全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 11 期 2013 年 6 月
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HPLC-ELSD 法测定白头翁总皂苷碱水解产物中 8 种皂苷
季秀美，舒 展，许琼明，刘艳丽*，杨世林
苏州大学药学院，江苏 苏州 215123
摘 要：目的 建立同时测定白头翁总皂苷碱水解产物中 8 种皂苷成分的 HPLC-ELSD 方法。方法 采用 Kromasil C18色谱
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液；柱温 35 ℃；梯度洗脱条件：0～30 min，70%～100%甲醇；
体积流量 1.0 mL/min；ELSD 气化室温度 40 ℃；气体压力 350 kPa。结果 白头翁皂苷 D、常春藤皂苷元 3-O-β-D-吡喃葡萄
糖基-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖、白头翁皂苷 A、黑海常春藤苷 A1、白头翁皂苷 F、齐墩果酸 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-
吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、齐墩果酸 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李
糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、齐墩果酸 3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷进样量分别在 0.799～4.568、
0.563～6.756、0.431～2.683、0.894～7.826、0.643～7.504、1.351～7.822、0.629～2.515、0.698～2.794 μg，峰面积（A）
的对数值 lgA 与相应质量（M，μg）的对数值 lgM 呈良好的线性关系（n＝5），8 种成分的平均回收率在 99.0%～101.0%，且
RSD 值均小于 1.5%。结论 本检测方法简便、准确，为白头翁总皂苷碱水解产物的质量控制提供了依据。
关键词：白头翁总皂苷碱水解产物；HPLC-ELSD；白头翁皂苷 D；白头翁皂苷 A；黑海常春藤苷 A1；白头翁皂苷 F
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)11 - 1416 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.11.011
Simultaneous determination of eight saponins in alkali hydrolysate of total
saponins from Pulsatilla chinensis by HPLC-ELSD
JI Xiu-mei, SHU Zhan, XU Qiong-ming, LIU Yan-li, YANG Shi-lin
Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China
Abstract: Objective To develop an HPLC method for the simultaneous determination of eight saponins in alkali hydrolysate of total
saponins from Pulsatilla chinensis. Methods HPLC was performed on a Kromasil C18 analytical column (250 mm × 4.6 mm, 5.0 μm)
at 35 ℃ with MeOH-0.2% HCOOH solution as the mobile phase by gradient elution and the step gradients were as follows: 0—30 min,
70%—100% MeOH; The flow rate was 1.0 mL/min; ELSD gasification chamber temperature was 40 ℃; Gas pressure of carrier gas N2
was 350 kPa. Results The linear response (the log values of peak areas with corresponding log values of sample introducing amounts)
ranges were 0.799—4.568 μg for pulsatilla saponin D, 0.563—6.756 μg for hederagenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-
arabinopyranoside, 0.431—2.683 μg for pulsatilla saponin A, 0.894—7.826 μg for hederacolchiside A1, 0.643—7.504 μg for pulsatilla
saponin F, 1.351—7.822 μg for oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-
(1→2)-α-L-arabinopyranoside, 0.629—2.515 μg for oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-
(1→2)-α-L-arabinopyranoside, and 0.698—2.794 μg for oleanolic acid 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside,
respectively (n = 5). The average recoveries of the eight saponins were between 99.0% and 101.0%, and RSD values were less than
1.5%. Conclusion The results demonstrate that the established method has the adequate accuracy and selectivity for the quality
control of alkali hydrolysate of total saponins from P. chinensis.
