全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

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• 化学成分 •
阿达青霉对熊果酸的微生物转化研究
王志平 1，刘岱琳 2*，延慧君 3，马卫俊 2
1. 郑州人民医院 药学部，河南 郑州 450003
2. 中国人民武装警察部队后勤学院 生药学与药剂学教研室，天津 300162
3. 中国人民武装警察部队后勤学院附属医院 药剂科，天津 300162
摘 要：目的 利用阿达青霉对熊果酸进行微生物转化研究。方法 将熊果酸投入阿达青霉液体培养基中，28 ℃、140 r/min
条件下共培养 5 d后超声处理，正丁醇萃取获得富集的转化产物提取物；利用多种柱色谱方法分离转化产物，通过核磁共振
波谱技术（1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、HMBC、NOESY），结合理化常数和化学反应等方法鉴定化合物的结构；
利用MTT法测定了转化产物和底物对 HepG2细胞的细胞毒活性。结果 获得了一个熊果酸的微生物转化产物，其结构鉴定
为 3β, 21α-二羟基熊果酸-28-O-β-D-葡萄糖苷，该转化产物具有一定的抑制 HepG2肿瘤细胞的细胞毒活性，其 IC50为 19.72
μmol/L。结论 转化产物 3β, 21α-二羟基熊果酸-28-O-β-D-葡萄糖苷为 1个新化合物，其对 HepG2肿瘤细胞的细胞毒活性强
于底物。
关键词：熊果酸；微生物转化；3β, 21α-二羟基熊果酸-28-O-β-D-葡萄糖苷；阿达青霉；细胞毒活性
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)08 - 1043 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08.001
Microbial transformation of ursolic acid by Penicillium adametzi
WANG Zhi-ping1, LIU Dai-lin2, YAN Hui-jun3, MA Wei-jun2
1. Department of Pharmacy, People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450003, China
2. Department of Biology and Pharmaceutics, Logistics University of PAPF, Tianjin 300162, China
3. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Logistics University of PAPF, Tianjin 300162, China
Abstract: Objective To study the microbial transformation of ursolic acid by Penicillium adametzi. Methods The biotransformed
extract was obtained by co-culture of substrate (ursolic acid) and the transferring fungi in a liquid medium at certain conditions, and
then the inocula were dealt in an ultrasonic bath and extracted with n-BuOH. The transformed extract was isolated by chromatography
on macroporous resin column, silica gel column, and preparative HPLC. The structures of the isolated compounds were identified by
spectral analyses, physical constants, and chemical evidences. Results A microbial transformed product was isolated and identified as
3β, 21α-dihydroxyl-ursolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside and it had the significant inhibitory effects against HepG2 cell with IC50
value of 19.72 μmol. Conclusion The transformed product, 3β, 21α-dihydroxyl-ursolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside, is a new
