全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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酶促构建葡萄糖修饰脑靶向载紫杉醇脂质体制备处方及其工艺优化
聂 华，梁 香，赵 莹，张声源*
嘉应学院医学院，广东 梅州 514031
摘 要：目的 在非水相中利用酶法合成脑靶向脂质材料胆固醇-癸二酸-葡萄糖酯［(5-cholesten-3β-yl)(D-glucopyranose-6)
sebacate，CHS-SE-GLU］，并对其修饰的载紫杉醇脂质体制备处方及其工艺进行优化。方法 以 D-葡萄糖和前期合成的胆固
醇-癸二酸单烯酯（CHS-SE）为原料，在丙酮中用利用脂肪酶 Novozym 435催化合成 CHS-SE-GLU，利用MS、NMR对产
物进行结构表征，采用薄膜分散法制备 CHS-SE-GLU修饰的脑靶向载紫杉醇脂质体（GLU-PTX-LP），并通过单因素考察对
其制备处方及工艺进行优化。结果 合成的 CHS-SE-GLU经 MS、NMR鉴定为目标产物，对其修饰的 GLU-PTX-LP最佳制
备处方工艺为采用氢化大豆磷脂（HSPC）作为膜材，HSPC 与紫杉醇（PTX）比例为 0.1∶1，胆固醇（CHS）与 HSPC 比
例为 0.5∶1，二硬脂酰磷脂酰甘油钠（DSPG-Na）用量为 2.5%，水化时间为 0.5 h，水化温度为 50 ℃。采用上述工艺处方
制备 3批样品，测定包封率分别为（93.62±1.34）%、（93.75±1.77）%、（92.04±1.50）%，平均粒径分别为（89.56±1.35）、
（92.05±3.42）、（104.91±3.71）nm，Zeta 电位分别为（−25.21±0.27）、（−26.43±0.44）、（−25.17±0.65）mV。结论 采用
生物酶催化法合成脑靶向脂质材料，工艺简单，产率高，绿色环保；用其修饰的 GLU-PTX-LP 包封率、粒径及稳定性均符
合要求，应用前景良好。
关键词：胆固醇衍生物；脂质体；葡萄糖转运蛋白；酶促；脑靶向；非水相；薄膜分散法；紫杉醇；生物酶催化法
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)11 - 1867 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.11.010
Lipase-catalyzed construction of glucose-modified brain targeting liposomes with
paclitaxel and research on its optimized preparation process
NIE Hua, LIANG Xiang, ZHAO Ying, ZHANG Sheng-yuan
Medical College of Jiaying University, Meizhou 514031, China
Abstract: Objective To synthesize brain targeting lipid material [(5-cholesten-3β-yl)(D-glucopyranose-6) sebacate, CHS-SE-GLU]
by lipase as catalyst in nonaqueous phase and optimize the preparation technology and formulation of CHS-SE-GLU-modified
liposomes. Methods CHS-SE-GLU was synthesized from CHS-SE prepared in previous work and D-glucose using lipase Novozym
435 in acetone. The structure characterization of the products is obtained by MS and NMR. The CHS-SE-GLU-modified paclitaxel-
loaded brain targeting liposomes (GLU-PTX-LP) were prepared by thin film dispersion method. Single factor evaluation was applied to
optimizing its preparation technology and formulation. Results CHS-SE-GLU was confirmed by MS and NMR as target products.
The optimal formulation and technology of GLU-PTX-LP were as follows: HSPC as membrane material, the ratio of HSPC to PTX was
0.1, the ratio of CHS to HSPC was 0.5, the dosage of DSPG-Na was 2.5%, hydration time was 0.5 h, and hydration temperature was
50 ℃. Three batches of samples were prepared by optimum preparation process and the average encapsulation efficiency was (93.62 ±
1.34)%, (93.75 ± 1.77)%, (92.04 ± 1.50)%; The average particle size was (89.56 ± 1.35), (92.05 ± 3.42), (104.91 ± 3.71) nm; And the
average Zeta potential was (−25.21 ± 0.27), (−26.43 ± 0.44), (−25.17 ± 0.65) mV, respectively. Conclusion Lipase-catalyzed method
for the preparation of brain targeting lipid material is simple and environment friendly with high yield. The entrapment efficiency,
particle size, and stability of brain targeting drug-loading liposomes modified by CHS-SE-GLU all meet the requirement, which shows

收稿日期：2016-02-22
基金项目：广东省自然科学基金项目（2016A030310365）；广东省医学科研基金项目（A2015629）；广东省省级科技计划项目（2014A020221061）；
梅州市科技研究与开发资金计划项目（201412）；嘉应学院自然科学项目（2015KJY10）
作者简介：聂 华（1979—），男，博士研究生，讲师，研究方向为靶向给药系统及抗肿瘤药物研究。
Tel: 14715048656 E-mail: niehua007@163.com
*通信作者 张声源（1983—），男，博士研究生，讲师，研究方向为中药及天然药物活性成分研究。
Tel: 13750543826 E-mail: mcdullzhang@yeah.net
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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good application prospect.
Key words: cholesterol derivatives; liposomes; glucose transporter; lipase-catalyzed; brain targeting; nonaqueous media; film
dispersion method; paclitaxel; biocatalysis

