全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月

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• 药理与临床 •
丹参水溶性成分抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性评价
刘洪亮 1，吕 靖 1，赵志敏 2，沈 丽 1，刘成海 1, 2, 3*
1. 上海中医药大学附属曙光医院 肝病研究所，上海 201203
2. 上海市中医临床重点实验室，上海 201203
3. 上海高校中医内科学 E-研究院，上海 201203
摘 要：目的 探讨丹参水溶性成分对肝窦内皮细胞功能及血管新生的影响。方法 采用肝窦状内皮细胞HHSEC细胞株，
与不同浓度丹参水溶性成分丹酚酸 A、丹酚酸 C、丹参素钠、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸 B共孵育 24 h，CCK-8法评估各
成分细胞毒性。采用内皮细胞生长补充因子（ECGS）诱导 HHSEC细胞增殖，以索拉非尼为阳性对照，EdU法检测细胞增
殖；荧光探针法检测胞内 NO水平和 NOS活力；免疫荧光法检测 CD31表达；转基因斑马鱼实验观察斑马鱼荧光血管数量；
鸡胚绒毛尿囊膜实验检测血管面积。结果 与对照组比较，ECGS能够诱导 HHSEC细胞增殖，NO水平和 NOS活性升高，
CD31表达升高；与模型组比较，索拉非尼及丹酚酸 C、丹酚酸 B、丹酚酸 A能显著抑制 ECGS诱导的 HHSEC细胞增殖，
降低细胞 NO量和 NOS活性，CD31表达明显降低。丹酚酸 B、丹酚酸 A、咖啡酸能够显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生；
丹酚酸 C对转基因斑马鱼功能血管数量具有显著抑制作用。结论 丹参水溶性成分丹酚酸 A、B、C能够抑制肝窦内皮细胞
功能，且具有抑制血管新生的活性。
关键词：丹参；水溶性成分；血管新生；肝纤维化；丹酚酸 A；丹酚酸 C；丹参素钠；咖啡酸；迷迭香酸；丹酚酸 B
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)06 - 0938 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.014
Inhibitory effect of water-soluble components from Salvia miltiorrhiza on liver
sinusoid endothelial cell function and angiogenesis
LIU Hong-liang1, LV Jing1, ZHAO Zhi-min2, SHEN Li1, LIU Cheng-hai1, 2, 3
1. Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
2. Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China
3. E-institute of TCM Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai 201203, China
Abstract: Objective To investigate the effect of water-soluble components from Salvia miltiorrhiza on liver sinusoid endothelial cell
function and angiogenesis. Methods Different dosages of water-soluble components from S. miltiorrhiza were incubated for 24 h
with HHSEC cell line, and the toxicity of HHSEC cells was assayed by CCK-8 method. The proliferation of HHSEC cells was induced
by endothelial cell growth supplements (ECGS), with receptor tyrosine kinase inhibitor sorafenib as positive control, cell proliferation
was analyzed by EdU DNA cell proliferation kit; Fluorescence probe method was used to assay the intracellular NO level and NOS
activity; Immunofluorescence method was performed to observe the expression of CD31; The transgenic zebrafishes were incubated
for 24 h with each component. The fluorescence vessels, the number of functional blood vessels, and intersegmental vessel changes
were observed; Chicken chorioallantoic membranes were incubated for 24 h with each component, Image Analysis Software was used
to analyze the vessel area changes. Results Compared with control group, the proliferation of HHSEC cells induced by ECGS
increased, the level of NO and NOS activity reduced and the expression of CD31 increased; Compared with the model group,
salvianolic acid A, salvianolic acid B, salvianolic acid C, and sorafenib inhibited the proliferation of HHSEC cells induced by ECGS,
reduced the level of NO, NOS activity, and expression of CD31. The vessel area of chicken chorioallantoic membranes was decreased
in sorafenib, salvianolic acid A, salvianolic acid B and caffeic acid. Salvianolic acid C also significantly inhibited the