compound with the stronger cytotoxic activity than that of substrate.
Key words: ursolic acid; microbial transformation; 3β, 21α-dihydroxyl-ursolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside; Penicillium adametzi;
cytotoxic activity

熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌苏酸、乌索
酸，是天然植物中广泛分布的一种代表性的 α-香树
脂醇型五环三萜类化合物[1]。现代药理研究表明其具
有抗肿瘤、抗炎、抗菌、保肝、降血糖、抗 HIV[2-5]
等多种生物学效应而备受关注。但熊果酸的脂溶性
强，体内药动学研究显示熊果酸生物利用度低[6]，因
此近年来针对熊果酸进行结构改造的研究报道较多，
期望能够找到极性增加同时活性增强的转化产物。
微生物转化具有区域和立体选择性强、反应条
件温和、操作简便、成本较低等多个优点，且能使
天然产物发生可以在发生羟基化、氧化、结构异构
重排等反应[7]，从而受到国内外学者的关注。本课

收稿日期：2014-01-10
作者简介：王志平（1980—），男，主管药师，研究方向为临床药学。
*通信作者 刘岱琳，教授，硕士研究生导师，研究方向为天然药物活性成分研究。Tel: (022)84876772 E-mail: dailinlch@163.com
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题组一直利用微生物转化的方法对天然产物进行结
构改造研究，已经利用 RP-HPLC 结合薄层色谱检
测了 25种真菌微生物对熊果酸的转化情况[8]，确定
了 3种菌种能够实现转化，在此基础上又扩展了真
菌筛选范围，发现了阿达青霉 Penicillium adametzi
也能够对熊果酸发生微生物转化。而且本课题组已
经利用阿达青霉转化熊果酸的同分异构体齐墩果
酸，并获得了一系列转化产物，且发现抗肿瘤活性
优于底物的产物[9-10]。本实验在前期工作的基础上，
利用阿达青霉进行熊果酸的微生物转化，获得了一
个熊果酸的微生物转化产物，其结构鉴定为3β, 21α-
二羟基熊果酸-28-O-β-D-葡萄糖苷，该转化产物为 1
个新化合物。药理实验表明该化合物具有一定的抑
制 HepG2细胞的细胞毒活性，且活性强于底物。
1 仪器与材料
HZQ—QX 全温振荡器（哈尔滨东联电子技术开
发有限公司），SW—CJ—2FD 双人单面净化工作台
（苏州净化设备有限公司），FA1204B电子天平（上海
精密科学仪器有限公司），Yanaco MP—S3 熔点测定
仪（日本Yanaco公司），P—1020旋光测定仪（Jasco
公司），Bruker Maxis Q-TOF质谱仪、Bruker AV—400
核磁共振波谱仪（布鲁克公司），半制备高效液相色
谱仪（泵，岛津公司 LC—6A，检测器：UV 204 nm，
色谱柱：RP18，Shimadzu，250 mm×20 mm，5 μm）。
甲醇、乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公
司），葡萄糖（天津市化学试剂一厂），GF254薄层板
（10 cm×10 cm，青岛海浪硅胶干燥剂厂），无水乙
醇（分析纯，天津康科德科技有限公司），纯净水（杭
州娃哈哈饮料有限公司）。无支原体胎牛血清（FBS，
Hyclone产品）；RPMI 1640培养基（Gibco产品）；
四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma产品）；青霉素（华
北制药有限责任公司产品）；链霉素（Gibco产品）。
阿达青霉 Penicillium adametzi购自中国科学院
微生物研究所。固体培养基：PDA培养基（马铃薯
葡萄糖琼脂培养基）；转化培养基：PDB培养基（马
铃薯葡萄糖液体培养基）。熊果酸对照品和熊果酸试
药（对照品质量分数为 98%，试药质量分数为 90%，
天津市科曼思特医药科技发展有限公司）。
2 方法
2.1 生物转化方法
取活化后的阿达青霉斜面菌种 1支，用无菌水
冲洗斜面上的孢子，振摇，得阿达青霉孢子悬浮液。
取适量的孢子悬浮液接入新鲜无菌液体培养基中，
在 28 ℃、140 r/min条件下培养 2 d。取适量熊果酸
用无水乙醇溶解，配制成质量浓度为 9 mg/mL的药
液，60 ℃加热超声 10 min溶解，经过 0.22 μm滤
膜。在无菌条件下取适量药液加入到培养液中，底
物（熊果酸）浓度为 0.3 mg/mL，在相同条件下继
续培养 3 d。
2.2 转化产物的分离
按照“2.1”项的转化方法累积样品，将累积的
培养液抽滤后，用等体积正丁醇萃取 2次，合并萃
取液，减压浓缩至干，得到浸膏 12 g，采用大孔树
脂 HP20（45 cm×3.7 cm）进行分离，以水，30%、