脑胶质瘤是颅内常见的发生于神经外胚层的恶
性肿瘤，来源于星形胶质细胞或少突胶质细胞，占
颅内肿瘤的 35.26%～60.9%[1-2]。但是由于血脑屏障
（blood brain barrier，BBB）的存在，普通的化疗方式
很难使药物进入肿瘤组织从而起到杀伤肿瘤细胞的
作用。目前跨 BBB 的脑靶向策略中，转运体介导
转运具有高度识别性，允许药物或载药系统跨细胞
膜转运，是递药入脑的主要方法之一[3-4]。BBB 上
存在着大量的转运通道蛋白[5]，其中葡萄糖转运蛋
白（glucose transporter-1，GLUT1）是 BBB中最高
效的转运体[6]，在 BBB上的密度大约是除红细胞膜
外其他组织的 10 倍[7]。利用 GLUT1转运体的介导
作用，将载体与葡萄糖（glucose，GLU）分子偶联，
可实现载体跨 BBB转运。
脂质体是磷脂、胆固醇等分散在水中形成的类
球状、包封一部分水相的的封闭囊泡。脂质体具有
很高的亲脂性，可通过如被动转运、与脑血管内皮
细胞膜发生膜融合转运至脑实质[8-9]，因此脂质体本
身是一种良好的治疗中枢神经系统疾病药物载体。
将 GLU与脂质材料偶联，用于制备 GLU修饰脂质
体，可进一步促进脂质体跨越 BBB，显著增加药物
入脑量[10-11]。胆固醇作为脂质体组成膜材之一，常
与靶向功能基团偶联[11]，且多采用化学法合成[12]。
李海姣等[13]将葡萄糖羟基（GLU-OH）与胆固醇通
过化学法共价偶联，然后与磷脂以一定比例混合制
备葡萄糖修饰脂质体，体内靶向性研究表明：经
GLU修饰的脂质体具有较好的 BBB透过性。
GLU上存在 5个化学环境相似的-OH，进一步
的构效关系研究显示：当载体与 GLU C6 位-OH
（C6-OH）偶联时，GLUT1 对其亲和能力最强[14]。
由于化学合成法很难区分 GLU 上众多化学性质相
近的-OH，为得到某单一反应位点的产物，需预先
对非反应位点的-OH 采取复杂的保护和去保护措
施[15]。脂肪酶是一种具有催化功能的蛋白质，与化
学合成法相比，具有高效、高区域选择性、低毒等
优点，被称之为绿色催化剂，尤其对糖分子的区域
选择性酯化具有独特的优势。前期研究发现，脂肪
酶Novozym 435在非水相中可专一催化GLU上C6-
OH 酯化反应。据此，本研究拟设计一种含葡萄糖
基的脑靶向脂质材料，具体思路如下：利用前期合
成的胆固醇-癸二酸单烯酯（CHS-SE）[16]为起始原
料，在 Novozym 435 催化下，选择性与 GLU 上
C6-OH 酯化偶联，即得到脑靶向脂质材料胆固醇-
癸二酸-葡萄糖酯［(5-cholesten-3β-yl) (D-glucopy-
ranose-6) sebacate，CHS-SE-GLU］（图 1）。将 CHS-
SE-GLU作为靶向头与磷脂、胆固醇、紫杉醇（PTX）
等材料制备出脑靶向载紫杉醇脂质体（GLU-PTX-
LP），并对 GLU-PTX-LP制备工艺、处方进行优化。
1 仪器与材料
Thermo TSQ Quantum ACESS三重四极杆液质
联用仪，赛默飞世尔科技有限公司；Bruker 500M
核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司；Alliance 2695
高效液相色谱仪、2996 PDA 二极管矩阵检测器，
美国沃特世公司；B15 型高压均质机，加拿大
AVESTIN公司；ZetasizerNano ZS90粒度测定仪，
英国马尔文仪器有限公司；Scientz-IID 超声波细胞
OH
CHS-SECHS
SE
RCL
O
OH
HO
HO OH
OH
D-glucose
Novozym435 lipase CHS-SE-GLU
17
3
11
7
12
1
6
16
2
15
23
9
8
4
5
18
20
14
25
13
21
10
1922a
22b
26
24
O 27
28
O
29
30
31
32
33
34
35
36
O
OH
1’2‘
OH
3’
OH4‘
OH
5’
O
6‘
O
O
O
O
O
CHS-SE
O 36
35
O
34
33
32
31
30
29
28
27
O
O
37
3837
38 17
3
11
7
12
1
616
2
15
23
9
8
4
5
18
20
14
25
13
21
10
1922a
22b
26
24
O 27
28
O
29
30
31
32
33
34
35
36
O
O
37
38