Key words: alkali hydrolysate of total saponins from Pulsatilla chinensis; HPLC-ELSD; pulsatilla saponin D; pulsatilla saponin A;
hederacolchiside A1; pulsatilla saponin F
收稿日期：2012-12-21
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273402）；重大新药创制国家科技重大专项资助（2011ZX11102）；江苏省自然科学基金（BK2012620）
作者简介：季秀美，女，硕士研究生，研究方向为天然药物活性成分及其作用机制研究。Tel: 18862196812 E-mail: jixiumeixn@163.com
*通信作者 刘艳丽，女，副教授。Tel: (0512)69561421 E-mail: liuyanli@suda.edu.cn
网络出版时间：2013-04-22 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130422.0920.007.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 11 期 2013 年 6 月
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白头翁 Pulsatillae Radix 为毛茛科植物白头翁
Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel 的干燥根，是常用
的传统中药，始载于《神农本草经》，列为下品，性
寒、味苦，具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫的
功效，临床上常用于治疗热毒血痢、细菌性痢疾、
阿米巴痢疾、妇科阴道炎等[1]。蔡鹰等[2]研究发现
白头翁水溶性成分具有良好的抗肿瘤效果；Ye 等[3]
经细胞实验证明白头翁酸在体外具有白血病细胞
P388、Lewis 肺癌和人肺癌细胞 A549 的作用；白头
翁皂苷 A3 在体外对 P388细胞亦有生长抑制作用[4]。
另有研究发现白头翁皂苷 C-28 位的游离羧基对于
皂苷的抗肿瘤活性至关重要[5]，同时本课题组的前
期研究表明白头翁总皂苷在体外能抑制肝癌 7402
细胞的增殖，并且呈现一定的剂量依赖性，给药 12
h 后的 IC50值为 150.35 μg/mL[6]；将碱水解后总皂
苷同样作用于 7402 细胞后计算得其 IC50 值为 5.67
μg/mL。实验结果提示白头翁总皂苷碱水解产物抗
肿瘤作用显著提高。在本实验室和浙江大东吴制药
有限公司分别进行了 3 批中试生产，获得了 3 批中
试产品（批号分别为 100108、100824、120615）。为
进一步研究开发中药 5 类新药，本实验采用 HPLC-
ELSD法检测白头翁总皂苷碱水解产物中8种皂苷单
体成分的量，结果表明本方法简便、准确，可为白
头翁总皂苷碱水解产物的质量控制提供研究基础。
1 仪器与材料
岛津高效液相色谱仪（LC—20AB、SPD—20A，
日本岛津公司）；蒸发光散射检测器（Shimadzu
ELSD-LT II，日本岛津公司）；C18 分析色谱柱（250
mm×4.6 mm，5 μm，美国 Kromasil 公司）；D-101
大孔树脂（天津南开大学化工厂）；化学试剂（分析
纯及色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。
白头翁药材购于辽宁绥中，经苏州大学药学院
生药教研室李笑然教授鉴定为毛茛科白头翁属植物
白头翁 Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel 的干燥根，
标本（编号 08-02-15-18）存放于苏州大学药学院。
对照品白头翁皂苷 D[7]（1）、常春藤皂苷元 3-
O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷[8]
（2）、白头翁皂苷 A[7]（3）、黑海常春藤苷 A1[7]（4）、
白头翁皂苷 F[5，经 HR-ESI-MS 及 1D、2D NMR
鉴定为齐墩果酸 3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-
D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-
α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，为
新化合物，相关数据将另文发表]、齐墩果酸 3-O-β-
D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-
α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷 [9]
（6）、齐墩果酸 3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-L-
吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖[10]（7）、齐
墩果酸 3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-α-L-吡喃阿拉
伯糖[8]（8）均为自制，经 MS 和 1H-NMR、13C-NMR
确定结构，HPLC 峰面积归一化法分析质量分数均
达到 98%以上。
2 方法与结果
2.1 样品制备
取干燥的白头翁药材，10 倍量 70%乙醇回流提
取 3 次，每次 1 h，得白头翁总皂苷。将白头翁总皂
苷用 1.0% NaOH 水溶液碱水解反应 6 h 后放冷过
夜，用盐酸调节 pH 值至 7.0，上 D-101 大孔树脂柱，
依次用水，40%、75%、95%乙醇洗脱；收集 75%
乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥即得白头翁总皂
苷碱水解产物[11]。
批号为 100824 的中试样品，本实验室自制，药
材投料量为 25 kg，经上述工艺制备得白头翁总皂
苷碱水解产物为 0.95 kg。批号为 120615 的中试样
品，浙江大东吴制药有限公司中试放大，药材投料
量为 100 kg，经上述工艺制备得白头翁总皂苷碱水
解产物为 4.20 kg。批号为 100108 的中试样品，浙
江大东吴制药有限公司中试放大，药材投料量为
250 kg，经上述工艺制备得白头翁总皂苷碱水解产
物为 12.4 kg。
2.2 色谱条件
色谱柱为 Kromasil C18 色谱柱（250 mm×4.6
mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液；梯
度洗脱：0～30 min，70%～100%甲醇；体积流量
1.0 mL/min；柱温 35 ℃。载气为高纯氮气，ELSD
气化室温度 40 ℃；载气压力 350 kPa。
2.3 系统适用性试验
依据上述色谱条件测定，各对照品峰理论塔板
数均≥5 000，拖尾因子在 0.95～1.05，相邻两峰的
分离度 R≥1.5，系统适用性良好，色谱图见图 1。
2.4 系统重现性试验
选择批号为 100824 的白头翁总皂苷碱水解产
物为参照物考察 HPLC 系统的重现性。连续进样 5
次，结果化合物 1～8 保留时间的平均值分别为
14.562、16.479、18.287、21.417、22.305、22.748、
22.776、24.579 min，RSD 分别为 0.11%、0.02%、
0.06%、0.06%、0.02%、0.05%、0.02%、0.07%；经
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图 1 混合对照品 (A) 和白头翁总皂苷碱水解产物 (B)
的 HPLC 图
Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference
substances (A) and alkali hydrolysate
of total saponins from P. chinensis (B)
计算化合物 1～8 色谱峰面积的 RSD 分别为 1.72%、
1.84%、1.92%、1.58%、1.45%、1.68%、1.32%、1.36%。
以上结果表明系统重现性良好。
2.5 对照品溶液的制备
分别精密称取各对照品适量（精确到 0.01 mg），
分别置 5 mL 量瓶中，甲醇定容，得到各对照品母
液：1（1.142 mg/mL）、2（1.126 mg/mL）、3（1.078
mg/mL）、4（1.118 mg/mL）、5（1.072 mg/mL）、6
（1.126 mg/mL）、7（1.048 mg/mL）、8（1.164 mg/mL）。
根据所需质量浓度按照一定比例量取各对照品母液
置 5 mL 量瓶中，甲醇定容后得到 2 种质量浓度的
混合对照品溶液。混合对照品溶液 1：化合物 1～8
质量浓度分别为 228.40、112.60、129.36、134.16、
85.76、135.12、83.84、93.12 μg/mL；混合对照品溶
液 2：化合物 1～8 质量浓度分别为 159.88、112.60、
86.24、178.88、128.64、180.16、125.76、139.68 μg/mL。
2.6 供试品溶液的制备
精密称取批号 100824 样品 6.42 mg、批号
120615 样品 5.60 mg、批号 100108 样品 5.51 mg 分
别置 5 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，过 0.45 μm 滤膜，
即得。
2.7 线性关系考察
分别精密移取上述对照品混合溶液 1 及 2 各 5、
10、20 μL，按照上述色谱条件注入液相色谱仪，因
峰面积（A）与进样量（M）不呈线性关系，因此以
峰面积对数 lgA 为纵坐标（Y）、进样量对数 lgM 为
横坐标（X）进行线性回归，得回归方程：1 Y＝
1.268 7 X＋9.587，r＝0.999 6；2 Y＝1.402 X＋9.757 3，
r＝0.999 5；3 Y＝1.117 5 X＋9.237 4，r＝0.999 4；4
