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Research on compatibility mechanism of Mongolian medicine Sendeng-4 based on metabonomic methods

基于组学方法的蒙药复方森登-4配伍机制研究



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月 ·736·
• 药剂与工艺 •
基于组学方法的蒙药复方森登-4 配伍机制研究
王曦烨 1, 2, 3,李 丹 1, 2,唐兴盟 1, 2,许 良 1, 2*
1. 内蒙古民族大学化学化工学院,内蒙古 通辽 028042
2. 天然产物化学及功能分子合成自治区重点实验室,内蒙古 通辽 028042
3. 内蒙古蒙医药工程技术研究院,内蒙古 通辽 028042
摘 要:目的 探究蒙药复方森登-4 的配伍机制。方法 蒙药文冠木与栀子、川楝子、诃子以 5∶3∶1∶1 的比例配伍后得
到蒙药复方森登-4;配伍前后的样品采用 Waters Acquity BEH-C18 柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)为色谱柱,0.1%甲酸水溶
液-甲醇为流动相进行梯度洗脱,柱温 40 ℃,体积流量 0.4 mL/min,进样量 10 μL;并将超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)
技术与主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)相结合,对蒙药复方森登-4 配伍前后组方中君药文冠木
主要化学成分变化情况进行了分析。结果 在 PCA 与 OPLS-DA 模型中,文冠木与复方森登-4 均可明显得到区分;配伍后 8
个化合物在两组间存在显著差异(P<0.05),其中儿茶素、没食子儿茶素、双氢杨梅素、槲皮素的溶出量在配伍后下降,而
xanthocerasic acid、3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid、3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid、芦丁的溶出量升高。结论 蒙
药复方森登-4 的抗炎及抗风湿活性可能与其中的君药文冠木配伍之后某些指标成分的溶出量变化有一定关系。
关键词:蒙药;复方森登-4;文冠木;栀子;川楝子;诃子;质谱;配伍;化学标记物;儿茶素;没食子儿茶素;双氢杨梅
素;槲皮素;xanthocerasic acid;3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid;3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid;芦丁
中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2016)05 - 0736 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.05.008
Research on compatibility mechanism of Mongolian medicine Sendeng-4 based
on metabonomic methods
WANG Xi-ye1, 2, 3, LI Dan1, 2, TANG Xing-meng1, 2, XU Liang1, 2
1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028042, China
2. Key Laboratory of Natural Product Chemistry and Functional Molecular Synthetic Autonomous Region, Tongliao 028042, China
3. Mongolian Medicine Engineering Technology Research Institute of Inner Mongolia, Tongliao 028042, China
Abstract: Objective To explore the mechanism of the compatibility of Mongolian medicine Sendeng-4. Methods Sendeng-4 was
composed of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and its co-decoction with Gardeniae Fructus, Toosendan
Fructus, and Chebulae Fructus with a mass ratio of 5∶3∶1∶1. BEH C18 column (50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was used as the
chromatographic column, water (0.1% formic acid)-methanol were used as mobile phase for the gradient elution, and the ultra
performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS), principle component analysis (PCA), and
orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) were used to analyze the chemical constituent changes of
Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and its co-decoction. Results The significant differences between the
group of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4 were observed in PCA and OPLS-DA model. There
were significant differences among eight chemical compounds after compatibility (P < 0.05). The relative contents of catechin, (−)-
gallocatechin, dihydromyricetin, quercetin decreased, xanthocerasic acid, 3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid, 3-oxotirucalla-
7,24-dien-21-oic acid, and rutin were increased. Conclusion Maybe the anti-inflammatory and anti-rheumatic activity of Sendeng-4

收稿日期:2015-11-24
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30760299,81260682,81560702);内蒙古自治区蒙医药科技重大专项子课题(GCY201508034)
作者简介:王曦烨,讲师,博士,研究方向为药物代谢组学。Tel: 15114750911 E-mail: wangxiye1983@163.com
*通信作者 许 良,教授,博士,研究方向为天然产物化学。Tel: 13947521310 E-mail: nmgxl66@163.com

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月 ·737·
have the relationship with the content changes of some index component in Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium
after compatibility.
Key words: Mongolian medicine; Sendeng-4; Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium; Gardeniae Fructus; Toosendan
Fructus; Chebulae Fructus; mass spectrometry; compatibility; chemical markers; catechin; (−)-gallocatechin; dihydromyricetin;
quercetin; xanthocerasic acid; 3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid; 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid; rutin