图 1 酶催化合成脑靶向脂质材料 CHS-SE-GLU
Fig. 1 Lipase-catalyzed synthesis of CHS-SE-GLU
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；BS110s
型电子分析天平，德国 Sartorius公司；RE-5299型
旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TGL-16MC冷
冻离心机，长沙湘锐离心机有限公司。
胆固醇（cholesterol，CHS），质量分数＞98.5%，
生产批号 A90719，日本精化株式会社；氢化大豆磷
脂（hydrogenated soya phosphatide，HSPC，1-棕榈
酰基-2-硬脂酰基卵磷脂质量分数＞98%，生产批号
B40932）、蛋黄磷脂（egg yolk lecithin，EPC，磷脂
酰胆碱质量分数＞98%，生产批号 AL14015），日本
丘比株式会社；二硬脂酰磷脂酰甘油钠（distearoyl
phosphatidylglycerole sodium salt，DSPG-Na），注射
级，上海艾维特有限公司；紫杉醇（paclitaxel，PTX），
质量分数＞99%，大连美仑生物技术有限公司；鱼
精蛋白，来源于鲑鱼，Sigma-Aldrich Corporation；
Novozym 435固定化脂肪酶，诺维信生物技术有限
公司；Candida rugosa Lipase（RCL），Sigma-Aldrich
Corporation；D-葡萄糖（D-glucose，GLU）、癸二
酸、乙酸乙烯酯，乙酸汞、乙酸铜、乙酸钠、浓硫
酸，阿拉丁试剂有限公司；微孔滤膜，天津津腾实
验设备有限公司；色谱甲醇，赛默飞世尔科技（中
国）有限公司；柱色谱硅胶，青岛海洋化工有限公
司；石油醚、醋酸乙酯、异辛烷、丙酮、氯仿、乙
醇，广州化学试剂厂；水为自制超纯水。
2 方法与结果
2.1 脑靶向脂质材料 CHS-SE-GLU合成
2.1.1 癸二酸二乙烯酯（divinyl sebacicacid，SE）
的制备及结构表征 SE 的制备参照王利娟等[17]开
发的方法，并稍作修改。称取 72.8 g癸二酸、150 mL
乙酸乙烯酯、2.1 g乙酸汞及微量乙酸铜，加入到 250
mL 三口颈烧瓶中。将盛有上述物质的三口颈烧瓶
在 50 ℃的恒温水浴中加热并搅拌，10 min后滴加
0.25 mL浓硫酸，反应 8 h。反应完毕后，加入约 2 g
乙酸钠充分震荡以中和硫酸。水泵减压蒸馏除去过
量醋酸乙烯酯后，将剩余蓝色液体经硅胶柱色谱，
用石油醚-醋酸乙酯（9∶1）等度洗脱，分离得到纯
品（质量分数 95%以上）。纯品经 MS、NMR 波谱
技术进行结构鉴定为目标产物。波谱数据如下：
ESI-MS m/z 277.22 [M＋Na]+；1H-NMR (500 MHz,
CDCl3) δ: 7.28 (H-37, 37′, m, 2H), 4.87 (H-38, dd, J =
14.0, 1.2 Hz, 2H), 4.55 (H-38′, dd, J = 6.3, 1.2 Hz,
2H), 2.37 (H-35, 28, t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.65 (H-34,
29, m, 4H), 1.33 (H-30～33, m, 8H)；13C-NMR (125
MHz, CDCl3) δ: 171.2 (C-27, 36), 141.6 (C-37, 37′),
97.8 (C-38, 38′), 34.3 (C-28, 35), 29.4 (C-30, 33), 29.3
(C-31, 32), 24.9 (C-29, 34)。
2.1.2 酶促合成胆固醇 -癸二酸单烯酯［ (5-
cholesten-3β-yl) vinyl sebacicacid，CHS-SE］及结构
表征[16] 取具塞锥形瓶，称取 1.3 g SE、1 g CHS，
加入脱水异辛烷适量溶解，置于恒温震荡器于
45 ℃振摇 30 min后，加入 RCL 200 mg，反应 24 h。
反应结束后，滤过除去 RCL，续滤液真空旋干得黏
稠液体，然后用适量甲醇超声溶解，0 ℃下静置 24
h析晶，低温下真空抽滤，得白色粉未，收率约 95%。
产物结构经MS、NMR鉴定为目标产物，具体数据
如下：ESI-MS m/z 619.51 [M＋Na]+；1H-NMR (500
MHz, CDCl3) δ: 7.28 (H-37, m, 1H), 5.37 (H-2, d, J =
4.5 Hz, 1H), 4.87 (H-38a, dd, J = 14.0, 1.5 Hz, 1H),
4.61 (H-3, m, 1H), 4.56 (H-38b, dd, J = 6.3, 1.5 Hz,
1H), 2.38 (H-7, t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.31 (H-28, d, J =
7.3 Hz, 2H), 2.26 (H-35, t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.99
(H-15, m, 2H), 1.78～1.04 (m, 36H), 1.02 (H-24, s,
3H), 0.91 (H-25, d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (H-22a, 22b,
dd, J = 2.3, 6.6 Hz, 6H), 0.67 (H-26, s, 3H)；13C-NMR
(125 MHz, CDCl3) δ: 173.4 (C-27), 171.0 (C-36),
141.4 (C-1), 139.9 (C-37), 122.75 (C-2), 97.6 (C-38),
73.9 (C-3), 56.8 (C-4), 56.3 (C-5), 50.2 (C-6), 42.5
(C-8), 39.9 (C-9), 39.7 (C-10), 38.3 (C-7), 37.2
