全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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思茅松松塔提取物体外抗 HIV-1研究
崔雪青 1, 2，刘 熙 2，陈 欢 1，彭 芳 2，罗荣华 1，杨柳萌 1，刘光明 2，王睿睿 1, 3*，郑永唐 1*
1. 中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室，中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223
2. 大理大学，药学与化学学院，云南 大理 671000
3. 云南中医学院，中药学院，云南 昆明 650500
摘 要：目的 研究思茅松松塔提取物（SMS-E和 SMS-F）体外对 HIV-1的抑制活性和作用机制。方法 采用MTT比色法
检测思茅松松塔提取物对 C8166细胞的毒性；合胞体抑制实验、p24抑制实验和MT-4细胞保护作用检测提取物对 HIV-1的
抑制作用。采用 HIV-1复制中间产物检测、融合阻断实验和分时给药实验判断提取物的作用机制。结果 思茅松松塔提取物
SMS-E和 SMS-F对 HIV-1有很好的抑制作用，对 HIV-1IIIB在 C8166细胞中复制的治疗指数（TI）分别为 436.46和 558.61。
HIV复制中间产物检测实验显示 SMS-F处理组 ssDNA和 Late-RT的拷贝数明显低于对照组，提示作用于病毒复制的早期；
融合阻断实验显示 SMS-F 对慢性 H9/HIV-1IIIB与 C8166 细胞融合有较好的抑制作用，EC50值为 71.03 μg/mL，说明 SMS-F
作用于病毒进入阶段；分时给药实验显示提取物对已进入细胞的 HIV-1没有抑制作用，再次证明了 SMS-F作用于 HIV进入
细胞阶段。结论 思茅松松塔提取物 SMS-F对 HIV-1有很强的抑制活性，其作用机制为抑制 HIV-1进入细胞阶段。
关键词：松塔；思茅松；艾滋病；HIV；融合阻断；病毒进入
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)11 - 1914 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.11.017
Anti-HIV-1 activities of pine cone extract from Pinus kesiya var. langbianensis in vitro
CUI Xue-qing1, 2, LIU Xi2, CHEN Huan1, PENG Fang2, LUO Rong-hua1, YANG Liu-meng2, LIU Guang-ming2,
WANG Rui-rui1, 3, ZHENG Yong-tang1
1. Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of Chinese Academy of Sciences & Yunnan Province,
Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China
2. College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali 671000, China
3. School of Chinese Meteria Medica, Yunnan University of TCM, Kunming 650500, China
Abstract: Objective To investigate the anti-HIV-1 activity and mechanism of pine cone extracts from Pinus kesiya var. langbianensis
in vitro. Methods The cytotoxicity of pine cone extract from P. kesiya var. langbianensis was examined by MTT assay; Syncytium
formation inhibition assay, p24 assay, and the HIV-1-induced MT-4 cell death assay were used to evaluate the anti-HIV-1 activity of
pine cone extract from P. kesiya var. langbianensis. HIV DNA species detection assay, cell fusion assays, and time of addition assay
were used to determine the mechanisms of the extracts. Results Pine cone extract from P. kesiya var. langbianensis named SMS-F
showed the good inhibition on HIV-1 in C8166 cells with TI value above 436.46 and 558.61, respectively. HIV-1 DNA species detection
showed that ssDNA and late-RT were lower in the SMS-F treated group than those in the control group. The result implied that the
mechanism of SMS-F might target the early stage of HIV-1 replication. SMS-F blocked the cell to cell fusion with EC50 value 71.03 μg/mL
and could not inhibit the replication of HIV-1 after entering the cell, which confirmed SMS-F targeting the HIV entry stage. Conclusion
Pine cone extract from P. kesiya var. langbianensis shows the good inhibition on HIV-1 targeting the viral entry stage.
