全 文 ：类叶升麻苷对谷氨酸损伤 PC12 细胞的保护作用*
彭晓明1，霍仕霞1，高莉1，何燕2，闫明1
(1．新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学实验室，乌鲁木齐 830049;2．石河子大学药学院，
石河子 832003)
摘 要 目的 研究类叶升麻苷对谷氨酸诱导的 PC12细胞损伤的影响。方法 将 PC12 细胞分为正常对照组、模型
对照组、阳性药组和类叶升麻苷给药组。除正常对照组外，其余各组均以 1． 5 mmol·L －1谷氨酸处理 24 h，再分别以
10 μmol·L －1维生素 E 和 15． 625，31． 25，62． 5，125，250 μmol·L －1类叶升麻苷作用。通过倒置显微镜观察细胞形态，采用
四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率，酶标法试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸(TBA)法试剂盒
测定丙二醛(MDA)含量，WST［2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯基)-2 氢-四唑盐，二钠盐］法试剂盒测定超
氧化物歧化酶(SOD)活性，酶联免疫吸附法(ELISA)检测胞内活性氧(ＲOS)含量。结果 与模型对照组比较，除类叶升麻
苷Ⅰ组(15． 625 μmol·L －1AS)以外，其余各类叶升麻苷给药组均可明显改善 PC12细胞形态，提高细胞存活率和 SOD酶活性
(P ＜0． 01)，抑制 LDH活性及 MDA和 ＲOS生成(P ＜0． 01或 P ＜0． 01)。结论 类叶升麻苷对谷氨酸诱导的 PC12 细胞损
伤具有保护作用。
关键词 类叶升麻苷;谷氨酸;PC12 细胞;损伤;保护作用
中图分类号 Ｒ286;Ｒ965 文献标识码 A 文章编号 1004 － 0781(2015)03 － 0302 － 04
Protective Effects of Acteoside on PC12 Cell Injury Induced by Glutamate
PENG Xiaoming1，HUO Shixia1，GAO Li1，HE Yan2，YAN Ming1(1． Prescription Laboratory of Xinjiang Tradi-
tional Uyghur Medicine，Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China ;2． Pharma-
ceutical College of Shihezi University，Shihezi 832003，China)
ABSTＲACT Objective To investigate the effect of acteoside on injury PC12 cells induced by glutamate． Methods
PC12 cells were assigned into normal control group，model control group，positive drug group and acteoside(AS)treated group．
Every group was treated by 1． 5 mmol·L －1 glutamate for 24 hours except for the control group，and the injury was antagonized by
10 μmol·L －1 Vit E and acteoside at different concentration(15． 625，31． 25，62． 5，125 and 250 μmol·L －1)． Cell morpholo-
gy was observed by inverted microscope，cell survival was determined with MTT，LDH activity was measured by enzyme label
kit，the MDA content and SOD activity were measured by TBA kit and WST kit，and the ＲOS was measured by Elisa kit．
Ｒesults Compared with the model control group，all doses of acteoside could significantly improve the PC12 cell morphology and
survival(P ＜ 0． 05)，inhibit LDH activity and production of MDA and ＲOS (P ＜ 0． 05) ，increase the activity of SOD (P ＜ 0．