(C-11), 36.8 (C-12), 36.3 (C-13), 35.9 (C-14), 34.8
(C-28), 34.1 (C-35), 32.0 (C-15), 32.0 (C-16), 29.2
(C-31), 29.2 (C-32, C-30), 29.1 (C-33), 28.4 (C-18),
28.2 (C-19), 28.0 (C-17), 25.2 (C-29), 24.7 (C-34),
24.4 (C-20), 24.0 (C-21), 23.0 (C-22a), 22.7 (C-22b),
21.2 (C-23), 19.5 (C-24), 18.9 (C-25), 12.0 (C-26)。
2.1.3 酶促合成 CHS-SE-GLU 及结构表征 取具
塞锥形瓶，称取 1 g GLU、6.6 g CHS-SE，加入脱
水丙酮适量溶解，置于恒温震荡器于 45 ℃振摇 30
min后，加入 Novozym 435适量，反应 12 h。反应
结束后，滤过除去 Novozym 435，续滤液真空旋干
得产物粗品。粗品经硅胶柱色谱纯化后得白色粉未，
收率约 92%。产物结构经MS、NMR鉴定为目标产
物，具体数据如下：ESI-MS m/z 755.59 [M＋Na]+；
1H-NMR (500 MHz, C5D5N) δ: 5.90 (H-1′, d, J = 3.5
Hz, 1H), 5.42 (H-2, m, 1H), 5.09 (H-6′a, dd, J = 1.6,
11.2 Hz, 1H), 4.91 (H-5′, m, 1H), 4.87 (H-3, dd, J =
2.8, 5.6 Hz, 1H), 4.84 (H-6′b, m, 1H), 4.76 (H-2′, t,
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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J = 9.1 Hz, 1H), 4.23 (H-3′, dd, J = 3.6, 9.5 Hz, 1H),
4.14 (H-4′, dd, J = 5.9, 12.4 Hz, 1H), 2.54 (H-7, m,
2H), 2.40 (H-28, t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.33 (H-35, m,
2H), 2.05～1.06 (m, 38H), 1.03 (H-24, s, 3H), 0.99
(H-25, d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.91 (H-22a, 22b, dd, J =
1.2, 6.6 Hz, 6H), 0.68 (H-26, s, 3H)；13C-NMR (125
MHz, C5D5N) δ: 174.1 (C-36), 173.4 (C-27), 140.4
(C-1), 123.2 (C-2), 94.6 (C-1′), 75.7 (C-2′), 74.8
(C-3′), 74.2 (C-3), 72.7 (C-4′), 71.3 (C-5′), 65.6 (C-6′),
57.2 (C-4), 56.8 (C-5), 50.6 (C-6), 42.9 (C-8), 40.3
(C-9), 40.1 (C-10), 39.0 (C-7), 37.6 (C-11), 37.2
(C-12), 36.9 (C-13), 36.4 (C-14), 35.2 (C-28), 34.8
(C-35), 32.6 (C-15), 32.4 (C-16), 29.7 (C-31, 32), 29.7
(C-30), 29.7 (C-33), 28.9 (C-18), 28.6 (C-19), 28.6
(C-17), 25.8 (C-29), 25.6 (C-34), 24.9 (C-20), 24.6
(C-21), 23.4 (C-22a), 23.1 (C-22b), 21.7 (C-23), 19.8
(C-24), 19.4 (C-25), 12.4 (C-26)。
2.2 薄膜分散法制备 GLU-PTX-LP[18]
按处方量称取 HSPC、CHS、CHS-SE-GLU、
DSPG-Na 等膜材及 PTX 溶于适量无水氯仿中，真
空旋转蒸发除去有机溶剂，制得均匀脂膜，置真空
干燥器内干燥过夜。加入一定体积的水溶液，于一
定温度下水化，水化一定时间后，探头超声 5 min
（超声时间 2 s，间隔时间 2 s，功率为 300 W），高
压均质（60、180 MPa，各 3次），即得 GLU-PTX-LP。
按上述工艺，处方中不加入 PTX，其余同上，
制备得空白脂质体。
2.3 GLU-PTX-LP包封率测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱为 XBridge Peptide BEH
C18柱（填料孔径 13 nm，250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相为甲醇-水（70∶30）；进样量 10 μL，检测波
长 228 nm；PTX保留时间 8.56 min；体积流量 0.8
mL/min；柱温 35 ℃；理论塔板数大于 3 000。
2.3.2 PTX 对照品溶液的制备 精密称定 PTX 对
照品 1 mg，置于 10 mL量瓶中，用乙醇定容，PTX
对照品溶液质量浓度为 100.0 mg/L。
2.3.3 供试品溶液的制备 取 GLU-PTX-LP 1 mL
置于 10 mL量瓶中，用乙醇溶解定容至刻度即得。
2.3.4 空白对照溶液的制备 取空白脂质体 1 mL
置于 10 mL量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度即得。
2.3.5 方法专属性 取对照品溶液、供试品溶液
及空白对照溶液按上述条件进液相分析，结果在
“2.3.1”项色谱条件下，PTX和辅料分离度良好，
峰形稳定，辅料及溶剂对 PTX的测定无干扰，见
图 2。