Key words: pine cone; Pinus kesiya var. langbianensis (A. Chev.) Gaussen; HIV; fusion block; viral entry

艾滋病自 1983年在美国发现以来，如今已遍布
世界各地，给患者生活造成了沉重的影响，经过科
学工作者的不懈努力，艾滋病已成为一种可控性的
慢性疾病，但需要终身药物治疗。HIV具有高变异

收稿日期：2015-12-31
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81260632）；国家科技重大专项课题（2012ZX10001-006）
作者简介：崔雪青（1987—），男，硕士生，研究方向为抗 HIV药物。Tel: (0871)65126855 E-mail: 272116611@qq.com
*通信作者 王睿睿（1980—），女，副研究员，硕士生导师，研究方向为抗 HIV药物药效学研究。
Fax: (0871)65195684 E-mail: wangrr1980@163.com
郑永唐（1962—），男，研究员，博士生导师，研究方向为病毒免疫和抗HIV药物研究。Fax: (0871)65195684 E-mail: zhengyt@mail.kiz.ac.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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性特点，传统治疗药物易产生耐药性且价格昂贵不
易普及。寻找新靶点、廉价的抗 HIV 药物成为当务
之急[1]。松塔 Pini Conus系松科（Pinaceae）松属 Pinus
L. 植物的球果，具有成本低、来源广泛的特点，具
有很高的研究价值。在我国松塔具有悠久的药用历
史，始记于汉末的《名医别录》，《本草纲目》中对松
塔的祛痰、止咳平喘、祛风和润肠等功效有详细记载。
现代药理学研究表明松塔具有抗肿瘤[2]、抗菌[3-4]、抗
病毒[5-6]、抗氧化[7]和增强免疫功能[8]的活性。目前在
日本五针松[9]、奥地利黑松[10]、湿地松[11]、云南松[12]
等少数几种松科松属植物松塔中发现有抗 HIV-1 活
性作用的成分。思茅松 Pinus kesiya Royle ex Gordon
var. langbianensis (A. Chev.) Gaussen主要分布在云
南地区，其松塔是否具有抗 HIV-1活性尚未见报道，
本实验进行思茅松松塔提取物体外抗 HIV 作用研
究，为拓展思茅松松塔的药用价值奠定基础。
1 材料
1.1 思茅松松塔样品
思茅松松塔采集于云南省普洱市椅象镇大寨
村附近；经大理学院药学与化学学院周浓副教授鉴
定为思茅松 Pinus kesiya Royle ex Gordon var.
langbianensis (A. Chev.) Gaussen的干燥球果。
1.2 细胞与病毒
人T淋巴细胞系C8166、MT-4和H9/HIV-1IIIB均
由英国MRC，AIDS Reagent Project惠赠。HIV-1实验
株HIV-1IIIB由英国MRC，AIDS Reagent Project惠赠。
按常规方法培养制备HIV病毒。病毒感染性滴定按常
规方法进行。病毒小量分装于冻存管，−80 ℃保存。
1.3 试剂与仪器
噻唑蓝（MTT）、齐多夫定（AZT）、恩夫韦肽
（T-20）、十二烷基磺酸钠（SDS）、N,N-二甲基甲酰胺
（DMF）、Triton X-100、青霉素、硫酸链霉素、谷氨
酰胺均购自 Sigma 公司；2-巯基乙醇（2-ME）为
Bio-Rad公司产品。RPMI 1640培养基购自Gibco公
司。CO2 细胞培养箱（Thermo）；ELX800 酶标仪
（Bio-Tek）；高压灭菌锅（HIRAYAMA）；IEC CL40
离心机（Thermo）；微量移液器（Gilson）；Eclipse TS100
倒置显微镜（Nikon）；二级生物安全柜 Forma Class II。
2 方法
2.1 思茅松松塔提取物的制备
将 10 kg思茅松松塔粗粉用 85%乙醇提取 2次，
每次用乙醇 4 000 mL，每次浸泡 24 h，滤过除去乙
醇提取液，并回收乙醇；将残渣用热水提取，滤过
除去热水提取液。在室温条件下向残渣中加碱液
（pH 11）进行提取，并滤过得到碱性提取液。用醋
酸调所得碱性提取液的 pH 值至 5，浓缩、滤过，
去除沉淀。将滤液用 1倍量乙醇（85%）溶解，滤
过，得沉淀（SMS-D）12.5 g，收率为 0.25%。再将
滤液用 2 倍量乙醇（85%）溶解，滤过，得沉淀
（SMS-E）5.6 g，收率为 0.11%。继续将滤液用 5倍
