全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 11 期 2014 年 6 月

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采用 ISSR 标记分析草珊瑚的 DNA 指纹图谱与其品质相关性
魏艺聪 1，林培玲 1，陈 莹 2，杨群雄 1，罗林泉 1，陈艺娟 1，梁一池 1*
1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122
2. 福建农林大学园林学院，福建 福州 350002
摘 要：目的 分析不同质量级别的草珊瑚样品的 DNA 指纹图谱与其品质相关性，为进一步利用这些资源进行分子辅助育
种奠定一定基础。方法 采用 ISSR-PCR 方法对 UBC801～UBC900 共 100 个 ISSR 引物进行筛选，筛选出多态性好的 ISSR
引物 23 个。利用这 23 个 ISSR 引物扩增 18 份草珊瑚样品，以 18 份草珊瑚样品的 ISSR 扩增谱带为基础，利用 Excel 文件建
立供试材料扩增条带指纹数据库。结果 共获得 198 条谱带，平均每个引物扩增出 8 条谱带，其中多态性谱带 184 条，多态
性条带比率为 92.9%。从 23 个多态性好的 ISSR 引物中遴选出 UBC811、UBC825 2 个引物中 7 个位点为一个组合，UBC827、
UBC834、UBC842 共 3 个引物中 7 个位点为另一个组合，分别建立了 18 份受试草珊瑚样品的基因组的 DNA 指纹图谱，并
从 184 条多态性谱带中筛选了出 u844-6 条带与样品质量有一定相关性。结论 ISSR 分子标记可以有效辨别 18 份受试草珊
瑚样品的 DNA 指纹图谱，并筛选获得一条与其品质有一定相关性的特征条带。
关键词：草珊瑚；ISSR；DNA 指纹图谱；品质；相关性分析
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)11 - 1620 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.11.022
Analysis on DNA fingerprints of Sarcandra glabra and correlation with its quality
using ISSR molecular markers
WEI Yi-cong1, LIN Pei-ling1, CHEN Ying2, YANG Qun-xiong1, LUO Lin-quan1, CHEN Yi-juan1, LIANG Yi-chi1
1. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China
2. College of Landscape Architecture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: Objective To analyze the correlation of DNA fingerprints of Sarcandra glabra with different quality levels and its quality.
Methods Using ISSR-PCR, 100 ISSR primers (UBC801—UBC900) were screened, and 23 of them were polymorphic. The 23 ISSR
primers were used to amplify 18 S. glabra samples from different habitats. Based on the 18 ISSR amplified bands, the data base of
amplified bands fingerprint was established using Excel. Results one hundred and ninty-eight bands were obtained. Each primer
amplified eight bands on average. The number of polymorphic DNA bands was 184, and the polymorphic proportion of DNA bands
was 92.9%. Seven sites in two primers (UBC811 and UBC825) screened from 23 polymorphic ISSR primers were in one group, and
seven sites in three primers (UBC827, UBC834, and UBC842) were in another group. The DNA fingerprints of 18 S. glabra samples
were established, and U844-6 bands were screened from 184 polymorphic bands to correlate with sample quality. Conclusion ISSR
molecular markers could identify the DNA fingerprints of 18 S. glabra samples, and screen one band that is related to the quality.
Key words: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai; ISSR; DNA fingerprint; quality; correlation analysis

草珊瑚（又名肿节风、九节茶、接骨木）为常
用中药，系金粟兰科（Chloranthaceae）草珊瑚属
Sarcandra Gardn. 植 物 草珊瑚 Sarcandra glabra
(Thunb.) Nakai 的全草[1]，主要分布于福建、浙江、
江西、安徽等省区[2-3]。草珊瑚是一种广谱中药材，
全株可入药，具有很高的药用价值。《中国药典》2005
年版列为法定药材使用，同时，以草珊瑚为原料的
草珊瑚片、血康口服液、复方草珊瑚含片也已收入
《中国药典》2010 年版，草珊瑚注射液被部颁标准
中药 14 册收载，还被广泛应用于食品、饮料、保健
品、日用化工等方面，随着用途的日益拓宽，草珊
瑚原料需求不断增加，市场前景十分广阔。近几年