图 2 PTX对照品 (A)、GLU-PTX-LP样品 (B) 和空白对
照 (C) 溶液的 HPLC图
Fig. 2 HPLC of PTX reference substance (A), GLU-PTX-
LP sample (B), and blank (C) solution
2.3.6 线性关系考察 精密称取 PTX适量，用甲醇
溶解配制成 1 mg/mL的对照品储备液。精密移取一
定量的储备液，配制成 0.4、1、5、10、20、30、40、
50、75、100 mg/L系列溶液，进样量为 10 μL，按
“2.3.1”项色谱条件进行测定，记录峰面积。以质量
浓度（C）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，
得回归方程为 A＝23 868 C＋1 257.4，r2＝0.999 9
（n＝3），结果表明，PTX在 0.4～100.0 mg/L，峰面
积与质量浓度呈良好的线性关系。
2.3.7 精密度试验 取 PTX对照品溶液，连续进样
6次，按“2.3.1”项色谱条件测定 PTX峰面积，RSD
为 1.05%，表明此方法精密度良好。
2.3.8 稳定性试验 取供试品溶液，分别于 0、2、
4、6、8、12、24 h分别进样，按“2.3.1”项色谱条
件测定 PTX峰面积，RSD为 2.29%，表明 PTX溶
液在 24 h内保持稳定。
2.3.9 重复性试验 精密量取同一份样品 6份，每份
1 mL，按“2.3.3”项下方法制备 6份 GLU-PTX-LP
供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件测定 PTX峰面
积，按“2.3.6”项下回归方程换算成样品中 PTX的
量：44.95、45.28、44.70、44.72、44.62、44.30 mg/L，
其 RSD为 0.67%，表明此方法重复性良好。
2.3.10 加样回收率试验 分别精密移取 PTX 对照
品溶液（100 mg/L）0.25、0.50、0.75 mL加入到 0.5
mL空白脂质体溶液中，用乙醇破乳定容至 10 mL，
得到质量浓度为 2.5、5.0、7.5 μg/mL样品溶液，分
别进样 10 μL，测定 PTX峰面积，代入回归方程得
到实际测定质量浓度，计算回收率及 RSD。结果 3
个质量浓度样品的平均回收率分别为 99.20%、
98.60%、98.67%，RSD 为 0.29%、0.28%、0.43%
（n＝5），结果表明在此条件下回收率介于 98.0%～
PTX
PTX
A
B
C
0 2 4 6 8
t/min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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102.0%，RSD＜2%，回收率符合要求。
2.3.11 包封率的测定[19] 采用鱼精蛋白沉淀法。
取 GLU-PTX-LP溶液 0.1 mL于锥形离心管中，用
超纯水稀释至 1.1 mL，混匀，1 000 r/min离心 10
min。吸取上清液 1 mL，加入鱼精蛋白 1 mg，混匀，
10 000 r/min离心 15 min移去上清液，脂质体沉淀
用超纯水清洗 2次，最后所得脂质体沉淀用乙醇溶
解定容至 1 mL，制得样品 S2，进液相分析，记为
C2；另取 GLU-PTX-LP溶液 0.1 mL，乙醇破乳定容
至 1 mL，制得样品 S1，进液相分析，记为 C1，包
封率按公式（包封率＝C1/C2）计算。
2.4 GLU-PTX-LP处方及工艺条件优化
2.4.1 统计分析 采用 SPSS 22.0统计软件对数据
进行单因素方差分析，组间均数比较采用 F检验，
P＜0.05时差异具有统计学意义。
2.4.2 磷脂种类对 GLU-PTX-LP 的影响 磷脂是
构成脂质体膜材的主要成分。采用不同种类磷脂制
备脂质体，其包封率、粒度、Zeta电位及稳定性也
有所不同。固定其他条件，分别以 EPC、HSPC 为
膜材制备 GLU-PTX-LP，考察其对包封率的影响。
结果输入 SPSS 22.0软件分析，发现磷脂种类对包
封率、Zeta电位无显著性影响，对粒径的影响显著
（P＜0.05）。结果如表 1所示，HSPC制得的脂质体
包封率较 EPC高，但粒度大于 EPC，两者 Zeta 电
位相似。HSPC 为氢化磷脂，氧化稳定性要远优于
EPC。综合考虑，选择 HSPC作为膜材。