量乙醇（85%）溶解，滤过，得沉淀（SMS-F）10.1
g，收率为 0.20%。经初步实验，SMS-E、SMS-F
的主要化学成分是木质素-多糖的复合体，其结构复
杂，水溶性好。SMS-E、SMS-F用无血清 RPMI 1640
培养基溶解，得到思茅松松塔提取物溶液。
2.2 病毒的滴定
将 HIV-1贮存液在 96孔板上作 5倍梯度稀释，
10个梯度，每梯度 6个复孔，每孔加入 C8166细胞
悬液 50 μL（4×105/mL），每孔终体积 200 μL。
37 ℃、5% CO2条件下培养。第 3天补加新鲜 RPMI
1640培养基 100 μL。第 7天在倒置显微镜下观察每
孔中 HIV-1诱导细胞病变效应（cytopathic effect，
CPE），以每孔是否有合胞体（syncytium）的形成
确定。按 Reed&Muench 方法计算 HIV-1 的半数组
织培养感染剂量（TCID50）。
2.3 C8166细胞毒性实验
在 96孔细胞培养板上，将 4×105/mL的 C8166
细胞悬液100 μL与100 μL不同质量浓度的待测样品
溶液混合，每个浓度 3 个复孔，同时设置不含化合
物的对照孔。37 ℃、5% CO2培养箱培养 3 d，加入
MTT溶液 20 μL，37 ℃、5% CO2条件下培养 4 h，
每孔吸弃 100 μL上清，加入 100 μL SDS-DMF溶液，
37 ℃过夜。BIO-TEK ELx800 ELISA仪测定吸光度
（A）值，测定波长为 570 nm，参考波长 630 nm。计
算细胞存活率（A 药物/A 对照），进一步计算得到对 50%
的细胞产生毒性时的化合物质量浓度（CC50）[13]。
2.4 HIV-1IIIB诱导 C8166 细胞形成合胞体的抑制
实验
通过实验考察待测样品对 HIV-1IIIB诱导 C8166
细胞形成合胞体的抑制作用。将 8×105/mL C8166细
胞 50 μL接种到含有 100 μL倍比稀释待测样品的 96
孔细胞培养板中，加入 50 μL的病毒稀释上清［感染
时病毒与细胞的比值，即感染复数（MOI）＝0.20，
约为 200 TCID50］。设 3个复孔，同时设不含化合物
的正常细胞对照孔，AZT为阳性药物对照。37 ℃、
5% CO2条件下培养 3 d，倒置显微镜下（100×）计
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数合胞体的形成。计算待测样品及阳性对照药物的抑
制合胞体形成 50%时的化合物质量浓度（EC50）[14]。
2.5 捕捉 p24抗原 ELISA方法测定 HIV-1的复制
细胞分组、加药及染毒处理同“2.4”项下操作，
1 μg/孔 Fc抗体（购自上海 Sigma-Aldrich公司）4 ℃
包被过夜；Washing Buffer洗涤 3次，2 min/次，200
μL/孔，5%脱脂奶粉 37 ℃封板 2 h；洗涤同上，加
入 100 μL/孔 10 000倍稀释鼠抗 p24单抗 P5F1（自
备），37 ℃，1 h；洗涤同上，加入 100 μL/孔裂解
上清，37 ℃，2 h；洗涤同上，加入 100 μL/孔 1∶
100稀释的兔抗 p24多抗，37 ℃，1 h；洗涤同上，
加入 100 μL/孔 1∶20 000稀释的羊抗兔 IgG-HRP
（购自上海 Sigma-Aldrich公司），37 ℃，1 h；洗涤
同上，2 min/次，加入邻苯二胺（OPD）底物反应
液。10 min后，2 mol/L硫酸终止反应，490/630 nm
读取 A值；计算 HIV-1复制的抑制率和 EC50值[14]。
2.6 HIV-1IIIB感染MT-4细胞死亡的保护实验
在 96 孔细胞培养板上，对药物进行 5 倍倍比
稀释，每个稀释度设 3孔，共 6个稀释度，每孔 100
μL。同时设置不含药物的未感染或感染 HIV-1IIIB的
细胞对照组。AZT作为阳性对照药。每孔分别滴加
8×105/mL的 MT-4细胞悬液和 HIV-1IIIB上清各 50
μL（MOI＝0.3）。每孔终体积为 200 μL。置 37 ℃、
5% CO2培养箱中培养。感染后第 3天补加 100 μL
新鲜培养基。第 5天用MTT方法用酶标仪 595/630
nm 测定 A 值。计算药物对 HIV-1IIIB感染细胞的保
护率。计算 CC50值和 EC50值[14]。
2.7 HIV-1感染和未感染细胞融合阻断检测实验
100 μL 不同质量浓度的待测样品加入 50 μL
HIV-1IIIB慢性感染 H9细胞（2×105/mL）和 50 μL
C8166 细胞（6×105/mL），以 T-20 为阳性对照，
37 ℃，5% CO2共培养 6～8 h，在倒置显微镜下计