50%、70%和 95%乙醇梯度洗脱，得到 5 个洗脱组
分（组分 1～5）。组分 1（540 mg）经硅胶柱色谱
分离，氯仿-甲醇（99∶1→80∶20）梯度洗脱，获
得 5个洗脱组分（组分 11～15）。其中组分 14（132
mg）进行反相制备液相纯化，甲醇-水（3∶2）洗
脱获得 1个转化产物 1（36 mg）。
2.3 利用 MTT 法测定转化产物的细胞毒活性
分别将肝癌细胞 HepG2 和肝癌多药耐药细胞
HepG2r培养于RPMI 1640培养液中，加入 10%胎牛
血清，1%抗生素（10 000 U/mL青霉素、10 000 μg/mL
链霉素），于 37 ℃、5% CO2条件的湿热培养箱中培
养。每 2天继代培养，使细胞保持在对数生长期，进
行实验。
各个待测样品均分别用 DMSO溶解，用无血清
的 RPMI 1640培养液配制成 1 mg/mL的储备液，置
于−20 ℃保存。测试前再用无血清的 RPMI 1640培
养液稀释成终质量浓度为 25 μg/mL 的待测溶液
（DMSO的终体积分数应小于 0.5%）。MTT用 PBS
溶液配成 5 mg/mL的母液，于 4 ℃避光保存。
在96孔培养板的每一个孔中加入90 μL生长良
好的肿瘤细胞（约含有 1×104个细胞/孔），24 h后
加入供试样品，每组平行设 4个复孔，同时设阳性
对照、阴性对照和空白对照，在 37 ℃，5% CO2条
件下共同培养 48 h。然后，每孔加入 10 μL的MTT
溶液（5 mg/mL）继续培养 4 h。离心弃去培养液，
染色的细胞用 DMSO（100 μL/孔）溶解，待结晶完
全溶解后，用酶标仪于 570 nm处测吸光度（A）值，
并按如下公式计算细胞增殖抑制率。
增殖抑制率=1－A 样品 / A 空白对照
3 实验结果
3.1 转化产物的结构鉴定
化合物 1：白色粉末（甲醇）， 20D]α[ ＋32.5° (c
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0.12, MeOH)，Libermann-Burchard反应阳性，提示
该化合物与底物类似，为三萜类化合物。HR-TOF-
ESI-MS m/z: 657.831 2 [M＋Na]+（计算值 657.830 1），
确定分子式为 C36H58O9。 1H-NMR (400 MHz,
C5D5N) δ: 0.95, 1.03, 1.20, 1.19, 1.24 (各 3H, s) 和
1.05 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.37 (3H, d, J = 6.3 Hz) 为 7
个熊果酸型的三萜甲基氢信号；5.50 (1H, m, H-12)
为烯氢信号，30个为苷元上碳信号，6个为糖基碳
信号。结合 DEPT谱分析，苷元上的 30个碳信号中
有 7 个甲基碳信号 (δ 28.7, 23.6, 17.8, 17.6, 16.5,
16.3, 15.7)，8个亚甲基碳信号，8个次甲基碳信号，
7个季碳信号和 1个羧基碳信号 (δ 175.4)。将化合
物 1苷元部分的碳谱数据和底物熊果酸的数据进行
比较，发现其多出了 1个 δ 70.2的连氧碳信号。在
HSQC谱观察到氢信号 (δ 3.76) 与碳信号 (δ 70.2)
存在相关峰，说明 δ 3.76是与碳信号 (δ 70.2)直接
相连的氢信号。在 HMBC谱中，H-30 (δ 1.37) 与碳
信号 C-20 (δ 47.6) 和 δ 70.2存在相关，氢信号 (δ
3.76) 也与碳信号 δ 47.6 (C-20), 47.6 (C-22) 存在相
关，确定碳信号 (δ 70.2) 是苷元 21位上的碳信号。
此外，在 NOESY谱中可以观察到 H-21 (δ 3.76) 与
H-29 和 H-20 存在远程相关。因此确定 21 位的羟
基为 α型。
取 5 mg化合物 1用 2 mol/L HCl 70 ℃加热水
解 6 h，然后再制备成三甲基硅烷化衍生物，利用气
相分析（L-ChirasilVal 柱），检测器：FID（氢火焰
检测器）；载气：氮气；进样温度为 235 ℃；检测
器温度为 280 ℃。柱温为程序升温，初始柱温
150 ℃，维持 2 min，以 5 ℃/min 的速率升至
200 ℃，维持 5 min。分流比为 10∶1；H2体积流
量为 30 mL/min；尾吹 25 mL/min；进样量：1.0 μL。
样品在 8 min中出峰，与葡萄糖对照品比较，确定
化合物中连接到糖为 D-吡喃葡萄糖。糖链部分氢
谱数据给出糖的端基氢质子信号 δ 6.30 (1H, d, J =
8.0 Hz) 说明其为 β-D-葡萄糖。利用 1H-1H COSY、
TOCSY、NOESY 谱结合 HSQC 和 HMBC 谱对糖
链的信号进行了归属。糖的端基质子碳信号为 δ
95.8 向高场位移，且其端基氢信号在 HMBC 谱中
与羧基碳信号 δ 176.9存在相关，说明该葡萄糖连
接在苷元的 28位，形成了酯苷。综上所述，化合物
1的结构鉴定为 3β, 21α-二羟基熊果酸-28-O-β-D-吡