收稿日期：2013-12-31
基金项目：福建省教育厅 A 类项目（JA11138）；福建省科技重大项目（2011Y4005）
作者简介：魏艺聪（1981—），男，讲师，研究方向为中药生物技术。E-mail: yicongwei@126.com
*通信作者 梁一池，教授，博士生导师，主要从事中药材品质评价与质量标准研究。E-mail: fafulyc@126.com
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来，草珊瑚野生资源急剧减少，药材质量参差不齐，
因此对其进行质量鉴定，收集优良种质，通过人工
栽培提高草珊瑚药材来源的稳定性是保障草珊瑚资
源可持续利用，以及相关制药业可持续发展的必然
要求[4]。而目前草珊瑚相关研究主要集中在生物活
性成分分析方面，运用 DNA 指纹图谱的方法进行
其药效成分与遗传多态性的相关性研究尚未见报
道，而 DNA 分子水平评价可以从遗传背景出发判
断种质材料之间的差异，为种质资源的评价提供更
加稳定、可靠的参考依据，还可为进一步分子辅助
育种，及其药物有效成分代谢相关基因的定位奠定
基础。因此很有必要进行其 DNA 指纹图谱与其活
性成分相关性的分析。
简单序列重复区间扩增多态性分子标记
（inter-simple sequence repeat，ISSR）是近年来发展
起来的十分有效的分子标记技术，具有稳定、多态
性高，简便及易操作等优点，被视为理想的遗传标
记方法[4]。目前已在多种动植物的亲缘关系、种质
鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究方
面得到应用[4-9]。传统药用植物种质资源的鉴定评价
方法依赖于宏观特征，如叶片形状等，但可用的形
态性状少且受环境影响大，因此需要高效、准确、
不受环境因素影响的鉴定技术。ISSR 技术不会受到
环境因素的影响，因此在中药材真伪品种的鉴定和
道地药材的鉴别上有很大的优势[10]。
本实验以 ISSR 多态性谱带为基础，利用 Excel
程序，绘制出 18 份草珊瑚种质资源的 DNA 指纹
图谱，并进行其 DNA 指纹图谱与其品质相关性的
分析，为进一步的分子辅助育种及药物有效成分代
谢相关基因的分析进行初步的探讨。
1 仪器与材料
PCR 仪（Eppendorf，型号 5332），电泳系统（北
京市六一仪器厂，型号 DYY—12），低温冷冻离心
机（Eppendorf，型号 5810R），凝胶成像分析仪
（ BIO-RAD ChemiDoc XRS ）， 微 量 移 液 器
（Eppendorf）。
CTAB 提取液，TAE 缓冲液，琼脂糖（Promega
公司），溴化乙锭（Fluka 公司），DNA Taq 聚合酶
（Takara 公司），三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为
国产分析纯。
本研究实验样品是由福建中医药大学梁一池教
授鉴定并收集的采自不同产地的 18 批样品，为金粟
兰科植物草珊瑚 Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai，集
中种植于福建中医药大学时珍园，本课题组已通过
HPLC特征指纹图谱分析方法对这18个草珊瑚样品
的 7 个活性成分进行了分析[11]，并按优、良、中、
差把 18 个样品进行了分级，随机编号，见表 1。
表 1 18 份样品信息
Table 1 Basic information of 18 samples
编号 产地 样品质量级别
S1 福建南平西芹 差
S2 福建南平市 中
S3 福建泉州永春 中
S4 福建泉州安溪 中
S5 广东省河源市 差
S6 福建三元岩前 高
S7 福建三元坂头 差
S8 江西省赣州市 差
S9 福建龙岩南阳 中
S10 福建三明格氏栲 差
S11 福建明溪沙溪 差
S12 福建龙岩连城 中
S13 福建漳州华安 中
S14 福建漳州平和 差
S15 福建龙岩漳平 差
S16 福建漳州永泰 差
S17 福建南平建阳 差
S18 福建福州闽侯 中

