
aagggaauggcaucucacuccuuuguGCUCUCUAUACUUCUGUCAUCacc
gma-MIR156e 1×10−35 47.90 1.09
gur-MIR156a ggugaugcugCUGACAGAAGAUAGAGAGCACagaugaugaaaugcauga
aagggaauggcaucuuacuccuuuGUGCUCUCUAUUCUUCUGUCAucacc
gma-MIR156e 2×10−34 45.70 1.04
gur-MIR156g uugggacauagaaauUGACAGAAGAGAGUGAGCACAcagaggcacucga
uauagcuauauacuguugcuuuuguguGCUCACUUCUCUCUCUGUCACC
uuccagugccuga
tcc-MIR156g 1×10−29 55.50 1.11
gur-MIR159a uggagcucucuuuccuccauuucugaaacgaggugauaguagaccuuagcugcuaguuca
uggauaccucuggcuucgcuagcaaauggaccauacuuaugcgaaggucaugggucugca
ugaacuuggagaugagguuaaucaccuucaccguuuugguAUUGGAGUGAAGG
GAGCUCCA
gma-MIR159f 2×10−21 82.30 0.97
gur-MIR159e guuauggaguggagcuccuugaaguccaaacgaggauguugcuggguuugauagAGCU
GCUGAGCUAUGGAUCCCauagugcuacccuuuaucaugugugguaguccugc
ggcuuccauaucccgggagcuucauccccuuuugcucuuauccuucUUUGGAUUGA
AGGGAGCUCUAcaccuuaau
gma-MIR159e 4×10−37 83.50 0.93
gur-MIR162 ggaaggugaagucacUGGAGGCAGCGGUUCAUCGAUCucuuccugaguuu
ggauguggaagaacacaaagcaugaaucggUCGAUAAACCUCUGCAUCCAG
cgcucacuuugcc
vun-MIR162 1×10−38 44.40 0.77
gur-MIR164k ggucuuguUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAacacaucaagaucucucucaa
acuaguaguuugucugauuuugcacgugcuccccuuuuccaacaugauu
gma-MIR164k 3×10−12 43.30 0.96
gur-MIR164a guUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAaauuauaaucuccugguucucucaaug
ccauugaucaaugcuuUGCACGUGCUCCCCUUCUCCAac
tcc-MIR164a 2×10−13 43.00 1.00
gur-MIR166g guugaggggaaugucgucugguucgagaucauucauaaauagucucaucucagguauaac
ucuucacaugagugauuUCGGACCAGGCUUCAUUCCCCucagc
gma-MIR166g 3×10−21 55.60 1.18
gur-MIR166e ggaagcuuuguuuuuugaggGGAAUGUUGUCUGGCUCGAGGacccuucu
ccuugauccaguguauuaucccucucuauaguauguagagaguugaggaugugcugugua
cuacuuguggucaaggaauguauaguguugUCGGACCAGGCUUCAUUCCCC
ccaauuauaugcuucc
csi-MIR166e 2×10−18 76.30 0.95
gur-MIR167b uaugcaccuucaguaguUGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGAgcuuaccuaau
ucuaauucuaauggugagaauagaucaugugguagcuucaccucuugaauguaagcaua
lja-MIR167 3×10−23 49.80 1.16
gur-MIR167a ggucacaaaggaaaaagUGAAGCUGCCAGCAUGAUCUAgcuuugguuaga
gagcgcugcgcuagcugaauaaggaguguuagcccugaauugaacccugacuaGGUCA
UGCUGUGACAGCCUCACUccuuccuauuuggggacc
lja-MIR167a 2×10−22 58.90 0.81
gur-MIR168a cgcggucucuaauUCGCUUGGUGCAGGUCGGGAAccgcuacugcugcgau
uuucgcgcguaaugacggagcggucgccggcggugaauuggauCCCGCCUUGCAU
CAACUGAAUcggaggccgcg
gma-MIR168a 1×10−27 72.20 0.94
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续表 2
名称 茎环前体序列 前体同源物 E 值 MFE/(kcal·mol−1)MFEI
gur-MIR171c GAUAUUGGUGCGGUUCAAUCAgaaggcgguccuuuauaauccaaaaaagc
ucuguguuauuUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC
gma-MIR171c 3×10−25 39.10 1.15
gur-MIR171b agcaaGGUAUUGGCGCGUCUCAAUUUgaagacauggcuauuuaucaugag
aauccagccauguaguuUGAUUGAGCCGCGUCAAUAUCuuguu