蒙药文冠木 Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu
Ramulus et Folium 为无患子科(Sapindaceae)文冠果
属 Xanthoceras Bunge 植物文冠果 Xanthoceras
sorbifolium Bunge 的茎杆或枝条的干燥木部。蒙医
理论认为该药具有燥“协日乌素”、清热、消肿、止
痛的作用,用于游痛症、痛风症、热性“协日乌素”
病、青腿病、皮肤瘙痒、脱发、黄水疮、风湿性心
脏病、关节疼痛、淋巴结肿大、浊热的治疗[1-2]。蒙
药复方森登-4 是由文冠木、栀子、川楝子、诃子共
研细末而后制成汤剂,方中文冠木能够燥黄水、消
肿止痛,为君药;川楝子清热、燥黄水,为臣药;
栀子清血热,为佐药;诃子解毒、调理体素,为使
药。本方具有清热、燥黄水、消肿功能,主治痛风、
痹病、关节黄水病和水肿[3]。
目前,组学方法已被广泛应用于药物的指纹图
谱鉴定[4]、药物炮制[5-7]、药物代谢[8-10]等方面的研
究,而多元线性回归分析法已被应用于复方森登-4
的药效物质基础研究[11-12],但文冠木配伍产生复方
森登-4 的机制研究未见报道。为进一步研究文冠木
的配伍机制,本实验采用超高效液相色谱-质谱联用
(UPLC-MS)技术结合化学计量学方法,利用主成
分分析(PCA)对文冠木与复方森登-4 的轮廓进行
区分、利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)
寻找文冠木与复方森登-4 间的化学标记物,用于揭
示文冠木配伍生成复方森登-4后抗炎及抗风湿活性
增强的原因。
1 仪器和试药
Waters 超高效液相色谱仪,Waters Xevo G-2S
QTOF 质谱仪,Waters,UK;F-54BW 型 pH 计,
HORIBA,Japan。甲醇、甲酸为色谱纯试剂,美国
Fisher 公司;提取用乙醇为分析纯,北京化工厂;
水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。
文冠木为无患子科植物文冠果 Xanthoceras
sorbifolia Bunge 的干燥茎干,购于安国市健仁药材
有限公司;栀子为茜草科栀子属植物栀子 Gardenia
jasminoides Ellis 的果实,购于亳州市药州商行;川
楝子为楝科楝属植物川楝 Melia toosendan Sieb. et
Zucc. 的干燥成熟果实,购于亳州市中正中药材饮
片有限公司;诃子为使君子科植物诃子 Terminalia
chebula Retz. 的干燥成熟果实,购于安国市京源中
药饮片有限公司;所有中药饮片均由内蒙古民族大
学化学化工学院从事天然产物研究工作的包玉敏教
授进行鉴定。
对照品槲皮素(批号 100081-201509)、芦丁(批
号 100080-201409)、儿茶素(批号 110877-201203)、
没食子儿茶素(批号 111987-201501)、双氢杨梅素
(批号 110878-201102)购于成都曼斯特生物科技有
限公司,所有对照品质量分数均≥98%。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及质谱分析条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Waters Acquity BEH-
C18 柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温 40 ℃;流
动相为 0.1%甲酸水溶液-甲醇,二元线性梯度洗脱:
0~8 min,1%~80%甲醇;8~12 min,80%~100%
甲醇;12~14 min,100%甲醇;14~15 min,100%~
1%甲醇;15~17 min,1%甲醇;体积流量 0.4
mL/min;进样量 10 μL。
2.1.2 质谱条件 ESI 离子源,采用正离子模式,
扫描范围:m/z 100~1 000,毛细管电压 3 000 V,
锥孔电压 40 V,离子源温度 100 ℃,雾化温度
400 ℃,壳气体积流量 800 L/h。质谱以亮氨酸脑啡
肽做内标,甲酸钠校正质量轴。
2.1.3 数据处理方法 所有 UPLC-MS 数据均使用
Masslynx V4.1 软件进行峰提取、峰对齐及归一化处
理,用 EZinfo 2.0 软件进行 PCA、OPLS-DA 分析。
2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 文冠木单味药材供试品溶液的制备 取文冠
木药材粉末 1.5 g,精密称定,以 95%乙醇 15 mL
为溶剂,水浴回流提取 2 次,每次 2 h,减压抽滤,
合并 2 次提取液,旋转蒸发挥干溶剂,残渣用 2 mL
甲醇溶解,0.45 μm 微孔滤膜滤过,待测。
2.2.2 复方森登-4 供试品溶液的制备 分别称取
1.5 g 文冠木、0.9 g 川楝子、0.3 g 栀子、0.3 g 诃子,
将 4 种粉末混合,以 95%乙醇 30 mL 为溶剂,水浴
回流提取 2 次,每次 2 h,减压抽滤,合并 2 次提取
液,旋转蒸发挥干溶剂,残渣用 2 mL 甲醇溶解,