收稿日期：2015-09-13
基金项目：重大科技专项（2014ZX10005001）；国家自然科学基金资助项目（81173405，81473404，81270053）
作者简介：刘洪亮，在读硕士研究生，研究方向为中医药防治慢性肝病。Tel: 13636698611 E-mail: 286263975@qq.com
*通信作者 刘成海 Tel: (021)20256521 E-mail: chenghailiu@hotmail.com
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intersegmental vessel changes of transgenic zebrafish. Conclusion Salvianolic acid A, salvianolic acid B, and salvianolic acid C
have the potential effects on function of endothelial cell proliferation and angiogenesis.
Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge; water-soluble component; angiogenesis; liver fibrosis; salvianolic acid A; salvianolic acid C;
salvianic acid A sodium; caffeic acid; rosmarinic acid; salvianolic acid B

肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理过程，以
细胞外基质（ECM）成分的过度增生与异常沉积为
特征。近年研究发现，肝脏血管新生是肝纤维化的
重要病理特点[1]，也是门脉高压发生、发展的病理
机制[2-3]，更重要的是，血管新生是肝纤维化难以逆
转的重要原因[4]，其中肝窦内皮细胞是肝纤维化血
管新生的关键细胞学基础。
丹参始载于《神农本草经》，具有活血散瘀、
通经止痛、宁心安神等功效[5]。现代药理学研究发
现，丹参在治疗慢性肝病，尤其是抗肝纤维化方面
有很好的疗效[6]。同时研究也表明丹参对肿瘤及缺
血性疾病的血管新生具有干预作用[7]。丹参成分包
括水溶性和脂溶性两大类，其中水溶性成分主要为
酚酸类化合物，包括丹参素钠、丹酚酸 A、丹酚酸
C、迷迭香酸、咖啡酸、丹酚酸 B等，研究证实丹
参对急慢性肝损伤有治疗作用[8]。本研究通过观察
丹参水溶性成分对人肝窦内皮细胞增殖、转基因斑
马鱼及鸡胚血管生成的影响，评价丹参水溶性成分
抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性。
1 材料
1.1 药物
丹参素钠、丹酚酸 A、丹酚酸 B、丹酚酸 C、
咖啡酸、迷迭香酸，由上海融禾医药科技发展有限
公司分离、提取、鉴定，质量分数＞98%；甲苯磺
酸索拉非尼片（简称索拉菲尼，商品名多吉美），
购自 Bayer公司，质量分数＞98%，批号 PY595112。
CCK-8检测试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司。
1.2 试剂
内皮细胞培养基、胎牛血清（FBS）、内皮细胞
生长补充因子（ECGS），购自 ScinecellTM公司；二
甲基亚砜（DMSO）购自国药集团化学试剂有限公
司；CD31，购自 Abcam公司；EdU细胞增殖试剂
盒，购自广州锐博生物科技有限公司；NO 荧光探
针、NOS试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。
1.3 实验对象
人来源的肝窦状内皮细胞 HHSEC 细胞株，上海
中医药大学附属曙光医院肝病研究所长期保存，以含
5% FBS的内皮细胞培养液培养，每 3天传代 1次。斑
马鱼购自山东省科学院，鸡胚购自上海市农业科学院。
1.4 主要仪器
Olympus IX70 倒置显微镜（日本 Olympus）；
Image-pro Plus 6.1 图像分析软件（美国 Media
Cybernetics 公司）；ArrayScan® VTI 高内涵筛选分
析仪（美国 Thermo Scientific）；微孔板扫描分光光
度计（美国 Bio-Tek）；Thermo Scientific Varioskan
Flash 光谱扫描多功能读数仪（美国 Thermo
Scientific）。
2 方法
2.1 HHSEC细胞增殖实验
2.1.1 CCK-8 法确定各成分的无毒浓度 按每孔
7 500个 HHSEC细胞接种于 96孔板，长至亚单层，
弃原培养液。6种丹参主要水溶性成分以含 5% FBS
的内皮细胞培养液稀释成 5～160 μmol/L 添加至
HHSEC细胞，同时设正常培养液作为对照组，设 4
个复孔，孵育 48 h。弃原培养液，添加 CCK-8工作
液，100 μL/孔，再孵育 2 h，于波长 450 nm处微孔
板扫描分光光度计测定各孔吸光度（A）值。分别
与对照组进行比较，以各药物组与对照组 A值有显
著差异（P＜0.05）的相应浓度为有毒浓度，从而确