lja-MIR171b 3×10−22 47.70 1.22
gur-MIR172 agucgcuguuugccgauGGAGCACCAUCAAGAUUCACAaguuuuugggu
uuuuuuuuuugguuuuggggugguccccuaauugcugcuccaaaucuauuagcccuuug
auaUGAGAAUCUUGAUGAUGCUGCAgcggcaauaaaugacu
gma-MIR172e 1×10−28 62.20 1.22
gur-MIR2118 gagagagaaagggaaagggggaagagcuuggggaaguuaugGGAGAUGGGAGG
UUCGGCAAAacagaucugaauccuucauacaaagauucuguauuucuUUGCCG
AUUCCACCCAUUCCUAugauuuccucugguuccucucuuuccacucuccucuc
mtr-MIR2118 5×10−34 79.00 1.07
gur-MIR319a ggauuuaauUAGCUGCCGACUCAUUCAUCCAaauguugagucaauuaag
auccauacucaccaaaugcgugaaugaugcgggagacaaauugaaucu
gma-MIR319a 9×10−23 30.70 0.81
gur-MIR319e gauugaaggggcucacuucaguccaguucgaggcgguggaagauggcugagcacagcugc
ugacucguugguucgagagcucaccaugaauuagccucuuuaauuuggugugcuucugau
ccaacgaugcgggagcugccacucagucguugcugucaugucuuggacugaaggggccucu
ucauuc
mes-MIR319e 3×10−22 101.90 1.03
gur-MIR390 aguaugggagaaucuguaAAGCUCAGGAGGGAUAGCGccauggauauugcu
ucuccauuuugaugggauuuugcaauauuaauaucauuauucugaucuucucuauagCG
CUAUCCAUCCUGAGUUUCauggguucuucauacu
mes-MIR390 3×10−15 61.45 1.10
gur-MIR393b aggcaUCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCCcaaaucucaguaccccuuaauuaa
ucucucuguuuuucaccuuaauucccuuaauucucacaauauuugggAUCAUGCUAU
CCCUUUGGAUUccu
mtr-MIR393b 3×10−17 37.52 0.78
gur-MIR394b ucaugggggcuucacaaaggguagcuuacagaguuuuUUGGCAUUCUGUCCAC
CUCCcucccucccuccacuucaauaauucauucccaaugucucuauagcucuguugcgcg
ccgcguggAGGUGGGCAUACUGCCAACUcagcucucuuggcuucucuuugu
aaagccuuccuga
mdm-MIR394b 8×10−21 63.46 0.71
gur-MIR396i ggcccucuuuguauucUUCCACAGCUUUCUUGAACUGcauucaaagaguuc
cuuugcaugcaugccauggcacucuugcucccaccacaccuuguuuugcaGUUCAAUA
AAGCUGUGGGAAGauacagauaggguc
gma-MIR396i 7×10−42 60.49 0.96
gur-MIR396g gucaugcuuUUCCACAGCUUUCUUGAACUUcuuauuaugcaucuuaaaagc
ucucuacaggaucaauuaaaagcccuaggcuagcuacuagAAGCUCAAGAAAGCU
GUGGGAgaauauggc
gma-MIR396g 3×10−17 43.52 0.89
gur-MIR399a uaagcaaaucagcuaUAGGGCUUCUCUUUCUUGGcaggaaauuaucaugacca
uuuccauggugugucuuGCCAAAGGAGAGUUGCCCUGuugcugcuuuagcu
ua
pvu-MIR399a 1×10−29 55.30 1.20
gur-MIR482a ggaaugggagauuggagcuaucagaaguugugGGAAUGGGCGGUUUGGGAA
GAaaucaugaaauccuuaauuaauuucucuuuuuaguauuuuucUUCCCAAAGCC
GCCCAUUCCGAugauuucuguugguuccucccuuucc
mdm-MIR482a 2×10−18 73.50 1.23
gur-MIR482b gggaaugggagauuggagaauuuagaaguugugGGAAUGGGUUGGUUGGGA
UGAaagauuuacuccaacaacaacauaacguuguguguguuuUCUUCCCAAUUC
CGCCCAUUCCUAuuauuucuaauuucuccucccuuuccc
mdm-MIR482a 1×10−20 69.30 1.16
gur-MIR1507b auguuugguAGAGGCGUAUGGAGUGAGAGAUuggaaagcucuuuccgauu
ucuagucauuaaacuuucccucUUUCAUUCCAUAUGUCAUCUAAcgaacgu
mtr-MIR1507 4×10−14 43.00 1.08
gur-MIR1507a auguuuggcagaggcauauggagugagagcuuagaaagcauuuuuccgauucuuugucauu
gaaccuucccccUCUCGUUCCAUACGUCGUCUAAcgaacau
gma-MIR1507a1×10−13 30.40 0.67

