全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 23期 2015年 12月

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哈巴苷对 Aβ25-35诱导的 PC12细胞毒性的保护作用
王 飞，王剑石
南昌大学抚州医学院，江西 抚州 344000
摘 要：目的 探讨哈巴苷对 β 淀粉样蛋白（Aβ25-35）诱导的 PC12细胞毒性的影响。方法 PC12细胞以哈巴苷（20、40、
80 μmol/L）预孵育 3 h后以 Aβ25-35（30 μmol/L）损伤 24 h；MTT法检测细胞增殖；检测细胞上清液中丙二醛（MDA）、谷
胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；采用 Annexin-V-FITC双染法检测细胞凋亡率；检测活性氧（ROS）的生成；
Western blotting法检测 Akt、Bcl-2和 Bax蛋白表达。结果 与对照组比较，Aβ25-35使 PC12细胞的存活率显著降低（P＜0.01），
细胞上清液中MDA水平显著升高（P＜0.01）、GSH和 SOD水平显著降低（P＜0.01），细胞内 ROS水平显著升高（P＜0.01），
细胞凋亡率显著增加（P＜0.01），细胞内 p-Akt、Bcl-2蛋白表达下调（P＜0.01），Bax蛋白表达显著上调（P＜0.01）；哈巴
苷预孵育 PC12细胞 3 h，使细胞上清液中的MDA水平降低，GSH和 SOD水平显著升高（P＜0.05、0.01）；明显剂量依赖
性抑制细胞凋亡；上调 p-Akt和 Bcl-2蛋白表达（P＜0.05、0.01），并下调 Bax蛋白表达（P＜0.05、0.01）。结论 哈巴苷改
善 Aβ25-35诱导的 PC12细胞毒性，可能通过激活 PI3K/Akt信号通路和上调细胞内 SOD水平发挥作用。
关键词：哈巴苷；PC12细胞；β 淀粉样蛋白；细胞凋亡；氧化应激
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)23 - 3539 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.23.016
Protection of harpagide on cytotoxicity in PC12 cells induced by Aβ25-35 peptides
WANG Fei, WANG Jian-shi
Fuzhou Medical College of Nanchang University,Fuzhou 344000, China
Abstract: Objective The main purpose of the present study is to investigate the influence of harpagide on amyloid-β25-35 (Aβ25-35)-
induced cytotoxicity. Methods Oxidative stress was assessed by measuring MDA, glutathione (GSH), and superoxide dismutase
(SOD) levels. Cell viability was assessed by MTT assay. Cell apoptosis detection was performed using an Annexin-V-FITC Apoptosis
Detection Kit. The production of ROS was determined using a ROS Assay Kit. Western blotting detection was carried out to detect the
protein expression. Results Our studies showed that pretreatment with harpagide could reduce Aβ25-35-induced oxidative stress.
Harpagide markedly inhibited cell apoptosis in a dose dependent manner. More importantly, harpagide increased the PI3K/AKt and
Bcl-2 family protein ratios on pre-incubation with cells for 3 h. Conclusion One possible mechanism of harpagide to improve
Aβ25-35-induced PC12 cytotoxicity may be through the up-regulation of SOD and activation of the PI3K/AKt pathway.
Key words: harpagide; PC12 cells; amyloid-β; apoptosis; oxidative stress

阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD）的发病
率随着世界人口的老龄化而与日俱增。国内外虽然
做了大量关于该病的发病机制和临床治疗的研究，
但尚未取得满意结果。AD的发病机制比较复杂，目
前普遍接受的假说有胆碱功能低下、基因突变、炎
症和免疫反应、淀粉样蛋白沉积、氧化应激等[1-2]。
哈巴苷是玄参中的主要成分，文献报道有抗血
小板聚集、抗炎、调节免疫功能、保护血管内皮细
胞等作用[3-5]。本实验研究哈巴苷对 β 淀粉样蛋白
（Aβ25-35）诱导的 PC12细胞毒性的影响，为 AD的
研究和药物开发提供潜在的先导化合物。
1 材料
1.1 药品与试剂
哈巴苷（批号 111730-201307，质量分数＞
98%），中国食品药品检定研究院；噻唑蓝（MTT）、
丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧
化酶（SOD）试剂盒、细胞浆蛋白抽提试剂盒，南
京建成生物工程研究所；活性氧（ROS）检测试剂
盒，上海碧云天生物技术有限公司；AnnexinV/PI
细胞凋亡检测试剂盒，Bender公司；兔抗大鼠 Akt、

收稿日期：2015-05-27
作者简介：王 飞，男，讲师，硕士，从事中药药理学研究。Tel: (0794)8251803 E-mail: wangfei54321@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 23期 2015年 12月