2 方法
2.1 草珊瑚基因组 DNA 的提取和纯化
采取样品的嫩叶，采用本研究室改良的 CTAB
法提取草珊瑚幼嫩叶片的基因组 DNA，用 1%琼脂
糖凝胶电泳检测。然后对所提取的草珊瑚 DNA 进
行纯化。
2.2 多态性 ISSR 引物筛选及供试材料的 ISSR 分析
以 18 个样品的基因组 DNA 为模板，对
UBC801～900 共 100 个 ISSR 引物进行多态性筛选，
ISSR 引物购自上海生工生物技术有限公司。在冰上
建立 20 μL 的 ISSR-PCR 反应体系：40 ng 模板 DNA、
0.2 mmol/L dNTPs、2.5 mmol/L Mg2+、1.0 U Taq DNA
聚合酶、0.4 μmol/L 引物。ISSR-PCR 扩增程序为 94
℃预变性 5 min；94 ℃ 45 s，31～50 ℃ 1.5 min，
72 ℃ 1.5 min，35 个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃保
存。退火温度因扩增产物的效果而调整。PCR 产物
经 1.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB 染色检测。然后
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对 18 份草珊瑚样品进行标记分析，获得扩增谱带。
2.3 扩增带谱的编号及草珊瑚 DNA 指纹图谱的绘制
对于 18 份草珊瑚样品的 ISSR 扩增谱带，只分
析清晰可辨的电泳条带。对于每条 ISSR 引物的扩
增产物，按照扩增条带的相对分子质量从大到小编
号和读取。如引物 UBC807 扩增出相对分子质量最
大的条带编为 u807-1，以此类推，将 PCR 扩增谱带
以 Excel 表格中黑框表示，把电泳结果的图形资料
转换成 Excel 表格中的黑白框的带谱图资料，将每
个 ISSR 引物对 18 份草珊瑚样品的扩增结果记录为
一张 Excel 表格，以方便进行运算分析。通过运算
分析，构建出可以辨别 18 份草珊瑚资源的 DNA 指
纹图谱。
2.4 草珊瑚 DNA 指纹图谱与质量相关性分析
为寻找与质量级别相关性的特征条带，即只在
特定某一级别或某一级别以上的样品中出现的条
带，对所获得的所有多态性谱带逐一与 18 份草珊瑚
样品的质量级别进行对比分析，筛选与某一质量级
别相关性的特殊条带。
3 结果与分析
3.1 供试材料 DNA 提取与多态性 ISSR 引物筛选
采用本实验室已建立的改良 CTAB 法提取草
珊瑚总 DNA，采用已优化的 ISSR-PCR 扩增体系，
以 S1～S18 共 18 份草珊瑚样品的基因组 DNA 为
模板，对 UBC801～UBC900 共 100 个 ISSR 引物
进行多态性筛选，采用 1.8%的琼脂糖凝胶电泳分
离扩增产物，共选出 23 个多态性较理想的 ISSR
引物（表 2）。
3.2 多态性引物对供试材料的 ISSR 分析
利用筛选出的 23 条多态性引物对 18 个草珊瑚
表 2 23 条 ISSR 引物扩增条带数与多态性比率
Table 2 Numbers and ratios of polymorphic bands amplified by 23 ISSR primers
引物 引物序列 退火温度 / ℃ 扩增带数 多态性条带数 多态性比率 / %
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 48 8 8 100.0
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 48 6 5 83.3
UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 49 8 7 87.5
UBC815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 49 9 9 100.0
UBC816 CACACACACACACACAT 47 7 7 100.0
UBC822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 48 6 6 100.0
UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 48 7 7 100.0
UBC825 ACACACACACACACACT 48 15 13 86.7
UBC827 ACACACACACACACACG 48 13 13 100.0
UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 49 6 6 100.0
UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 49 9 9 100.0
UBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 50 5 4 80.0
UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 50 6 3 50.0
UBC844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 51 6 6 100.0
UBC847 CACACACACACACACARC 51 10 10 100.0
UBC848 CACACACACACACACARG 51 10 9 90.0
UBC865 CCGCCGCCGCCGCCGCCG 70 15 15 100.0
UBC895 AGAGTTGGTAGCTCTTGATC 49 11 11 100.0
UBC831 ATATATATATATTYA 31 5 5 100.0
UBC861 ACCACCACCACCACCACC 56 9 6 66.7
UBC881 GGGTGGGGTGGGGTG 56 14 13 92.9
UBC891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 46 5 4 80.0
UBC900 ACTTCCCCACAGGTTAACACA 52 8 8 100.0
统计 198（合计） 184（合计） 92.9（均值）

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样品进行 ISSR 分析，图 1 为引物 UBC881 对 18 个
草珊瑚样品的扩增结果。从图中可以看出，18 个草
珊瑚样品的 ISSR-PCR 扩增条带清晰，可将部分不
同产地的草珊瑚样品区分开。对于 ISSR 扩增谱带，
只分析清晰可辨的电泳条带。结果表明，23 条多态
性 ISSR 引物，共扩增出 198 条谱带，平均每个引
物扩增出 8 条谱带，其中多态性谱带 184 条，多态
性条带比率为 92.9%，表明供试的草珊瑚资源遗传
多样性较丰富。根据 ISSR-PCR 扩增电泳结果，对
每条引物将 18 个草珊瑚样品的 PCR 扩增谱带以
Excel 表格中黑白框表示（图 2），在 Excel 表格中
依次录入 23 条 ISSR 引物扩增结果，以方便进行后
续的各种分析，在筛选出的 23 个 ISSR 多态性引物
中，单条引物不能完全区分 18 个草珊瑚样品，每个
多态性引物分别能扩增出 3～15 条多态性条带，如
引物 UBC825 能扩增出 15 条多态性条带，不同引
物能够区分的草珊瑚资源数不同。