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gur-MIR156a gur-MIR171c gur-MIR162 gur-MIR164
图 1 部分 miRNA 前体的二级结构
Fig. 1 Secondary structures of some precursors of miRNA
表 3 甘草中新发现的 miRNA
Table 3 miRNAs newly discovered from G. uralensis
序号 家族 名称 序列 长度/nt 同源 miRNA 与同源 miRNA 的差异碱基数
1 156 gur-miR156a-5p UGACAGAAGAGAGUGAGCACA 21 bna-miR156a 0
2 gur-miR156a-3p GCUCACUUCUCUUUCUGUCAGC 22 zma-miR156d-3p 0
3 gur-miR156b-5p UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC 21 ath-miR157a-5p 0
4 gur-miR156b-3p GCUCUCUAUACUUCUGUCAUC 21 aly-miR157c-3p 1
5 gur-miR156e-5p CUGACAGAAGAUAGAGAGCAC 21 smo-miR156b 0
6 gur-miR156e-3p GUGCUCUCUAUUCUUCUGUCA 21 aly-miR157c-3p 3
7 gur-miR156g-5p UGACAGAAGAGAGUGAGCACA 21 bna-miR156a 0
8 gur-miR156g-3p GCUCACUUCUCUCUCUGUCACC 22 bdi-miR156b-3p 0
9 159 gur-miR159a-3p AUUGGAGUGAAGGGAGCUCCA 21 gma-miR159b-3p 0
10 gur-miR159e-3p UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA 21 ath-miR159a 0
11 gur-miR159e-5p AGCUGCUGAGCUAUGGAUCCC 21 gma-miR159d 1
12 162 gur-miR162-5p UGGAGGCAGCGGUUCAUCGAUC 22 csi-miR162-5p 0
13 gur-miR162-3p UCGAUAAACCUCUGCAUCCAG 21 ath-miR162a-3p 0
14 164 gur-miR164k-5p UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA 21 ath-miR164a 0
15 gur-miR164a-5p UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA 21 ath-miR164a 0
16 166 gur-miR166g-3p UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC 21 pvu-miR166a 0
17 gur-miR166e-3p UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC 21 pvu-miR166a 0
18 167 gur-miR167b-5p UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGA 22 ccl-miR167a 0
19 gur-miR167a-5p UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUA 21 ath-miR167a-5p 0
20 gur-miR167a-3p GGUCAUGCUGUGACAGCCUCACU 23 aly-miR167b-3p 1
40