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p-Akt、Bcl-2、Bax、β-actin和 GAPDH多克隆抗体，
美国 CST公司；山羊抗兔 IgG-HRP、DAB显色试
剂盒，上海瑞齐实业科技有限公司；Aβ25-35和其他
化学品均购自 Sigma公司。
1.2 细胞
PC12细胞购于中国科学院上海细胞库。
1.3 仪器
倒置显微镜（日本尼康）；Spectra Max M2多功能
酶标仪（Molecular Devices）；凝胶成像系统（Bio-rad）。
2 方法
2.1 MTT法检测 PC12细胞增殖
2.1.1 不同浓度 Aβ25-35 对 PC12 细胞增殖的影响
取对数生长期的 PC12 细胞 1×105/mL，接种于 96
孔板（200 μL/孔）。对照组，正常培养 PC12细胞，
Aβ25-35 处理组，PC12 细胞培养液中添加不同浓度
（1～80 μmol/L）Aβ25-35处理 24 h。于实验结束前 4 h
加入MTT试剂 20 μL/孔，继续孵育 4 h，吸掉上清，
加入 DMSO 150 μL/孔，摇床上振荡 10 min，待结
晶完全溶解后酶标仪上检测 570 nm 处的吸光度值
（A值），计算细胞存活率（实验组A值/对照组A值）。
2.1.2 哈巴苷对 Aβ25-35损伤 PC12细胞增殖的影响
取对数生长期的 PC12 细胞 1×105/mL，接种于 96
孔板（200 μL/孔）。实验分组及药物处理：对照组：
正常培养 PC12细胞，模型组：PC12细胞培养基中
加入 Aβ25-35（30 μmol/L）处理 24 h；哈巴苷组：PC12
细胞培养液中同时加入 30 μmol/L Aβ25-35及 20、40、
80 μmol/L 哈巴苷，处理 24 h。其余操作同“2.1.1”
项，计算细胞存活率。
2.2 氧化应激指标检测
细胞分组及药物处理情况：对照组，PC12细胞
不添加哈巴苷及 Aβ25-35；模型组，加入 30 μmol/L
Aβ25-35；哈巴苷低、中、高剂量组，加入 30 μmol/L
Aβ25-35及 20、40、80 μmol/L哈巴苷。
PC12 细胞培养于 6 孔板（每孔 4×104个）中
24 h，分别加入 20、40、80 μmol/L哈巴苷，预孵育
3 h，模型组和哈巴苷组加入 Aβ25-35继续培养 24 h。
胰蛋白酶消化，PBS 洗 2 次，悬浮在 500 μL PBS
中，在蛋白酶抑制剂的作用下超声裂解，4 000 r/min
离心 5 min，收集上清液进行分析。MDA、GSH和
SOD的测定按照试剂盒说明书进行。
2.3 ROS检测
细胞分组及药物处理同“2.2”项，ROS检测按
照试剂盒说明书操作。
2.4 细胞凋亡检测
细胞分组及药物处理同“2.2”项，采用 Annexin-
V-FITC 和 PI 双染凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。
胰酶消化收集细胞，冷 PBS洗涤 2次，分散在 1×
结合缓冲液中，浓度为 1×106/mL。500 μL 细胞悬
液添加 5 μL Annexin- V-FITC和 10 μL PI，于黑暗环
境中孵育 15 min，用 FACS Calibur分析凋亡数据。
正常活细胞不会被标记，早期凋亡细胞可被
Annexin V标记，坏死和晚期凋亡细胞可被 Annexin
V和 PI同时标记。
2.5 Western blotting法检测蛋白表达变化
除了不设对照组外，细胞分组及药物处理同“2.2”
项，胰蛋白酶 EDTA消化收集细胞，PBS洗 2次，用
缓冲液（1 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、100
μg/mL 苯甲基磺酰氟和 50 mmol/L Tris-HCl，pH值为
7.5）在冰上裂解 30 min，无颗粒的上清液经 14 000 ×
g离心 15 min，取上清。所有操作均在 0～4 ℃ 进行。
抽提的蛋白样品加入 1/5 体积的 5×上样缓冲液，沸
水中煮 5 min，20 μg/孔上样，进行 SDS-PAGE电泳，
电转至 PVDF膜上，室温封闭 1 h，分别加入 1∶1 000
稀释的兔抗大鼠Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax抗体，β-actin
和 GAPDH 分别作为内参，4 ℃过夜。TBST 洗膜 3
次，加入 1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊
抗兔 IgG，室温孵育 2 h，TBST洗膜 3次，ECL发光
液显色，观察各条带深浅变化，采用 Image-Pro Plus
（IPP）软件分析蛋白浓度。
2.6 统计方法
实验数据用 ±x s表示，采用 SPSS 19.0统计学
软件进行数据分析，两组间比较采用 t 检验；多组
间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
LSD-t检验。
3 结果
3.1 Aβ25-35对 PC12细胞增殖的影响
不同浓度 Aβ25-35处理细胞 24 h后，测定细胞活
力。Aβ25-35在 20～80 μmol/L 均可显著抑制 PC12
细胞活力（P＜0.05、0.01），且随浓度的升高，抑
制作用逐渐增强，表现出浓度依赖性。结果见图 1。
Aβ25-35 30 μmol/L时细胞存活率在 50%左右，因此
后续实验均选择该浓度进行 Aβ25-35损伤。
3.2 哈巴苷对 Aβ25-35诱导的细胞毒性的影响
随着哈巴苷浓度的增加，细胞存活率也随之升
高，模型组细胞存活率为 43.3%，哈巴苷 80 μmol/L
组的细胞存活率为 83.9%（P＜0.01）。结果见图 2。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 23期 2015年 12月