数合胞体的形成，计算 EC50值[14]。
2.8 分时给药
将 4×105/mL C8166细胞与 10倍量的HIV-1IIIB
同步感染 2 h，800 r/min离心洗去未感染的游离病
毒，RPMI 1640重悬，100 μL每孔接种到 96孔板
上，设置 3个复孔。不同时间段（0、2、4、6、8、
12、24、48 h）加入 100 μL的终质量浓度为 100
μg/mL 待测样品（此质量浓度大于 EC50 10 倍以
上），同时设置不含药物的对照孔。融合抑制剂 T-20
为阳性药物对照。37 ℃，5% CO2培养 3 d。倒置
显微镜下（100×）计数合胞体的形成，计算药物
对合胞体的抑制率。同时，取出 100 μL细胞培养
上清，用终质量分数为 5%的 TritonX-100 裂解病
毒后，用 ELISA 方法检测 p24 抗原的表达。计算
药物对 p24抗原的抑制率[15]。
2.9 HIV复制中间产物检测实验
在 24孔板上接种 C8166细胞，每孔 1×106个，
与 HIV-1IIIB（MOI＝0.3）在 4 ℃共同孵育 2 h，每
隔 15 min轻轻摇晃，以使病毒与细胞充分接触。2 h
后离心弃去上清，PBS清洗 2遍，加入 200 μg/mL
的待测样品以及阳性对照 200 nmol/L AZT、200
nmol/L EFV（购自 US Pharmacopeia）、200 nmol/L
RAL（购自 Selleck Chemicals），同时设置不加药的
对照孔，此时计时感染 0 h。分别于感染 0、1、2、
4、6、8、12和 24 h收集细胞，1 000 r/min离心 5 min，
PBS清洗细胞 1次，使用血液基因组小量提取试剂
盒（康为世纪）提取全基因组 DNA，将标准品进行
梯度稀释，采用 TaqMan®探针法进行 qPCR。绘制
标准曲线，检测 late-RT片段[16]。
2.10 统计学方法
用 Origin Pro8.5软件进行统计学分析，组间拷
贝数差异用 Paried t-检验。
3 结果
3.1 对 C8166细胞的毒性与对 HIV-1IIIB在 C8166
细胞中复制的抑制作用
采用 MTT 比色法测定思茅松松塔提取物对
C8166细胞的毒性，通过合胞体抑制实验和 p24检测
实验测得提取物对HIV-1IIIB的抑制活性。结果 SMS-E
与 SMS-F对C8166细胞的CC50均大于 1 800 μg/mL，
合胞体抑制实验测得EC50值分别为2.31、1.69 μg/mL，
p24检测实验测得 EC50值分别为 4.15、3.84 μg/mL，
治疗指数（TI）均大于 400。阳性化合物AZT合胞体
抑制实验和 p24检测实验的 EC50值分别为 1.49、5.15
ng/mL，CC50值为 1 345.69 μg/mL。结果见表 1。
3.2 对 HIV-1IIIB感染MT-4细胞的保护作用
采用TI值较高的思茅松松塔样品SMS-F进行对
HIV-1IIIB感染MT-4细胞的保护实验，进一步探讨提
取物对HIV-1的抑制活性，MT-4细胞对HIV-1感染
敏感，感染后 5～7 d即会大量死亡，若待测样品有
抑制 HIV-1 复制的作用，则可以保护感染的 MT-4
细胞，减少死亡。研究结果显示，SMS-F 可以有效
保护感染MT-4细胞的死亡，EC50值为 18.98 μg/mL，
阳性对照 AZT的 EC50值为 1.43 ng/mL。CC50均大
于 200 μg/mL。
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表 1 思茅松松塔提取物对 HIV-1IIIB在 C8166细胞中复制的抑制作用 ( ±x s , n = 3)
Table 1 Inhibition of pine cone extract from P. kesiya var. langbianensis on HIV-1IIIB in C8166 cells ( ±x s , n = 3)
样品 测定方法 EC50/(μg·mL−1) CC50/(μg·mL−1) TI
SMS-E CPE/MTT 2.31±0.24 1 811.31±158.66 784.12
p24 4.15±0.18 436.46
SMS-F CPE/MTT 1.69±0.07 2 145.08± 55.44 1 269.28
p24 3.84±0.25 558.61
AZT CPE/MTT (1.49±0.35)×10−3 1 345.69± 39.68 903 144.30
p24 (5.15±0.03)×10−3 261 298.06

3.3 对 HIV-1IIIB慢性感染 H9 细胞和 C8166 细胞
融合的阻断作用
在融合阻断实验中，采用活性较好的样品