05) ，except for the lowest dose group． Conclusion Acteoside has protective effects on PC12 cells injured by glutamate．
KEY WOＲDS Acteoside;Glutamate;PC12 cell;Injury;Protective effect
谷氨酸是哺乳动物脑内含量最高的氨基酸，其作
为中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，不仅参与
突触传递，还具有神经毒性［1-2］。目前研究表明［3］，谷
氨酸是引起神经退行性疾病———阿尔茨海默病
(Alzheimer’s disease，AD)的重要因素。谷氨酸在脑
收稿日期 2014 － 03 － 20 修回日期 2014 － 04 － 15
基金项目 * 新疆维吾尔自治区科研机构创新发展基金项
目(2012015) ;新疆维吾尔自治区公益性科研院所基金项目
(KY2013103)
作者简介 彭晓明(1983 －)，男，湖南祁东人，助理研究
员，硕士，研究方向:细胞与分子药理学。电话:0991 －
2565663，E-mail:pxm1983@ 163． com。
通信作者 闫明 (1959 －)，男，山西原平人，研究员，硕
士，研究方向:药物分析与新药研发。电话:0991 － 2565663，E-
mail:yanming21cn@ sohu． com。
内过度释放可使神经细胞内钙离子(Ca2 +)和氧自由
基升高，诱发成对螺旋样细丝(paired helical filaments，
PHF)形成，最终导致大量神经元死亡［4］。因此，研究
安全有效的谷氨酸神经毒性阻断药物，是临床神经科
学急需解决的问题。类叶升麻苷(acteoside，AS)是传
统补益中药肉苁蓉中的苯乙醇苷类活性成分。既往研
究表明［5-7］，AS对 D-半乳糖所致的小鼠 AD样模型、东
莨菪碱所致的小鼠学习记忆障碍模型，以及过氧化氢
(H2O2)诱导的 PC12 细胞氧化损伤模型均具有明显改
善作用。以上研究结果提示，AS 在防治 AD 方面具有
潜在应用价值。笔者在本实验中通过谷氨酸诱导
PC12 细胞损伤，研究 AS对 PC12 细胞的保护作用，以
期为该药治疗 AD提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 药物与试剂 AS由新疆维吾尔自治区维吾尔医
·203· Herald of Medicine Vol. 34 No. 3 March 2015
药研究所制备(批号:20130401) ，其化学结构经磁共
振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱(HPLC)面积
归一化法鉴定含量 ＞ 90%;ＲPMI-1640 培养液为 GIB-
CO 产品(批号:1181347);胎牛血清为 Hyclone 产品
(批号:NXA0547)。氨苄西林钠(批号:119A035，含量
≥98%)和硫酸链霉素(批号:423A058，含量≥98%)
购自 Solarbio公司。丙酮酸钠购自天津市光复精细化
工研究所(批号:20071022，含量≥99%)。谷氨酸(含
量≥99%)为上海源叶生物科技有限公司产品(批号:
YY10038)。Ｒat ＲOS Elisa Kit 购自 Ｒ＆D 公司(批号:
201311)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测
定试剂盒(批号:20131202)、超氧化物歧化酶(super-
oxide dismutase，SOD)测定试剂盒(批号:20131202)、
微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(批
号:20131130)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)
蛋白含量测定试剂盒(批号:20131204)均购自南京建
成生物工程研究所。
1． 2 仪器 超净工作台(苏净安泰，型号:SW-CJ-
1F)，倒置显微镜(上海光学六厂，型号:37XB) ，二氧
化碳(CO2)培养箱(Sanyo，型号:MCO-18AIC) ，酶标仪
(Thermo Fisher，型号:Multiskan Go 1510)。
1． 3 细胞的培养 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 PC12
细胞系(高分化)购自中国科学院细胞库。将 PC12 细
胞以 5 × 105个·mL －1接种于含 10 % 胎牛血清、
0． 11 g·L －1丙酮酸钠、2． 5 g·L －1葡萄糖、1． 5 g·L －1
碳酸 氢 钠 (NaHCO3)、100 U · mL
－1 青 霉 素 和
100 U·mL －1链霉素的 ＲPMI-1640 培养液中，置于
37 ℃，5 %CO2培养箱培养，每隔 3 d换液 1 次。
1． 4 细胞损伤模型的建立及给药 当培养瓶中 PC12