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与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
**P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below
图 1 Aβ25-35对 PC12细胞活力的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 1 Effect of Aβ25-35 on cell viability of PC12 cells
( x ±s, n = 3)


与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同
#P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below
图2 哈巴苷对Aβ25-35损伤PC12细胞活力的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 2 Effect of harpagide on cell viability of PC12 cells
injuried by Aβ25-35 ( x±s, n = 3)
3.3 对 Aβ25-35诱导的氧化应激损伤的影响
与对照组比较，模型组细胞内MDA水平明显增
加，GSH、SOD水平显著下降（P＜0.01）；与模型组
比较，哈巴苷组细胞内MDA水平显著降低（P＜0.05、
0.01），GSH水平显著升高（P＜0.01），中、高剂量组
SOD水平显著升高（P＜0.01）。结果见表 1。
表 1 哈巴苷对Aβ25-35诱导 PC12细胞氧化应激损伤的影响
( x±s, n = 3)
Table 1 Effects of harpagide on parameters of Aβ25-35-
induced oxidative stress in PC12 cells ( x±s, n = 3)
组别 剂量/
(μmol·L−1)
MDA/
(nmol·mg−1)
GSH/
(U·mg−1)
SOD/
(U·mg−1)
对照 14.3±1.6 748±46 28.4±0.3
模型 59.8±5.6** 257±43** 12.2±1.4**
哈巴苷 20 45.2±3.3# 421±24## 14.6±2.6
40 25.6±1.8# 521±57## 24.8±3.8##
80 18.7±4.3## 724±37## 26.2±0.9##
3.4 对 Aβ25-35诱导的细胞内 ROS的影响
与对照组比较，模型组细胞中 ROS 水平显著
增加（P＜0.01），哈巴苷显著降低 ROS 水平，呈
剂量依赖性，40、80 μmol/L 组与模型组比较差异
显著（P＜0.05、0.01）。结果见图 3。
3.5 对 Aβ25-35诱导的细胞凋亡的影响
与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显增加
（P＜0.01）；哈巴苷显著降低凋亡率并呈剂量依赖
性，中、高剂量组与模型组比较差异显著（P＜0.01）。
结果见图 4。


图 3 哈巴苷对 Aβ25-35 损伤 PC12 细胞内 ROS 的影响
( x±s, n = 3)
Fig. 3 Effect of harpagide on intracellular ROS in PC12
cells injuried by Aβ25-35 ( x±s, n = 3)
3.6 对 Bcl-2家族蛋白表达的影响
各组细胞中的总 Akt蛋白水平无明显差异，模
型组 p-Akt 蛋白表达相比对照组下降明显（P＜
0.01）；哈巴苷处理后的 p-Akt 蛋白表达显著上调
（P＜0.05、0.01），呈明显剂量关系；哈巴苷明显上
调 Bcl-2、下调 Bax蛋白表达，并呈剂量依赖性。结
果见图 5。
4 讨论
AD 的 3 个主要病理特征为胆碱能神经元功能
障碍、β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积和 tau 蛋白的过度
磷酸化[6]。Aβ 和 tau蛋白的胞间转移受到越来越多
的关注，虽然其与脑功能退化的联系机制不明，但
Aβ 级联假说仍在 AD病因中占主导地位。随着大量
降低 Aβ 的临床试验并未获得预期的治疗效果，重
新认识和深入了解 Aβ 级联假说十分必要[7-8]。目前，
不再认为不溶性 Aβ 在胞外沉积是 AD 发病的主要
原因[9-10]，众多实验证实细胞内低聚 Aβ 的异常聚集
是 AD的主要病理表现[11-12]。越来越多的研究开始
关注细胞内 Aβ 级联反应和子细胞器，特别是线粒
体功能障碍之间的关联[13-15]。据报道，线粒体 Aβ
水平与 APP 或 APP/PS1 转基因小鼠不同脑区线粒
100
80
60
40
20
0