50
30




60

20



70

10



80
5 3
60





40

80





20



100




5 3
40 50




30
60




20 70





10 80




5 3
50




40 60




30
70


20
80



10



5 3
90
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 14 期 2016 年 7 月

• 2512 •
续表 3
序号 家族 名称 序列 长度/nt 同源miRNA 与同源miRNA的差异碱基数
21 168 gur-miR168a-5p UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA 21 ath-miR168a-5p 0
22 171 gur-miR171c-5p AGAUAUUGGUGCGGUUCAAUC 21 gma-miR171c-5p 0
23 gur-miR171c-3p UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC 21 gma-miR171e 0
24 gur-miR171b-3p UGAUUGAGCCGCGUCAAUAUC 21 vvi-miR171b 0
25 172 gur-miR172e-3p UGAGAAUCUUGAUGAUGCUGCA 22 vvi-miR172d 0
26 2118 gur-miR2118-5p GGAGAUGGGAGGUUCGGCAAA 21 gma-miR2118a-5p 2
27 gur-miR2118-3p UUGCCGAUUCCACCCAUUCCU 21 gma-miR2118a-3p 0
28 159 gur-miR319a-5p UAGCUGCCGACUCAUUCAUCCA 22 ppe-miR319b 1
29 gur-miR319e-5p AGCUGCUGACUCGUUGGUUC 20 mtr-miR4414a-3p 0
30 gur-miR319e-3p AUCCAACGAUGCGGGAGCUGC 21 mtr-miR4414a-3p 0
31 gur-miR319b-3p UUGGACUGAAGGGGCCUCUU 20 gma-miR319f 0
32 390 gur-miR390-5p AAGCUCAGGAGGGAUAGCG 21 ath-miR390a-5p 0
33 gur-miR390-3p CGCUAUCCAUCCUGAGUUUCA 21 aly-miR390a-3p 0
34 393 gur-miR393b-5p UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC 21 mtr-miR393b-5p 0
35 gur-miR393b-3p AUCAUGCUAUCCCUUUGGAUU 21 mtr-miR393b-3p 0
36 394 gur-miR394b-5p UUGGCAUUCUGUCCACCUCC 20 gma-miR394c-5p 0
37 gur-miR394b-3p AGGUGGGCAUACUGCCAACU 20 gma-miR394b-3p 1
38 396 gur-miR396i-5p UUCCACAGCUUUCUUGAACUG 21 gma-miR396a-5p 0
39 gur-miR396i-3p GUUCAAUAAAGCUGUGGGAAG 21 gma-miR396i-3p
40 gur-miR396g-5p UUCCACAGCUUUCUUGAACUU 21 gma-miR396b-5p 0
41 gur-miR396g-3p AAGAAAGCUGUGGGAGAAUAUGGC 24 gma-miR396d 0
42 399 gur-miR399a-3p UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG 21 pvu-miR399a 0
43 482 gur-miR482a-5p GGGAAUGGGCGGUUUGGGAAGA 22 mdm-miR482a-5p 2
44 gur-miR482a-3p UUCCCAAAGCCGCCCAUUCCGA 21 mdm-miR482a-3p 3
45 gur-miR482b-5p GGGAAUGGGUUGGUUGGGAUGA 22 mdm-miR482a-5p 3
46 gur-miR482b-3p UCUUCCCAAUUCCGCCCAUUCCUA 24 gma-miR482a-3p 0
47 1507 gur-miR1507b-5p AGAGGCGUAUGGAGUGAGAGAU 22 mtr-miR1507-5p 5
48 gur-miR1507b-3p UUUCAUUCCAUAUGUCAUCUAA 22 mtr-miR1507-3p 4
49 gur-miR1507a-3p UCUCGUUCCAUACGUCGUCUAA 22 gma-miR1507a 3

3.3 甘草根中 miRNA 的验证
为了确定生物信息学预测中的 miRNA 真实存
在，本研究随机选取了 12 条新发现的 miRNA，通
过 stem-loop qRT-PCR 实验进行验证。实验结果显
示，12 条 miRNA 荧光定量扩增产物的熔解曲线均
为单峰，将 12 条 miRNA 荧光定量 PCR 产物进行
琼脂糖凝胶电泳，均出现明显单一条带，大小约 60
bp，与荧光定量 PCR 扩增产物的实际大小一致（图
2），证明本研究通过生物信息学预测的 miRNA 在
甘草中确实存在。
3.4 甘草 miRNA 靶基因的预测及功能分析
根据预测的 49 条甘草 miRNA 序列以及拼接获
得的转录本序列，通过在线软件 psRNATarget 对其
靶基因进行了预测，共预测到 32 条甘草 miRNA 的
273 个靶基因，其中有 172 个靶基因可以用拟南芥
蛋白序列进行注释。靶基因编码的蛋白具体包括以
下几类：（1）转录因子，包括 SBP 类、myb 类、
GRAS 类、bHLH 类、NAC 类、bZIP 类、TCP 类等

1～12-3、9、14、16、18、21、27、36、32、34、38、44 的 miRNA，
13-空白对照 14-U6 内参基因 M-Marker
1—12-miRNA of 3, 9, 14, 16, 18, 21, 27, ,36, 32, 34, 38, and 44
13-blank control 14-U6 reference gene M-Marker
图 2 miRNA stem-loop qRT-PCR 产物电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of miRNA stem-loop qRT-PCR
products
转录因子；（2）激酶和磷酸酶，包括 MAPKKK5、
富含亮氨酸重复的蛋白激酶 Leucine-rich repeat
protein kinase、U-box domain-containing protein
kinase、protein phosphatase 2CA 等；（3）激素信
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2 1 3 1 4 M
100 bp
50 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 14 期 2016 年 7 月

• 2513 •
号转导成员，包括 ARF（生长素响应因子）、生长
调节因子 5（GRF5 | growth-regulating factor 5）、
AFB2 | auxin signaling F-box 2 等；（4）抗病蛋白，
如 NB-ARC domain-containing disease resistance
protein、 LRR and NB-ARC domains-containing
disease resistance protein 、 Disease resistance
protein（TIR-NBS-LRR class）family；（5）其他
类别的酶等。GO 分类和富集分析结果（图 3）表
明被富集的生物学过程为 DNA 依赖的转录调控
（GO：0006355）、器官发育（GO：0048513）和
防御反应（GO：0006952）。被富集的分子功能包
括转录因子活性（GO：0003700）和泛素蛋白连
接酶活性（GO：0004842）。以上分析结果表明，
甘草 miRNA 主要通过调控转录因子等靶基因参
与基因转录调控、信号转导、胁迫应答、蛋白翻
译后修饰等生物学过程。