细胞融合率达到约 80 %时，用含 10 %胎牛血清的 ＲP-
MI 1640 培养液吹打下来，调节细胞密度至 5 ×
104个·mL －1，以每孔 100 μL 铺至 96 孔培养板。细胞
培养 48 h后，分别设定 8 组:①正常对照组(N组，无血
清 ＲPMI-1640培养液);②模型对照组(M 组，无血清
ＲPMI-1640培养液) ;③阳性药组(C 组，10 μmol·L －1
维生素 E);④ASⅠ组(15． 625 μmol·L －1 AS 溶液) ;⑤
AS Ⅱ组 (31． 25 μmol·L －1 AS 溶 液) ;⑥ AS Ⅲ组
(62． 5 μmol·L －1AS 溶液) ;⑦AS Ⅳ组(125 μmol·L －1
AS溶液) ;⑧AS Ⅴ组(250 μmol·L －1 AS 溶液)。除 N
组外，其余各组均用 1． 5 mmol·L －1谷氨酸诱导 24 h，吸
弃培养液，给予上述药物处理。各组细胞继续培养 24 h
后，倒置显微镜下观察形态并摄像。
1． 5 噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法测定
细胞存活率 将细胞接种于 96孔培养板，培养 48 h，经
“1． 4”项方法处理后加入 MTT，继续培养4 h，吸弃培养
液，加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)震荡溶解，
于 Multiskan Go 1510酶标仪测定490 nm处吸光度值(A
值)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)= A给药 /A正常 ×
100%，N组细胞存活率记作 100%。
1． 6 细胞上清液中生化指标测定 将“1． 4”项各组
细胞与药物共培养 24 h 后，分别收集培养上清液
40 μL，根据说明书测定细胞培养液中 LDH活性、MDA
含量和 SOD活性。
1． 7 细胞内活性氧(reactive oxygen species，ＲOS)测
定 将细胞按“1． 4”项处理，吸弃培养上清液，加入磷酸
盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS，pH 7． 2 ～
7． 4)50 μL，于 － 80 ℃冰箱反复冻融，以使细胞裂解。
然后2 000 r·min －1(r =13． 5 cm)离心15 min，收集上清
液用于测定蛋白浓度及 ＲOS 含量。ＲOS 测定方法:参
照试剂盒说明书，稀释标准品并在酶标包被板上设定标
准孔 15 孔，空白孔 3 孔。在酶联免疫吸附(enz-
ymelinked immunosorbent assay，ELISA)板的空白孔和测
定孔中分别加入样品稀释液 40 μL，吸取测定样品 10
μL加入待测孔。封板膜封板置于 37 ℃温育30 min。
小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静
置 30 s后弃去，如此重复 5 次，拍干。然后每孔加入酶
标试剂 50 μL(空白孔除外)。37 ℃温育 30 min、洗涤液
洗涤 5次，拍干。每孔加入显色剂 A 和显色剂 B 各 50
μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色 15 min。每孔加终止
液 50 μL，450 nm测定 A值。之后以标准品浓度为横坐
标，A值为纵坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程。
由线性回归方程得出测定样品中的 ＲOS浓度(C)，然后
计算样品中实际 ＲOS 浓度。样品中实际 ＲOS 浓度 = C
(U·mL －1) × 稀 释 倍 数 /待 测 样 本 蛋 白 浓 度
(mg·mL －1)。
1． 8 统计学方法 实验数据采用 SPSS17． 0 版软件处
理，所有数据均采用均数 ±标准差(x ± s)表示，应用 t 检
验进行显著性检验，以 P ＜0． 05表示差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 AS对 PC12 细胞损伤后形态的影响 见图 1。N
组 PC12细胞轮廓层次较分明，立体感及折光性较强，突
触明显且较多，数量也较多。M组细胞轮廓层次较差，
神经元胞体表面粗糙，且细胞突触减少。与 N组比较，
15． 625 μmol·L －1 AS作用后细胞无明显改善，其余 AS
给药组 PC12细胞立体感、折光性增强，细胞突触增多并
交织成网状，胞质内颗粒物减少，退化死亡的 PC12 细胞
明显减少，提示 AS 在 31． 25 ～ 250 μmol·L －1浓度范
围内对 PC12细胞具有保护作用。
·303·医药导报 2015 年 3 月第 34 卷第 3 期
书2． 2 AS 对 PC12 细胞存活率、ＲOS、LDH、MDA 和
SOD的影响 见表 1。1． 5 mmol·L －1谷氨酸诱导
PC12 细胞 24 h后，细胞存活率和 SOD活性明显降低，