细
胞
存
活
率
/%

对照 1 5 10 20 30 40 50 60 80
Aβ25-35/(μmol·L−1)
对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
100
80
60
40
20
0

细
胞
存
活
率
/%

对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
600
500
400
300
200
100
0

R
O
S
相
对
荧
光
强
度

*
** ** **
**
**
##
#
##
#
**
**
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对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)



图 4 哈巴苷对 Aβ25-35诱导的 PC12细胞凋亡的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 4 Attenuation of harpagide on Aβ25-35-induced apoptosis in PC12 cells ( x±s, n = 3)




图 5 Western blotting检测 Akt和 Bcl-2蛋白表达变化 ( x±s, n = 3)
Fig. 5 Detection on expression levels of Akt and Bcl-2 proteins by Western blotting ( x±s, n = 3)
体功能障碍程度呈正比，AD 转基因小鼠认知功能
损害的程度可能与突触线粒体功能障碍以及线粒体
Aβ 程度相关[16-17]。因此针对 Aβ 相关的线粒体功能
障碍，特别是阻止线粒体 Aβ 积累将是一个很有前
途的防治 AD的手段。
由氧化应激损伤、能量缺乏和线粒体去极化所
导致的线粒体缺失常见于Aβ诱导的细胞模型和Aβ
过表达的动物模型[13]。本研究发现，哈巴苷能有效
降低 Aβ 诱导的细胞毒性。除了寻找氧化损伤的指
标，还研究了几种重要的抗氧化剂，如 GSH和 SOD
水平，在 AD和其他神经系统疾病中，GSH和 SOD
的表达降低[18-19]，本实验结果表明哈巴苷组细胞中
GSH 和 SOD 水平较模型组明显增加。细胞凋亡加
快神经退行性疾病的病理进程，哈巴苷组较模型组
对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
p-
A
kt
/A
kt

8
6
4
2
0

B
cl
-2
/B
ax

p-Akt
Akt
β-actin



Bcl-2
Bax
GAPDH



**
##
##
#
##
##
105
104
103
102
101


105
104
103
102
101


105
104
103
102
101


105
104
103
102
101


105
104
103
102
101


101 102 103 104 105


101 102 103 104 105


101 102 103 104 105


101 102 103 104 105

101 102 103 104 105

100
80
60
40
20
0

60
50
40
30
20
10
0

对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
对照 模型 20 40 80
哈巴苷/(μmol·L−1)
活
细
胞
比
例
/%

细
胞
凋
亡
率
/%

5
4
3
2
1
0

##
#
*
##
##
**
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活细胞比例显著增加，凋亡程度明显减轻。
PI3K/Akt 信号通路是介导多种生长因子促存
活的重要通路，独立于MAPK、PKC通路。非磷酸
化的 Akt蛋白不具备生物活性，可经 PI3K/Akt信号
通路磷酸化生成 p-Akt 而活化，随后 p-Akt 磷酸化
一系列凋亡调控蛋白，如 Bcl-2、caspase-9、GSK-3β、
BAD等，调节细胞的分裂、分化和存活[20]。本实验
中，PC12细胞经 Aβ25-35诱导后，p-Akt蛋白表达减
少，哈巴苷增加 p-Akt蛋白表达，总 Akt蛋白表达
几乎不变。Bcl-2 的表达明显上调，而 Bax 的表达
明显下调。细胞凋亡过程中最重要的调节因子就是
Bcl-2家族，该家族根据功能不同分为 2类，一是促
凋亡成员，如 Bax、Bad等；另外是抗凋亡成员，如
Bcl-2、Bcl-xl等。Bcl-2/Bax蛋白之间的比例是决定
对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。本实验表明，
激活 PI3K/Akt 通路，进而上调 Bcl-2、下调 Bax 的
表达，增加 Bcl-2/Bax值，抑制细胞凋亡，可能是哈
巴苷保护 Aβ 诱导 PC12细胞氧化损伤的机制之一。
本研究首次发现哈巴苷改善 Aβ 诱导的 PC12 细
胞损伤。哈巴苷可以增加细胞存活率，降低细胞凋亡
和细胞毒性，并改善各种氧化应激指标。研究结果提
示哈巴苷作为潜在的治疗AD的先导化合物，值得深
入研究。
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