定各成分无毒浓度。丹酚酸 A、丹酚酸 C、丹参素
钠、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸 B浓度分别在 12.5、
100、25、50、50、12.5 μmol/L 以下时对 HHSEC
细胞活力无显著影响。
2.1.2 CCK-8 法检测各成分对 ECGS诱导 HHSEC
细胞活力的影响 以每孔 7 500个 HHSEC细胞接
种于 96 孔板，待细胞长至亚单层，在无毒浓度范
围内，分别选择丹酚酸 A 10 μmol/L、丹酚酸 C 80
μmol/L、丹参素钠 20 μmol/L、咖啡酸 40 μmol/L、
丹酚酸 B 10 μmol/L、迷迭香酸 40 μmol/L（各成分
对细胞无毒浓度的 0.8 倍）及阳性对照索拉非尼 5
μmol/L 与 2% ECGS共同孵育 48 h诱导细胞增殖，
以正常培养基为对照组，单独 ECGS作用为模型组。
按照“2.1.1”项方法测定各组 A值。
2.1.3 EdU法检测各成分对 ECGS诱导 HHSEC细
胞增殖的影响 细胞接种及分组给药同“2.1.2”项。
细胞经药物处理 48 h 后，弃原培养液，加入 50
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μmol/L EdU溶液孵育 2 h，4%多聚甲醛固定 15 min，
0.2%甘氨酸孵育 10 min，PBS洗 5 min×2次，0.5%
Triton X-100透化 10 min，PBS洗 5 min，Appllo®
染色反应液避光孵育 30 min，PBS洗 5 min×3次，
Hoechst 避光孵育 10 min，PBS 洗 5 min×2 次，
ArrayScan® VTI高内涵筛选分析仪检测各组细胞荧
光强度。
2.1.4 荧光探针法检测细胞内NO和NOS水平 （1）
NO 水平检测：细胞接种及分组给药同“2.1.2”项。
细胞经药物处理 48 h后，弃药物培养液，原位装载 5
μmol/L DAF-FM DA（NO探针），100 μL/孔，37 ℃
培养箱内孵育 20 min，PBS洗 3次，Thermo Scientific
Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪上检测各组细
胞荧光强度，使用 495 nm激发波长，515 nm发射波
长。（2）NOS活性检测：细胞接种及分组给药同“2.1.2”
项。细胞经药物处理 48 h后，弃原培养液，加入 100
μL NOS检测缓冲液，加入 100 μL检测反应液，37 ℃
细胞培养箱内孵育 2 h，PBS洗 3次，Thermo Scientific
Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪上检测，使用
495 nm激发波长，515 nm发射波长。
2.1.5 免疫荧光法检测细胞CD31表达 细胞接种及
分组给药同“2.1.2”项，细胞经药物处理 48 h后，弃
原培养液，多聚甲醛固定 15 min，PBS洗涤 2次，2.5%
小牛血清白蛋白室温封闭 1 h，一抗 37 ℃孵育 60
min，PBS洗涤 3次，相应的荧光二抗 37 ℃孵育 1 h，
DAPI染核 5 min，PBS洗涤 3次，高内涵分析[9]。
2.2 鸡胚绒毛尿囊膜实验
种蛋大头朝上，无菌培养箱孵育 72 h，温度
37.8 ℃，湿度 60%。眼科剪在种蛋大头打孔，10 mL
无菌注射器吸取蛋清 4～6 mL，弃去。在种蛋中间位
置开口，加 100 μmol/L 的各药物成分（部分药物剂量
高于 100 μmol/L，出现鸡胚坏死，各成分浓度统一确
定为 100 μmol/L）100 μL，对照组加生理盐水，每组
6个种蛋，透明胶带密封开窗处，继续孵育 24 h，摄
片，Image-pro plus 6.1图像分析软件分析血管面积。
2.3 斑马鱼血管新生实验
转基因斑马鱼（VEGFR:GFP）受精卵发育 24
h，移至 96孔板中，每孔预加入受试样品溶液（多
次实验摸索发现 100 μmol/L 药物浓度为斑马鱼可
耐受浓度），每组 5 个复孔，对照为胚胎培养用水
加相应量的助溶剂，加盖封闭，置于光照培养箱
（28 ℃）内继续发育 24 h，于倒置显微镜下观察，
记录节间血管（ISV）的血流情况。麻醉，荧光显
微镜下对体节间血管进行计数并拍照。
2.4 统计学处理
计量资料以 ±x s表示，数据均使用 SPSS 12.0软
件进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析。
3 结果
3.1 对ECGS诱导的HHSEC细胞活力及增殖的影响
CCK-8法检测结果（图 1）显示，丹酚酸 A（10
μmol/L）、丹酚酸 C（80 μmol/L）、丹酚酸 B（10
μmol/L）均能显著抑制 ECGS刺激的HHSEC细胞活
力；丹参素钠（20 μmol/L）、咖啡酸（40 μmol/L）、
迷迭香酸（40 μmol/L）无明显抑制作用。
EdU法检测细胞增殖显示，与对照组相比，模型
组 ECGS诱导的 HHSEC细胞增殖明显；与模型组
相比，索拉非尼、丹酚酸 A、丹酚酸 C、丹酚酸 B
可以明显抑制 ECGS诱导的细胞增殖（图 2）。