Y＝1.233 7 X＋9.520 3，r＝0.999 5；5 Y＝1.284 2
X＋9.614 8，r＝0.999 8；6 Y＝1.263 3 X＋9.665 5，
r＝0.999 3；7 Y＝1.360 8 X＋9.833 1，r＝0.999 6；8
Y＝1.196 1 X＋9.447 2，r＝0.999 8；结果表明化合
物 1～8 分别在 0.799～4.568、0.563～6.756、0.431～
2.683、0.894～7.826、0.643～7.504、1.351～7.822、
0.629～2.515、0.698～2.794 μg 线性关系良好。
2.8 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液（化合物 1～8 质量
浓度分别为 159.88、112.60、86.24、178.88、128.64、
180.16、125.76、139.68 μg/mL），按照“2.2”项下
色谱条件，重复进样 5 次，记录峰面积，计算各对
照品峰面积的 RSD 分别为 1.80%、1.90%、1.85%、
1.97%、1.63%、1.40%、1.72%、1.30%，表明仪器
精密度良好。
2.9 重复性试验
取白头翁总皂苷碱水解产物（批号 100824），
按“2.6”项下方法平行制备供试品溶液 5 份，分别
进样分析，得化合物 1～8 的 RSD 分别为 1.69%、
0.79%、1.55%、1.60%、1.46%、1.06%、1.17%、0.92%，
结果表明该试验方法重复性良好。
2.10 稳定性试验
取同一份白头翁总皂苷碱水解产物（批号
100824）供试品溶液，分别在 0、2、4、12、24、
48 h 进样分析，记录各成分色谱峰峰面积，测得化
合物 1～8 峰面积的 RSD 分别为 1.63%、1.83%、
1.78%、1.71%、1.49%、1.88%、1.85%、1.80%，结
果表明供试品溶液在 48 h 内稳定性良好。
2.11 回收率试验
精密称取一定量的白头翁总皂苷碱水解产物
（批号 100824）置 10 mL 量瓶中，按照样品中每种
待测成分量的 80%、100%、120%定量加入 8 种对
照品，甲醇定容并过 0.45 μm 滤膜，精密吸取 20 μL
进样分析，记录各成分的峰面积，计算回收率。结
果测得各成分的加样回收率分别为 100.2%、99.5%、
100.8%、100.1%、100.6%、100.0%、99.9%、99.9%，
RSD 分别为 1.19%、0.74%、0.60%、1.24%、1.23%、
1.00%、1.43%、1.43%。
1
2
3 4
5 7
8
6
1
2 3
4
5
6
7 8
0 5 10 15 20 25 30
t / min
A
B
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2.12 定量测定
按照“2.6”项下制备方法制得供试品溶液，按
照“2.2”项所述色谱条件进行测定，计算 3 批白头
翁总皂苷碱水解产物中各成分的量，结果见表 1。
3 讨论
本课题组曾对白头翁的化学成分进行了系统研
究[12]。本实验利用从白头翁药材中分离得到的化合
物为对照品，对白头翁总皂苷碱水解产物进行了定
表 1 白头翁总皂苷碱水解产物中各成分测定结果
Table 1 Determination of each compound in alkali hydrolysate of total saponins from P. chinensis
质量分数 / % 样 品
1 2 3 4 5 6 7 8
总量 / %
100824 26.85 11.64 4.99 15.53 4.69 12.86 4.43 4.12 85.14
120615 27.44 11.81 5.02 15.77 4.66 12.66 4.29 3.99 85.08
100108 30.72 12.61 5.57 15.71 4.60 11.75 3.46 2.30 86.75
量测定；同时由于皂苷类成分的紫外吸收较弱，本
实验选择了蒸发光散射检测器，建立了同时测定这
8 种皂苷单体的 HPLC 方法。由于白头翁总皂苷水
解产物中含有多个游离羧基，容易造成拖尾峰，所
以在流动相中加入 0.2%甲酸并采用了梯度洗脱的
方式，有效消除了峰拖尾现象。较大的体积流量影
响各峰的分离度，体积流量较小又造成保留时间延
长，峰形展宽，综合考虑最终确定体积流量为 1.0
mL/min。柱温对一些色谱峰的分离度有一定影响，
在柱温为 35 ℃时各色谱峰得到了满意的分离，故
以 35 ℃为分析柱温。
本实验所建立的 HPLC-ELSD 法测定白头翁总
皂苷碱水解产物中 8 种单体皂苷的方法，方法学考
察结果表明该方法灵敏度高、日间变异小、回收率
高、稳定性好，可作为白头翁总皂苷碱水解产物定
量测定的方法。采用此方法同时测定了 3 批不同批
次的总皂苷碱水解产物，结果表明 3 批总皂苷碱水
解产物中 8 种单体皂苷的总量相近，提示本研究所
采用的提取方法较为稳定，同时为白头翁总皂苷碱
水解产物的质量控制提供了研究基础。
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