M-Marker C-阴性对照 S1～S18-草珊瑚样品
M-Marker C-negative control S1—S18-S. glabra sample
图 1 18 个草珊瑚样品 UBC881 引物扩增结果
Fig. 1 Amplification results of primer UBC881
in 18 S. glabra resources

黑框表示含有引物条带，下图同
Blank means primer strap
图 2 扩增谱带筛选绘制的部分结果图
Fig. 2 Screening results of amplified bands
3.3 构建鉴别18 份供试草珊瑚样品的DNA 指纹图谱
由于没有筛选到单独一条引物可以直接鉴别
18 个草珊瑚样品，利用所有带谱以黑白框的形式
录入 Excel 表格所形成的汇总表，分析扩增产物
多态性条带的数量和所能区分的样品数目，选用
UBC811、UBC825 引物中的 7 个位点为一个组合，
UBC827、UBC834、UBC842 共 3 条引物中的 7
个位点为另一个组合，分别建立了 2 张可以区分
18 个供试草珊瑚样品的基因组的 DNA 指纹图谱，
所构建指纹图谱见图 3。构建 DNA 指纹图谱的 5
个 ISSR 引物的有关信息见表 2。

图 3 18 份草珊瑚样品的基因组 DNA 指纹图谱标准模式图
Fig. 3 Standard mode images of genome DNA fingerprints
of 18 S. glabra samples
3.4 品质相关性的特征谱带的筛选与分析
通过 HPLC 特征指纹图谱分析方法对这 18 个
草珊瑚样品的 7 个活性成分进行分析，并按优、良、
中与差把 18 个样品进行了分级，见表 1。为寻找与
质量级别相关性的特征条带，即只在特定的某一级
别或某一级别以上的样品中出现的条带，以分析特
征条带与活性成分的相关性，对所获得的 184 条多
态性谱带逐一与 18 个草珊瑚样品的质量级别进行
对比分析，筛选得到 u844-6 条带与样品质量有一定
相关性，只在中、高质量级别的 S6 及 S9 样品中出
现该条带，而不在差级别的样品中出现，但没有筛
选获得能够完全鉴别某一等级的特异性条带，而这
一相关性的条带是否具有特异性，还必须进一步进
行研究确认。
4 讨论
本研究只选取清晰可辩的 ISSR-PCR 扩增条带
进行统计分析，以确保分析结果的可靠性。ISSR 在
不同品种间扩增效果存在较大差异，不同引物在受
M C S1 S18
u811-u825
u827-u834-u842

2 000 bp


1 000 bp
750 bp

500 bp
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试样品中，最高可扩增出 15 条带，最低的只扩增
出 5 条带，其中没有筛选到一条引物可以完全区别
18 个供试样品，为降低成本和提高检测效率，在
构建 DNA 指纹图谱时，遵循利用尽量少的引物及
标记分开尽量多的品种原则，从所获得的所有带谱
中筛选标记多态性较好的引物及标记，组成了只需
2 个引物 7 个标记，或 3 个引物 7 个标记的 DNA
指纹图谱。
另外，本研究尝试利用筛选到的多态性引物对
其 DNA 指纹与其品质的相关性进行分析，初步筛
选到与受试的草珊瑚品质具有一定相关性的条带，
但是由于样本量比较少，这些条带是否具有特异性，
需要进一步分析，一是可以通过扩大样本量进行分
析，二是可以通过选出活性成分差异最大的 2 份个
体进行杂交，通过后代群体的品质变异与相关性条
带的分析，进行确认或重新筛选与分析。由于 ISSR
标记利用的是非特异引物，其扩增条带的稳定性是
相对的，如在进一步的研究中可以确认与其品质紧
密相关的标记，可将 ISSR 标记中特异性的多态性
条带回收、克隆和测序，然后转化成 SCAR 标记。
本研究尝试为受试的草珊瑚种质资源的评价提
供 DNA 指纹的参考依据，并对进一步利用这些资
源进行分子辅助育种，或其药物有效成分代谢相关
基因的定位进行初步探讨。
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