ＲOS含量、LDH活性和 MDA含量显著升高，表明谷氨
酸致 PC12 细胞损伤模型诱导成功。与 M 组比较，AS
Ⅰ组 PC12 细胞存活率、ＲOS、LDH、MDA 和 SOD 等无
明显改变，其他 AS给药组 PC12 细胞存活率和 SOD活
性显著提高(P ＜ 0． 01)，LDH 活性和 ＲOS、MDA 的生
成被抑制(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ，且随着给药浓度的增
大，保护作用越强。
3 讨论
AD作为中枢神经系统退行性疾病之一，是继心
血管病、脑血管病和恶性肿瘤之后老年人致死的重要
诱因。目前其发病机制主要有胆碱能学说、β-淀粉样
蛋白假说、Tau 蛋白假说、神经血管假说、氧化应激学
说等［8］。近年来越来越多的证据表明［9-10］，兴奋性氨
基酸毒性与 AD 的发生、发展关系极其密切。谷氨酸
是哺乳动物中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质，参
与中枢兴奋性突触传递。其介导的信号转导，构成记忆
和认知的基础。当脑内多余的谷氨酸过度激活谷氨酸
受体时，Na +、Ca2 +大量内流，引起细胞内外离子失衡，
造成大量神经元死亡。研究资料已证实［11］，对谷氨酸
的 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NM-
DA)受体进行持续刺激，可产生神经毒性效应。PC12
A． N组;B． M组;C． C组;D． ASⅠ组;E． ASⅡ组;F． ASⅢ组;G． ASⅣ组;H． ASⅤ组
图 1 8 组 PC12 细胞形态学观察结果(×200)
A． group N;B． M group;C． C group;D． ASⅠgroup;E． ASⅡgroup;F． ASⅢ group;G． AS Ⅳgroup;H． ASⅤgroup
Fig． 1 Morphological observation of eight groups of PC12 cells(×200)
表 1 8 组 PC12 细胞存活率、LDH活性、SOD活性、MDA含量及 ＲOS含量测定结果
Tab． 1 Determination on cell survival rate，LDH activity，MDA content，SOD activity and ＲOS content in eight groups of
PC12 cells x ± s，n = 6
组别
浓度 /
(μmol·L －1)
细胞存活率 /
%
LDH活性 SOD活性
(U·L －1)
MDA含量 /
(nmol·mL －1)
ＲOS含量 /
(U·mg －1)
N组 … 100． 00 176． 85 ± 62． 13 8． 30 ± 0． 59 6． 00 ± 0． 82 360． 90 ± 31． 34
M组 … 65． 61 ± 5． 66 475． 40 ± 41． 83* 1 1． 85 ± 0． 31* 1 9． 01 ± 0． 84* 1 468． 74 ± 16． 83* 1
C组 10 121． 08 ± 2． 25* 2 343． 54 ± 60． 56* 3 11． 13 ± 6． 80* 2 7． 06 ± 1． 44* 3 294． 28 ± 45． 55* 2
AS Ⅰ组 15． 625 75． 86 ± 8． 61 454． 26 ± 94． 39 1． 97 ± 0． 69 8． 19 ± 0． 57 431． 86 ± 45． 73
AS Ⅱ组 31． 25 159． 53 ± 8． 34* 2 329． 17 ± 58． 85* 3 4． 93 ± 0． 31* 2 8． 83 ± 0． 51* 3 395． 06 ± 38． 43* 2
AS Ⅲ组 62． 5 231． 21 ± 8． 43* 2 304． 11 ± 59． 14* 2 10． 69 ± 0． 71* 2 6． 78 ± 0． 87* 2 380． 63 ± 56． 00* 3
AS Ⅳ组 125 466． 03 ± 20． 54* 2 271． 77 ± 16． 53* 2 13． 13 ± 0． 49* 2 6． 80 ± 1． 44* 2 331． 24 ± 52． 96* 2
AS Ⅴ组 250 555． 91 ± 23． 21* 2 216． 87 ± 97． 37* 2 17． 48 ± 0． 23* 2 5． 90 ± 1． 31* 2 270． 82 ± 45． 68* 2
与 N组比较，* 1P ＜ 0． 01;与 M组比较，* 2P ＜ 0． 01，* 3P ＜ 0． 05
Compared with group N，* 1P ＜ 0． 01;Compared with group M，* 2P ＜ 0． 01，* 3P ＜ 0． 05
·403· Herald of Medicine Vol. 34 No. 3 March 2015
细胞膜上存在大量 NMDA 受体。在神经生长因子
(nerve growth factor，NGF)作用下，其与交感神经细胞