N-对照 M-模型 S-索拉非尼 SAAS-丹参素钠 SAA-丹酚酸 A
RA-迷迭香酸 SAC-丹酚酸 C CA-咖啡酸 SAB-丹酚酸 B，与对
照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ## P＜
0.01，下同
N-control M-model S-sorafenib SAAS-salvianic acid A sodium
SAA-salvianolic acid A RA-rosmarinic acid SAC-salvianolic acid C
CA-caffeic acid SAB-salvianolic acid B, *P < 0.05 **P < 0.01 vs
control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below
图 1 丹参水溶性成分对 ECGS 诱导的 HHSEC 细胞活力
的影响 ( x±s, n = 4)
Fig . 1 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza
on HHSEC cells activity induced by ECGS ( x±s, n = 4)
3.2 对HHSEC细胞内NO水平和NOS活性的影响
与对照组相比，ECGS诱导的 HHSEC细胞 NO
水平和 NOS 活性明显升高；与模型组相比，索拉
非尼、丹酚酸 C、丹酚酸 B、丹酚酸 A可显著降低
细胞NO量及NOS活性，其余组无显著变化（图 3）。
3.3 对 HHSEC细胞 CD31表达的影响
与对照组相比，ECGS诱导的HHSEC细胞CD31
表达明显升高；与模型组相比，索拉非尼、丹酚酸 A、
丹酚酸 C、丹酚酸 B组细胞内 CD31表达显著降低，
其余各药物组对 CD31无明显影响（图 4）。
A
值

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0



N M S SAAS SAA RA SAC CA SAB
## ##
## ##
**
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图 2 丹参水溶性成分对 ECGS诱导的 HHSEC细胞增殖的影响 ( x±s, n = 4)
Fig. 2 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on HHSEC cells proliferation induced by ECGS ( x±s, n = 4)


图 3 丹参水溶性成分对 HHSEC细胞内 NO水平和 NOS活性的影响 ( x±s, n = 4)
Fig. 3 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on intracellular NO level and NOS activity of HHSEC cells ( x±s, n = 4)

图 4 丹参水溶性成分对 HHSEC细胞 CD31表达的影响 ( x±s, n = 4)
Fig. 4 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on CD31 expression in HHSEC cells ( x±s, n = 4)
N M S
SAAS SAA RA
SAC CA SAB
平
均
荧
光
强
度