SMS-F 进行研究，结果测得 SMS-F 的 EC50 值为
71.03 μg/mL，阳性对照药 T-20 的 EC50值为 22.10
ng/mL。
3.4 分时给药实验结果
采用 ELISA 方法检测了 SMS-F样品分时给药
对 HIV-1 p24抗原产生的抑制作用，发现 SMS-F对
已感染的 HIV-1IIIB基本无抑制作用，与阳性对照药
T-20 对 HIV-1IIIB 抑制作用的趋势基本一致，表明
SMS-F对 HIV-1进入融合阶段有很好的抑制作用。
结果见图 1。



图 1 分时给药检测 SMS-F对 HIV-1IIIB的抑制作用
Fig. 1 Inhibition of SMS-F on HIV-1IIIB by time of addition assay
3.5 HIV复制中间产物检测实验结果
HIV-1 在复制周期中产生一些特征性的中间产
物，通过检测中间产物可以推测药物作用在 HIV-1
复制周期中的大致阶段，即明确药物的作用机制。
ssDNA为 HIV-1逆转录的起始产物，标志着 HIV-1
进入细胞，逆转录开始，这一阶段发生在病毒感染
细胞 2 h以内，因此检测感染后 0、1、2 h的 ssDNA
拷贝数，可判断药物是否作用在逆转录阶段。
Late-RT 为 HIV-1 逆转录后期产物，发生在病毒感
染细胞的 4～8 h内，检测感染后 4、6、8 h的 late-RT
拷贝数，可判断是否作用在此阶段。结果显示
SMS-F组的 ssDNA和Late-RT拷贝数均明显低于对
照组，表明 SMS-F作用在 HIV-1进入细胞或逆转录
的早期。阳性对照 T-20（HIV融合抑制剂）组 ssDNA
拷贝数和 Late-RT 拷贝数均明显低于对照组；AZT
与 EFV都是逆转录抑制剂，Late-RT拷贝数明显低
于对照组，但 AZT 并不能抑制逆转录的起始，因
此 ssDNA拷贝数未受影响；RAL为整合酶抑制剂，
对逆转录过程无作用，而且由于后面的整合过程受
阻，Late-RT产生富集，ssDNA和 late-RT拷贝数略
高于对照组。结果见图 2。
4 讨论
本研究初步评价了思茅松松塔提取物抗 HIV-1
活性及作用机制。通过合胞体实验和 p24检测方法
研究了乙醇分级沉淀获得的思茅松松塔提取物
（SMS-E和 SMS-F）体外抗 HIV-1活性，MTT方法
检验了 2个提取物对 C8166细胞的毒性作用，发现
SMS-F抗 HIV-1活性略高于 SMS-E，最大 TI值达
到 1 269。随后以 SMS-F为对象进行进一步研究，
评价其对HIV-1IIIB感染MT-4细胞的保护作用，EC50
值为 18.98 μg/mL，不同体系实验 SMS-F均显示出
了较好的抗 HIV-1活性。
本实验对SMS-F抗HIV-1作用机制进行了初步
研究，首先，通过 HIV-1复制中间产物检测实验，
检测 HIV-1 进入细胞逆转录起始产物 ssDNA 和逆
转录完成后产物 Late-RT，结果显示 SMS-F组的拷
贝数明显低于对照组，提示 SMS-F 可能作用于
HIV-1 复制早期；随后，以融合阻断实验进一步研
究发现，SMS-F 可以很好地阻断慢性 H9/HIV-1IIIB
细胞与正常 C8166 细胞的融合，说明 SMS-F 可能
作用于 HIV-1进入细胞阶段；最后，分时给药实验
发现，SMS-F对已感染的 HIV-1IIIB从 0～24 h均没
60
50
40
30
20
10
0
−10



p2
4
抗
原
抑
制
率
/%

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
t/h

SMS-F
对照
T-20
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与对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group
图 2 SMS-F对 HIV复制中间产物 ssDNA和 Late-RT的影响
Fig. 2 Effect of SMS-F on HIV-1 DNA intermediateproducts ssDNA and Late-RT
有抑制作用，这与阳性对照药 T-20的作用趋势基本
相同，证实了 SMS-F作用在病毒进入细胞阶段。通
过以上实验表明，思茅松松塔提取物 SMS-E 和
SMS-F 具有很好的抗 HIV-1 活性，SMS-F 作用于
HIV-1 进入融合阶段，通过本实验研究为进一步开
发思茅松松塔的生物利用提供了理论支持，也为寻
找新型抗 HIV药物提供思路。
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