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月 ·738·
0.45 μm 微孔滤膜滤过,待测。
2.3 UPLC-MS 图谱分析
蒙药文冠木、复方森登-4(文冠木、川楝子、
栀子、诃子共煎液)的基峰色谱图见图 1。由图可
见,文冠木配伍后儿茶素的溶出量明显下降,没食
子儿茶素、双氢杨梅素所代表的色谱峰消失,而芦
丁的溶出量略有升高。文冠木配伍过程中,由于其



1-没食子儿茶素 2-双氢杨梅素 3-儿茶素 4-芦丁
1-(−)-gallocatechin 2-dihydromyricetin 3-catechin 4-rutin

图 1 文冠木与复方森登-4 的基峰离子色谱图
Fig. 1 Base peak ion chromatograms of Xanthoceratis
Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4
它单味药含有复杂的化学成分,如甘草中含有大量
的甘草酸、甘草次酸等物质[13],致使共煎液的 pH
值相对于文冠木单煎液发生了变化(文冠木单煎液
与复方森登-4 溶液的 pH 值分别为 6.2、5.4),文冠
木中的黄酮类成分在此 pH 值条件下不稳定,容易
与其他成分发生反应,因而导致其溶出量下降;有
研究表明[14],当 pH 值在 4~6 时,药材中芦丁的量
比较稳定,而当 pH<4 或 pH>6 时,芦丁的量急剧
减少,因此配伍后 pH 值为 5.4 的条件可能有利于芦
丁的溶出;另一方面,川楝子中同样含有一定量的
芦丁[15],因此,文冠木经配伍后芦丁的溶出量反而
升高。
2.4 PCA 与 OPLS-DA 结果分析
无监督的模式识别方法——PCA 分析可以反
映数据的原始状态,直观地显示不同样品间的整体
差异,故首先对文冠木与复方森登-4 样品进行 PCA
分析,结果见图 2。从图 2-A 可以看出,文冠木与
复方森登-4 样品可明显区分,这说明文冠木配伍后
某些化学成分的相对质量分数发生了明显变化,模
型质量评价指标分别为 RX2[1]=0.502 5,RX2[2]=
0.317 4,表明模型大致能够反映 84%的变量信息,




图 2 文冠木 (■) 与复方森登-4 (▲) 的 PCA (A) 和 OPLS-DA (B) 得分图
Fig. 2 PCA (A) and OPLS-DA (B) score plot of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium (■) and Sendeng-4 (▲)

模型质量良好。
为了找到引起文冠木配伍变化的化学标记物,
需要利用有监督的识别模式——OPLS-DA 分析。有
监督的模式识别方法可以扩大组间差异,但需要利
用外部模型验证方法排列实验来证明模型的有效
性。从图 2-B 可以看出,在 OPLS-DA 得分图中文
冠木与森登-4 依然可以被明显区分,而模型质量评
价指标分别为 RY2=0.835 8,Q2=0.815 0。
为进一步确定配伍后各成分变化情况,采用
OPLS-DA 对文冠木、复方森登-4 进行了分析,得
到了 S-Plot 图(图 3-A)以及 VIP 图(图 3-B)。在
图 3-A 中,“S”曲线中的每 1 个点代表 1 个变量,
变量对分类的重要程度由 VIP 值的大小来衡量,变
量离原点越远,VIP 值越大。根据图 3-B 中的 VIP
值对变量进行筛选,取 VIP>1.0 的物质作为化学标
记物。通过与对照品比对、高分辨质谱数据及文献
t[2
]
80


40


0


−40


−80
A
t[2
]O

B
1 2
3 4
3
4
2 4 6 8 10
t/min
文冠木
复方森登-4
80


40


0


−40


−80
−100 −50 0 50 100
t[1]
−100 −50 0 50 100
t[1]P

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月 ·739·
报道资料对化学标记物进行鉴定,共得到 8 种化学
标记物(P<0.05),分别为儿茶素(1)、没食子儿
茶素(2)、双氢杨梅素(3)、槲皮素(4)、xanthocerasic
acid(5)、3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid
(6)、3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid(7)、芦丁
(8)。文冠木与复方森登-4 的化学标记物推断结果
见表 1。
2.5 文冠木与复方森登-4 化学标记物相对质量分
数的比较
利用Masslynx V4.1软件对UPLC-MS数据进行