表 1 磷脂种类对 GLU-PTX-LP的影响 ( x±s, n = 3)
Table 1 Effect of different phospholipids on GLU-PTX-LP
( x±s, n = 3)
磷脂种类 包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
EPC 84.46±1.75 89.25±1.50 −25.95±0.49 0.245±0.042
HSPC 88.36±1.08 163.20±2.36 −23.65±0.78 0.194±0.007

2.4.3 药脂比对 GLU-PTX-LP 的影响 脂质体双
分子层对药物的容量有饱和性，过高的药脂比导致
脂质体外游离药物增多，降低包封率，而且改变药
物在体内的分布行为，影响药物的疗效；而过低的
药脂比导致药物浓度过低，同时降低磷脂的利用率。
固定其他条件，考察不同 PTX与 HSPC比例（质量
比）对 GLU-PTX-LP的影响。结果输入 SPSS 22.0
软件分析，显示质量比对 GLU-PTX-LP包封率、粒
径、Zeta 电位均有显著影响（P＜0.05）。结果如表
2所示，随着 PTX与 HSPC比例逐渐增大，包封率
呈先增后降的趋势，说明脂质体容量饱和前，增加
的 PTX都包入脂质体中，包封率增大；当达到饱和
后，过量的 PTX会游离于脂质体外，包封率反而降
低。当 PTX与 HSPC比例为 0.1∶1，包封率最高。
2.4.4 磷脂与胆固醇比例对 GLU-PTX-LP 的影响
CHS作为稳定剂，加入到脂质体中能增加脂质体双
分子膜的流动性，减少膜渗透性，起到稳定脂质体
的作用[20]。但过量的 CHS 会占用脂质体双分子层
空间，导致对药物容量下降。固定其他条件，考察
不同 CHS与 HSPC比例（质量比）对 GLU-PTX-LP
的影响。结果输入 SPSS 22.0软件分析，显示磷脂
与胆固醇比例对 GLU-PTX-LP包封率、粒径、Zeta
电位均有显著影响（P＜0.05）。结果见表 3，随着
CHS与 HSPC比值增大时，包封率先增大后减小，
当其比值为 0.5∶1时，包封率最高，因此确定 HSPC
与 CHS比值为 0.5∶1。
2.4.5 DSPG-Na 用量对 GLU-PTX-LP 的影响 当
脂质体膜表面带电荷时，Zeta电位越大表示所带电
荷越多，可使由双电层引起的静电斥力增大，凝聚
时要克服的能量越大，越不易产生凝聚，从而增加
脂质体的稳定性，其包封率也越高[21]。固定其他条
件，考察 DSPG-Na 投入量占磷脂不同质量百分比
对 GLU-PTX-LP的影响。结果输入 SPSS 22.0软件

表 2 药脂比对 GLU-PTX-LP的影响 ( x±s, n = 3)
Table 2 Effect of different drug-lipid ratios on GLU-PTX-
LP ( x±s, n = 3)
PTX-HSPC 包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
0.050∶1 78.35±1.41 127.25±0.49 -25.50±0.14 0.262±0.016
0.075∶1 86.37±2.16 168.20±0.73 -24.25±0.21 0.228±0.015
0.100∶1 89.67±1.00 164.77±0.73 -22.85±0.07 0.289±0.022
0.150∶1 83.77±0.04 175.22±1.40 -27.60±0.28 0.254±0.021
0.200∶1 66.48±0.67 282.34±1.57 -26.85±0.07 0.197±0.013