的形态、结构和功能类似，成为近年来医学工作者研究
神经细胞递质合成、储存和释放，以及离子通道及受体
的细胞模型。因此本研究利用不同浓度 AS 作用于谷
氨酸诱导损伤后的 PC12 细胞，从兴奋性氨基酸的神经
毒性方面研究 AS 对 AD 的治疗作用。结果表明，AS
能显著改善谷氨酸诱导损伤后的 PC12 细胞存活率及
细胞形态。神经元胞体特征由最初的表面粗糙、细胞
突触和细胞数量减少，逐渐转变为立体感、折光性增
强，细胞突触增多。
LDH是细胞内的标志酶，通常情况下细胞内漏出
量很少。但细胞受损后，LDH 由胞内渗漏至胞外。因
此，测定细胞上清液中的 LDH活性能够客观衡量细胞
损伤或死亡程度［7］。ＲOS是以自由基和非自由基形式
存在的高度活性的活性氧，普遍存在于细胞内。正常
生理状态，ＲOS在细胞内的浓度受胞内内源性抗氧化
基因的调控，保持动态平衡。当机体受外部环境影响，
活性氧动态平衡被打破，就会使细胞中的 DNA、蛋白
质和细胞膜受到损伤，进而影响有丝分裂、突变及死
亡［12］。因此，ＲOS水平也是细胞损伤程度的重要评价
指标。MDA是脂质过氧化产物，常作为脂质过氧化的
评价标准之一。SOD是细胞质和线粒体中的一种金属
蛋白酶，也是细胞内重要的抗氧化剂，其含量和活性大
小是 抗 氧 化 能 力 的 直 接 反 映。本 研 究 利 用
1． 5 mmol·L －1谷氨酸诱导 PC12 细胞 24 h后，与 M组
比较，除 ASⅠ组外，其余各给药组均细胞 SOD 活性显
著提高，LDH、MDA 和 ＲOS 的生成抑制。研究结果提
示，AS在 31． 25 ～ 250 μmol·L －1浓度范围内，对谷氨
酸所致 PC12 细胞损伤具有显著保护作用，其保护机制
可能与抗氧化有关，但具体作用机制仍需进一步研究。
参考文献
［1］ 秦传勇．大豆苷元对谷氨酸体外诱导海马神经元损伤大
鼠的保护作用［J］．医药导报，2010，29(1) :25 － 27．
［2］ 朱加应，张广云，王建怡，等．雌激素及雌激素受体 α 减
轻谷氨酸对神经细胞的损伤［J］． 中国病理生理杂志，
2013，30(1) :121 － 127．
［3］ 盛国红，孙琳，朱丽萍．阿尔茨海默病的致病因素和发病
机制研究进展［J］． 中国临床保健杂志，2014，17(2) :
210 － 213．
［4］ 杨彦玲，胡刚．谷氨酸转运体与神经退行性疾病［J］．中
国临床药理学与治疗学，2003，8(2) :227 － 231．
［5］ 高莉，林娟，张富春，等．类叶升麻苷对 D-半乳糖致衰老
小鼠抗氧化作用的研究［J］．中国药理学通报，2013，29
(10):1440 － 1443．
［6］ 林娟，高莉，霍仕霞，等． 类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠
学习记忆障碍的改善作用［J］． 中国中药杂志，2012，37
(19):2956 － 2959．
［7］ 彭晓明，高莉，甘萍，等．类叶升麻苷抗 H2O2诱导的 PC12
细胞氧化损伤的保护作用［J］．中药药理与临床，2013，
29(3):35 － 38．
［8］ 王玲，朱鸣峰．阿尔茨海默病发病机制的研究进展［J］．
吉林医学，2013，34(3):531 － 532．
［9］ 陈世伟，张峰，张黎明． 谷氨酸对神经细胞凋亡的影响
［J］．山西医药杂志，2010，39(9) :801 － 803．
［10］ KYUNG A K，SEUNG H K，TAE H O，et al． Acteoside
and its aglycones protect primary cultures of rat cortical
cells from glutamate-induced excitotoxicity［J］． Life Sci，
2006，79(7) :709 － 716．
［11］ YANG J S，WU X H，YU H G，et al． NMDA Ｒeceptor-medi-
ated neuroprotective effect of the scutellaria baicalensis
georgi extract on the excitotoxic neuronal cell death in pri-
mary rat cortical cell cultures［J］． Sci World J，2014，2014:
459549．
［12］ LUKIW W J，BJATTACHAＲIEE S，ZHAO Y，et al． Gener-
ation of reactive oxygen species (ＲOS)and pro-inflammato-
ry signaling in human brain cells in primary culture［J］． J
Alzheimers Dis Parkinsonism，2012(Suppl 2) :S1 － S11．
DOI 10． 3870 /yydb． 2015． 03． 005
·503·医药导报 2015 年 3 月第 34 卷第 3 期