1- 儿茶素 2- 没食子儿茶素 3- 双氢杨梅素 4-xanthocerasic acid 5- 槲皮素 6-3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid
7-3-oxotirucalla-7,24- dien-21-oic acid 8-芦丁,下图同
1-catechin 2-(−)-gallocatechin 3-dihydromyricetin 4-xanthocerasic acid 5-quercetin 6-3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid
7-3- oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid 8-rutin, same as below

图 3 文冠木与复方森登-4 的 OPLS-DA S-Plot (A) 与 VIP 图 (B)
Fig. 3 OPLS-DA S-Plot (A) and VIP (B) of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4

表 1 文冠木与复方森登-4 中化学标记物的数据
Table 1 Data of chemical markers of Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium and Sendeng-4
序号 保留时间/min 测量值 (m/z) 理论值 (m/z) 偏差/×10−6 分子式 趋势* 化合物
1 2.72 291.086 8 291.086 3 1.8 C15H15O6 ↓ 儿茶素
2 2.03 307.081 1 307.081 2 0.3 C15H15O7 ↓ 没食子儿茶素
3 2.46 321.060 8 321.060 5 1.0 C15H13O8 ↓ 双氢杨梅素
4 9.23 471.348 7 471.349 6 2.0 C30H47O4 ↑ xanthocerasic acid
5 4.00 303.049 3 303.049 9 2.1 C15H11O7 ↓ 槲皮素
6 9.83 457.367 1 457.367 6 1.2 C30H49O3 ↑ 3β-hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid
7 10.54 455.351 6 455.352 0 0.9 C30H47O3 ↑ 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic acid
8 11.98 611.160 2 611.160 7 0.9 C27H31O16 ↑ 芦丁
*复方森登-4 相对于文冠木的量,↓下降,↑上升
*content of Sendeng-4 related to Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et Folium, ↓decrease, ↑increase

处理,得到了文冠木与复方森登-4 中所有化学标记
物的相对质量分数,从图 4 中可以看到,儿茶素、
没食子儿茶素、双氢杨梅素、槲皮素的相对质量分
数下降,而 xanthocerasic acid、3β-hydroxytirucalla-7,
24-dien-21-oic acid、3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic
acid、芦丁的相对质量分数升高。
3 讨论
本实验采用 UPLC-MS 技术与化学计量学相结
合的方法研究蒙药复方森登-4配伍前后其君药文冠
木的主要化学成分的变化情况。复方森登-4配伍后,
文 冠 木 中 3 种 成 分 xanthocerasic acid 、 3β-
hydroxytirucalla-7,24-dien-21-oic acid、3-oxotirucalla-
7,24-dien-21-oic acid 的量增加,已有的研究表明,
这3种成分具有显著抑制HIV病毒的活性[16],因此,
文冠木配伍组成森登-4之后其抗HIV病毒的活性可
能增强;文献报道[17-18]芦丁经大鼠 ip,对植入羊毛
8 6 7
3 2 1 5 4
P(
CO
IT
)[1
]P

1 2 3 4 5 6 7 8
化学标记物
B A
V
IP
[2
]
1.0


0.5


0


−0.5


−1.0
−0.010 0 0.010
CoeffCS[2]
2.5


2.0


1.5


1.0

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 5 期 2016 年 3 月 ·740·



图 4 文冠木与复方森登-4间化学标记物的相对质量分数变
化图
Fig. 4 Relative content changes of chemical marker
between Xanthoceratis Sorbifoliae Lignum seu Ramulus et
Folium and Sendeng-4

球的发炎过程有明显的抑制作用,芦丁的硫酸酯钠
对大鼠热浮肿同样有很强的抗炎作用,而本实验结
果显示,文冠木配伍后其抗炎镇痛指标成分芦丁的
量明显增加,因此,本实验结果在一定程度上阐释
了蒙药复方森登-4 配伍的科学原理,即蒙药复方配
伍后其中一些活性指标成分的量增加导致了药效的
增强。
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文冠木

复方森登-4
1 2 3 4 5 6 7 8
化学标记物
1 200


1 000


800


600


400


200


0






/%