表 3 磷脂与胆固醇比例对 GLU-PTX-LP 的影响 ( x±s,
n = 3)
Table 3 Effect of different lecithin-cholesterol ratios on
GLU-PTX-LP ( x±s, n = 3)
CHS-HSPC 包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
0.750∶1 83.46±0.70 180.71±3.59 −25.50±0.14 0.186±0.009
0.500∶1 88.14±1.67 164.86±0.67 −24.75±0.49 0.191±0.004
0.250∶1 86.98±1.28 162.53±0.11 −24.15±0.07 0.363±0.069
0.175∶1 82.98±0.50 94.83±3.01 −20.45±0.07 0.174±0.026
0.125∶1 80.27±1.27 94.52±0.05 −19.60±0.28 0.183±0.006
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分析，显示 DSPG- Na用量对 GLU-PTX-LP包封率
无显著性影响，对粒径、Zeta电位均有显著性影响
（P＜0.05）。结果见表 4，DSPG-Na的加入可显著增
加脂质体表面电位值，当 DSPG-Na 用量占磷脂质
量为 2.5%和 5%时，包封率和粒径较好，Zeta电位
绝对值都超过 30 mV，考虑到 DSPG-Na 昂贵的价
格，最终确定用量为 2.5%。

表 4 DSPG-Na用量对GLU-PTX-LP的影响 ( x±s, n = 3)
Table 4 Effect of different DSPG-Na contents on GLU-
PTX-LP ( x±s, n = 3)
DSPG-Na
用量/%
包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
10.0 89.63±0.26 164.75±1.34 −42.65±0.07 0.260±0.019
5.0 90.02±2.09 104.70±1.13 −31.25±0.35 0.229±0.015
2.5 87.43±2.04 88.76±1.97 −32.15±0.21 0.192±0.010
2.0 86.98±1.28 161.90±0.99 −24.50±0.42 0.189±0.005

2.4.6 水化时间对 GLU-PTX-LP 的影响 一定的
水化时间有助于磷脂与胆固醇水中闭合成脂质体囊
泡，但过长的水化时间会引起药物和脂质体的氧化，
导致包封率下降。固定其他条件，考察不同水化时
间对 GLU-PTX-LP的影响。结果输入 SPSS 22.0软
件分析，显示水化时间对 GLU-PTX-LP包封率、粒
径、Zeta 电位均有显著影响（P＜0.05）。结果见表
5，1 h水化时间包封率最高，0.5 h水化时间包封率
虽略低于 1 h，但粒度与 Zeta电位优于 1 h，综合考
虑，最终确定水化时间为 0.5 h。
2.4.7 水化温度对 GLU-PTX-LP 的影响 文献报
道氢化磷脂的相转变温度大都在 40 ℃左右，制备
脂质体时往往需要 50 ℃以上的水化温度[22]，有助
于增加脂膜的流动性，让药物进入脂质双分子层，
但过高的温度亦会引起脂膜的不稳定，而且也会使
磷脂氧化加速，导致包封率下降。固定其他条件，
考察不同水化温度对 GLU-PTX-LP的影响。结果输
入 SPSS 22.0软件分析，显示水化温度对GLU-PTX-

表 5 水化时间对 GLU-PTX-LP的影响 ( x±s, n = 3)
Table 5 Effect of different hydration times on GLU-PTX-
LP ( x±s, n = 3)
水化时间/h 包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
0.5 82.18±1.16 92.79±0.62 −28.45±0.49 0.520±0.105
1.0 86.98±1.28 161.90±0.99 −24.15±0.07 0.414±0.002
2.0 83.71±0.12 220.75±9.26 −16.70±0.28 0.446±0.009
LP 包封率、粒径、Zeta 电位均有显著影响（P＜
0.05）。结果见表 6，水化温度为 60 ℃时，制得脂
质体包封率最高，但粒径相对于 40、50 ℃水化温
度时增大约 1倍；40 ℃时包封率虽略高于 50 ℃，
但 Zeta 电位绝对值相对于 50 ℃却降低了约 10
mV，说明 50 ℃制备的脂质体更稳定，综合考虑，
确定水化温度为 50 ℃。

表 6 水化温度对 GLU-PTX-LP的影响 ( x±s, n = 3)
Table 6 Effect of different hydration temperatures on GLU-
PTX-LP ( x±s, n = 3)
水化温度/℃ 包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
40 84.74±1.18 81.19±0.38 −15.90±0.14 0.144±0.018
50 82.25±0.93 85.57±0.45 −24.05±0.07 0.173±0.017
60 86.98±1.28 161.90±0.99 −24.40±0.28 0.382±0.036

2.5 单因素优化验证试验
通过单因素考察，筛选出各因素最优值，即：
采用HSPC作为膜材，HSPC与 PTX比例为 0.1∶1，
CHS 与 HSPC 比例为 0.5∶1，DSPG-Na 用量为
2.5%，水化时间 0.5 h，水化温度 50 ℃。采用上述
工艺处方制备 3批样品，测定包封率、粒径和 Zeta
电位，结果见表 7。3次验证实验的结果基本一致，
说明所确定的优化工艺合理可行，稳定可靠，重现
性良好。