60

40

20

0



N M S SAAS SAA RA SAC CA SAB
N
O
水
平
（
平
均
荧
光
强
度
）
150

100

50

0



N
O
S
活
性
（
平
均
荧
光
强
度
）
80
60
40
20
0



N M S SAAS SAA RA SAC CA SAB N M S SAAS SAA RA SAC CA SAB
N M S
SAAS SAA RA
SAC CA SAB

80
60
40
20
0




C
D
31
表
达
（
平
均
荧
光
强
度
）

N M S SAAS SAA RA SAC CA SAB
**
##
## ##
#
## ##
# #
** **
## ##
##
#

**
##
#
#
##
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3.4 对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响
实验结果显示，与对照组相比，索拉非尼、丹
酚酸 B、丹酚酸 A、咖啡酸可显著抑制鸡胚绒毛尿
囊膜血管新生，其余各药物无明显作用（图 5）。
3.5 对斑马鱼血管新生的影响
实验结果显示，与对照组相比，索拉非尼和丹
酚酸 C对斑马鱼功能血管具有明显的抑制作用，其
余组无明显抑制作用（图 6）。






图 5 丹参水溶性成分对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响 ( x±s, n = 6)
Fig. 5 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on angiogenesis in chick chorioallantoic membranes ( x±s, n = 6)

图 6 丹参水溶性成分对斑马鱼血管新生的影响 ( x±s, n = 5)
Fig. 6 Effects of water-soluble components from S. miltiorrhiza on angiogenesis of transgenic zebrafish ( x±s, n = 5)
N S SAAS SAA
CA SAB
RA SAC

鸡
胚
绒
毛
尿
囊
膜
新
生
血
管
面
积

500
400
300
200
100
0



N S SAAS SAA RA SAC CA SAB
N S
RA SAAS
SAA SAC
CA SAB

30
20
10
0



斑
马
鱼
功
能
血
管
数
量

N S SAAS SAA RA SAC CA SAB

**
**
** **
*
*
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4 讨论
近年来，随着肝纤维化、肝硬化研究的不断深
入，相关认识也发生很大变化。肝纤维化不仅存在
严重程度、病理特点、分子病理机制的差异，而且
存在静止性与活动性的区别。与静止性肝纤维化相
比，活动性肝纤维化纤维间隔内有大量血管增生与
炎性细胞浸润，这种血管新生特征明显的肝纤维化
进展迅速，且难以逆转，即使纤维胶原成分被降解
吸收，肝小叶结构亦难以恢复到正常状态，其危害
更为严重[1,10]。
肝脏血管结构由肝窦内皮细胞（LSECs）和周
细胞组成。LSECs构成血管腔，是血管或肝窦的基
础。在炎性损伤等病理情况下，LSECs可发生“去
分化”表型改变：失窗孔、CD31 表达增加，回到
原始幼稚状态；胞内 NO水平可影响细胞表型发生
改变[11-13]，促进血管新生的发生与发展。研究结果
显示，丹酚酸 A、丹酚酸 C、丹酚酸 B能够抑制细
胞增殖；降低胞内 NO 水平以及 NOS 活性；下调
HHSEC细胞 CD31表达。
鸡胚绒毛尿囊膜是高度血管化了的、附着于蛋
壳内面、薄而透明的膜结构，无需特别准备便能观
察到其微血管结构变化，是公认的测试促进或抑制
血管新生药物的试验器官[14]。斑马鱼血管以其直观
性强、易于获得、重复性好且基因组与人类基因组
具有高度同源性[15]，逐渐被用作筛选血管活性药物
的模型。故本研究采用这两个模型，从器官和整体
水平评价药物抑制血管新生的活性。结果提示，丹
酚酸 A、咖啡酸、丹酚酸 B对鸡胚绒毛尿囊膜血管
具有抑制作用；丹酚酸 C能够显著抑制斑马鱼功能
血管数量。
本研究采用肝窦内皮细胞增殖模型、鸡胚绒毛
尿囊膜实验及转基因斑马鱼模型，从细胞、器官、
整体层次评价丹参水溶性成分抑制血管新生的活
性，综合不同层次实验结果，初步发现丹酚酸 A、
丹酚酸 B、丹酚酸 C具有调节内皮细胞功能、抑制
血管新生的良好效果，其作用机制仍有待于后期结
合体内实验进一步研究
参考文献
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