图 3 甘草 miRNA 靶基因编码蛋白的 GO 分类情况
Fig. 3 GO classification of predicted miRNA target genes in G. uralensis
4 讨论
与动物 miRNA 相比，植物 miRNA 的研究相对
较晚。尽管如此，随着第二代测序技术的飞速发展，
研究人员已从数十种植物中鉴定出少到几十个、多
至几百个的 miRNA，并对部分植物的 miRNA 进行
了进一步的功能分析。这些研究表明 miRNA 广泛
参与调控植物的生长发育、形态建成、次生代谢物
生成、信号转导以及环境因子应答等[20]。甘草作为
我国传统大宗中草药，同时也是维持我国西北部干
旱区域生态系统健康的重要植物[1-2]，其次生代谢产
物的调控、积累机制和干旱等逆境适应机制都与
miRNA 存在密切的内在联系，鉴定甘草 miRNA、
研究 miRNA 的生物学功能将促进对其相关分子机
制的了解。
目前对于中草药等非模式植物的 miRNA 的鉴
定主要依赖于转录组序列。转录组序列有两类来源：
表达序列标签（EST）和高通量转录组测序数据。
目前随着高通量测序费用的不断降低，对中草药植
物进行的高通量转录组测序研究不断增加[21]，为
miRNA 的鉴定提供了数据基础。miRNA 鉴定的关
键是找到 miRNA 的茎环结构前体，因此获得高覆
盖度的转录本数据是鉴定 miRNA 前体的前提。在
GenBank 中的甘草核酸数据中，既有 5 万余条来自
Sanger 测序的 EST 序列，也有若干个高通量测序数
据。为了获得高质量的转录本序列数据，应用 Trinity
等常用拼接软件，将不同来源的转录本数据拼接在
一起，拼接得到的转录本数据覆盖度较好，这一高
质量的转录本数据将有助于后续的 miRNA 的生物
信息学鉴定和靶基因预测研究。
在 miRNA 的诸多鉴定方法中，生物信息学预
测无须进行测序，简便快捷，因而得到较多的应
用[15,17,22-23]。在这些研究中，主要采用 2 种方法进
行 miRNA 的生物信息学鉴定。第 1 种鉴定方法是，
将相关物种的 miRNA 成熟形式比对到转录本上，
允许 3～4 个碱基错配，然后取一定长度的侧翼序列
（如 200 nt），用mfold等RNA折叠软件进行分析[17]。
第 2 种方法是本研究采用的方法[15]。这种做法与第
一种方法的主要区别在于，比对到转录本序列上的
是相关物种的已知 miRNA 的茎环前体序列，而不
是成熟形式的序列。这 2 种方法各有特点，也都有
靶基因 基因组
信
号
生
物
过
程
调
控
生
殖
细
胞
组
分
组
成
细
胞
壁
组
织
或
生
物
发
生
细
胞
组
分
生
物
发
生
生
物
调
控
生
物
学
过
程
正
调
控
生
物
学
过
程
负
调
控
发
育
过
程
多
细
胞
生
命
有
机
体
过
程
细
胞
过
程
生
殖
过
程
信
号
过
程
代
谢
过
程
生
长
定
位
的
建
立
定
位
多
有
机
体
过
程
刺
激
响
应
免
疫
系
统
过
程
细
胞
器
共
质
体
大
分
子
复
合
物
细
胞
组
分
细
胞
细
胞
外
区
域
细
胞
器
组
分
转
录
调
节
活
性
转
运
器
活
性
催
化
活
性
结
合
88

66

44

22

0
比
例
/%

GO 注释
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 14 期 2016 年 7 月

• 2514 •
一定的应用。本研究在预试验中比较了这 2 种鉴定
方法，发现第 2 种方法更方便易行，人工验证部分
工作量相对较少，因而采用了这个方法。
总之，本研究应用生物信息学手段，在转录本
序列拼接的基础上，预测了甘草 miRNA，确定了一
批甘草 miRNA 的靶基因，为认识甘草 miRNA 的生
物学功能提供了初步数据。
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