表 7 验证实验结果 ( x±s, n = 3)
Table 7 Results of verification test ( x±s, n = 3)
批号 包封率/% 粒径/nm Zeta电位/mV PDI
06030701 93.62±1.34 89.56±1.35 −25.21±0.27 0.220±0.039
06030801 93.75±1.77 92.05±3.42 −26.43±0.44 0.218±0.005
06022801 92.04±1.50 104.91±3.71 −25.17±0.65 0.226±0.012

3 讨论
本实验设计了一种含葡萄糖基胆固醇衍生物脂
质材料 CHS-SE-GLU。该分子由 3部分组成：胆固
醇基、葡萄糖基以及用于连接 2部分的长链碳桥。
其亲油性胆固醇基可牢固镶嵌于磷脂双分子层，亲
水性葡萄糖基则借助 SE 长链碳桥伸展于脂质体外
层，用于被 GLUT1识别并捕获，介导脂质体跨 BBB
转运至脑内病变部位。GLUT1对葡萄糖类似物的识
别效率主要取决以下几个因素：GLU上-OH取代位
置、GLU 在脂质体表面的密度、GLU 与脂质体之
间的空间距离等[10-11]，其中载体与 GLU 上-OH 偶
联位置起关键作用。Mueckler等[23]研究发现，GLU
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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上 C6-OH 连接疏水基团时，与 GLUT1有较强的亲
和力。为使 CHS-SE与 GLU连接点只位于 C6-OH，
本实验考察了多种脂肪酶在不同溶媒中酯化的结
果，实验结果显示 Novozym 435 催化效果最好。
Novozym 435是一种来源于Candida Antarctica B的
固定化脂肪酶，文献报道可高选择性专一催化 GLU
C6-OH 的酯化 [24]。为验证 CHS-SE 与 GLU 在
Novozym 435 催化下酯化的位点，本实验对比了
13C-NMR谱图上GLU与 CHS-SE-GLU糖部分碳信
号的位移变化，发现 CHS-SE-GLU 糖基部分 C-6
信号向低场位移约 δ 2，而 C-5′信号向高场位移约 δ
3，其他碳信号位移基本没有变化。通常，糖部分
OH被乙酰化会使其烷甲基碳（α-C）信号向低场位
移（δ 2～4），它的邻位碳（β-C）信号向高场位移
（δ −2～−6），这种改变称为苷化位移。利用这个规
律，判定酯化反应只发生在 GLU C-6位上，与文献
报道的结果一致[24]。
脂质体的靶向疗效与粒径、包封率密切相关。
文献报道[25]，当脂质体粒径在 100 nm时，其被单
核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system，
MPS）截留的量最少，血循环时间最长，在肿瘤组
织中被截留的量最多。另有研究显示[1]，人体其他
部位实体瘤的新生血管内皮间隙在 0.1～2.0 μm，而
脑胶质瘤的间隙孔径仅为 100 nm 左右，因此有必
要控制 GLU-PTX-LP 的粒径在 100 nm，以提高其
在脑肿瘤部分的蓄积。包封率是评价脂质体制剂的
制备工艺和质量评价的重要指标，也是较普通制剂
发挥高效、低毒特点并提高药物治疗指数、降低药
物不良反应并减小药物剂量的关键[26]。本实验通过
考察制备方法、膜材组成对 GLU-PTX-LP包封率及
粒径的影响，优选出最佳制备工艺及处方，在此条
件下制备了 3批 GLU-PTX-LP，结果显示包封率均
超过 90%，符合《中国药典》规定的脂质体质量要
求；粒径 100 nm左右，可减少被MPS摄取并能透
过脑胶质瘤的间隙发挥靶向治疗作用；Zeta电位为
（−25.80±0.85）mV（电位绝对值＞15 mV），表明
该纳米制剂具有较好的稳定性[27]。
Qin 等[10]报道用化学法合成一种葡萄糖-胆固
醇衍生物，制备靶向于 BBB 上葡萄糖转运体的新
型脂质体。结果显示，体外 BBB 模型上评价葡萄
糖修饰的脂质体跨过 BBB 的能力，随着葡萄糖-胆
固醇衍生物加入量的增多，脂质体的跨 BBB 能力
增强。但文献报道制备葡萄糖-胆固醇衍生物方法较
繁琐，所用试剂亦有一定毒性，不利于产业化应用。
相比之下，本实验所设计的脑靶向脂质材料 CHS-
SE-GLU，结构与之类似，但因采用生物酶做催化
剂，使合成步骤较之大大简化，且反应条件温和，
副产物少，纯化方法简便，所用试剂毒性小，目标
产物总收率能达 80%以上，应用前景良好。在后继
工作中，将通过体外分子生物学和体内组织分布研
究进一步评价 GLU-PTX-LP脑靶向性。
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