喃葡萄糖酯苷。经过 Scifinder数据库检索，确定该
化合物为 1个新化合物，结构见图 1；具体的氢谱
和碳谱数据归属见表 1。

HO
COOH1
3 4
10 8
12
30
29
212019
17
14
13
HO
1
3 4
10 8
12
30
29
212019
17
14
13
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OH
图 1 底物和转化产物的结构式
Fig. 1 Structure of substrate and transformatin product
表 1 转化产物 1 的碳谱和氢谱数据
Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data for transformatin product 1
碳位 δC δH 碳位 δC δH 碳位 δC δH
1 39.1 1.61 (2H, m) 16 25.8 2.18 (1H, m), 2.09 (1H, m) 28-glc-1′ 95.8 6.30 (1H, d, J = 8.0 Hz)
2 28.1 1.85 (2H, m) 17 49.3 2′ 74.0 4.18 (1H, m)
3 78.1 3.46 (1H, m) 18 53.1 2.69 (1H, m) 3′ 79.2 4.03 (1H, m)
4 39.3 19 38.5 1.70 (1H, m) 4′ 71.2 4.34 (1H, m)
5 55.8 0.86 (1H, d, J = 8.1 Hz) 20 47.6 1.22 (1H, m) 5′ 78.9 4.28 (1H, m)
6 18.7 1.53 (2H, m) 21 70.2 3.76 (1H, m) 6′ 62.2 4.59 (1H, m), 4.39 (1H, m)
7 33.5 1.54 (1H, m), 1.41 (1H, m) 22 45.9 2.66 (1H, m), 2.11 (1H, m)
8 40.2 23 16.5 1.03 (3H, s)
9 48.1 1.65 (1H, m) 24 28.7 1.24 (3H, s)
10 37.3 25 15.7 0.95 (3H, s)
11 23.7 1.98 (2H, m) 26 23.6 1.20 (3H, s)
12 126.5 5.50 (1H, m) 27 17.6 1.19 (3H, s)
13 138.5 28 175.4
14 42.5 29 17.6 1.05 (3H, d, J = 6.4 Hz)
15 32.8 1.21 (2H, m) 30 16.3 1.37 (3H, d, J = 6.3 Hz)

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3.2 细胞毒活性测试结果
活性测试结果显示化合物 1对于HepG2具有一
定的细胞毒活性，IC50为 19.72 μmol/L，作用优于
底物熊果酸。但是对 HepG2r 的细胞毒作用相对弱
些，结果见表 2。
表 2 熊果酸和化合物 1 抑制细胞增殖的 IC50 值
Table 2 IC50 values of UA and compound 1 on cell proliferation
化合物
IC50 / (μmol·L−1)
HepG2 HepG2r
熊果酸（底物） ＞52.96 ＞52.96
化合物 1（转化产物） 19.72 ＞39.43

4 讨论
本实验首次利用阿达青霉 Penicillium adametzi
对熊果酸进行微生物转化研究，分离并鉴定了 1个
转化产物，3β, 21α-二羟基-熊果酸-28-O-β-D-吡喃葡
萄糖苷，该化合物为一个新的转化产物。本课题组
在前期的微生物转化研究过程中建立了阿达青霉的
生长曲线，定量给予培养基、定量给予孢子，28 ℃、
140 r/min条件下培养 2 d，阿达青霉生长达到高峰
期，在该培养基条件下能够持续 3 d。故选择生长旺
盛期加入转化底物熊果酸，并且培养 3 d，进行转化。
利用 TLC和 HPLC进行检测，共有 2～3个转化产
物存在，并且以转化产物3β, 21α-二羟基-熊果酸-28-
O-β-D-吡喃葡萄糖苷为主，其他转化产物有待后续
进一步研究。本研究利用微生物转化的方法实现了
对熊果酸 C-21位羟基化和 C-28位进行糖苷化。也
验证了微生物转化可以在温和的条件下实现三萜类
化合物的羟基化反应和糖苷化反应，且具有立体选
择性。
文献报道熊果酸具有抑制肝癌细胞 HepG2 的
增殖并且诱导凋亡的作用[11]，本实验在分离鉴定转
化产物结构的基础上，又测定了产物和底物对肝癌
细胞HepG2和肝癌多药耐药细胞HepG2r的细胞毒
活性。结果显示本研究获得的新的转化产物具有很
好的抑制肝癌细胞 HepG2作用，且活性强于底物熊
果酸。但是对于肝癌多药耐药细胞 HepG2r 作用相
对弱些。说明利用微生物转化可以获得更多结构新
颖的天然产物，是获得更多更好的天然候选化合物
的有效途径。
参考文献
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