全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 13期 2016年 7月

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茯苓发酵液中蛋白质的电泳分离与质谱分析
胡朝暾 1，唐 霞 2，肖 震 2，付 明 1，胡 兴 1*
1. 怀化学院生物与食品工程学院，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南 怀化 418008
2. 湖南师范大学生命科学学院，湖南 长沙 410081
摘 要：目的 研究茯苓发酵液中的蛋白质，对其进行分离与鉴定。方法 采用液体发酵获得茯苓发酵液，Bradford法测定
样品中蛋白质的质量浓度，有机酸沉淀法提取蛋白质，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，蛋白质电泳片段进行胶内酶解、质谱分
析和搜库鉴定。结果 茯苓发酵液中蛋白质的质量浓度为 74.01 μg/mL，其相对分子质量（M）主要分布在 2.8×104～1.3×
105。通过质谱鉴定从茯苓发酵液中鉴定得到了 51种蛋白质，如过氧化氢酶、蛋白激酶、碱性蛋白酶、糖化酶和溶菌酶等。
结论 茯苓发酵液中蛋白质种类丰富，是开展茯苓蛋白质研究及开发茯苓发酵保健食品与饮料的理想材料。
关键词：茯苓；发酵液；蛋白质；SDS-PAGE电泳；质谱分析；过氧化氢酶；蛋白激酶；碱性蛋白酶；糖化酶；溶菌酶
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)13 - 2269 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.13.011
Electrophoresis separation and MS analysis of proteins in fermentation broth of
Poria cocos
HU Zhao-tun1, TANG Xia2, XIAO Zhen2, FU Ming1, HU Xing1
1. Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, College of Biological and
Food Engineering, Huaihua College, Huaihua 418008, China
2. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China
Abstract: Objective In order to carry out the study on proteins from Poria cocos fermentation broth, the proteins in the fermentation
broth were separated and identified. Methods Proteins were obtained by organic acid precipitation from the fermentation broth and
the protein concentration was determined by Bradford method. The obtained P. cocos secreted proteins were separated on SDS-PAGE
electrophoresis, subjected to in-gel digestion, then identified by mass spectrometric analysis followed by database searching. Results
The protein concentration in the fermentation broth was around 74.01 μg/mL, with the apparent molecular weight ranged from 2.8 ×
104 to 1.3 × 105. A total of 52 P. cocos secreted proteins were identified, including catalase, protein kinase, alkaline protease,
glucoamylase, lysozyme, and so on. Conclusion P. cocos fermentation broth has abundant proteins, which could be a good material
for the study of P. cocos protein and also a potential healthy food and beverage.
Key words: Poria cocos (Schw.) Wolf; fermentation broth; protein; SDS-PAGE electrophoresis; mass spectrometry; catalase; protein
kinase; alkaline protease; glucoamylase; lysozyme

茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf是我国传统的中
药材，其药用已有 2 000多年的历史。《神农本草经》
中把茯苓列为上品，有“久服安魂养神，不饥延年”
的作用。另外，茯苓也是我国历史悠久的食品和保
健品，如茯苓饼、茯苓酒、茯苓糕、茯苓包子和茯
苓粥等。目前，茯苓的研究主要集中在次生代谢产
物上，研究最多的是茯苓多糖，茯苓多糖及其衍生
物羧甲基茯苓多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、
调血脂和保肝等作用[1-5]；其次是茯苓三萜化合物，
研究发现其具有抗炎、抗氧化及抑制肿瘤细胞生长
等药理作用[6-10]；而茯苓蛋白质的研究报道很少，
仅有许辅等[11]对茯苓免疫调节蛋白PCP的纯化与生

收稿日期：2016-02-11
基金项目：湖南省高校创新平台开放基金项目（3K111）；湖南省高校产业化培育项目（10CY014）；民族药用植物资源研究与利用湖南省重点
实验室开放基金项目（HHUW2011-53，YYZW2014-1）
作者简介：胡朝暾（1977—），男，博士，讲师，研究方向为药用植物与蜘蛛毒素研究。E-mail: huzhaotun@163.com
*通信作者 胡 兴（1971—），男，博士，教授，研究方向为药用植物研究。E-mail: huxing98@126.com
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理活性进行了研究；另外，本研究室李洪波等[12]对
茯苓免疫调节蛋白-I抗体制备进行了研究。
液体发酵培养具有生产周期短、成本低、能够
大规模工业化生产等优势，广泛用于灵芝、茯苓、
冬虫夏草和香菇等真菌培养[13-14]。茯苓发酵液能够
产生蛋白质、多糖等大分子物质和氨基酸、维生素、
抗生素、生物碱、甾醇类、黄酮类等小分子活性物
质，是茯苓天然活性化合物的重要来源之一。此外，
研究发现通过液体发酵获得的茯苓发酵液含有的活
性成分与茯苓菌核所含活性成分有差别[15-16]，因此
开展茯苓发酵液的活性成分研究很有意义。迄今为
止，未见有关茯苓发酵液蛋白质研究的报道，对于
茯苓发酵液中含有哪些蛋白质也是未知。因此，本
实验开展了茯苓发酵液蛋白质的分离与鉴定研究，
对后续开展重要茯苓蛋白质的系统研究以及开发茯
苓蛋白饮料和保健品具有指导意义。
1 仪器与材料
Protean II 垂直平板电泳槽和 PowerpacTM通用
电泳仪，美国伯乐公司；Micro TOFQ-II电喷雾-四
极杆-飞行时间串联质谱仪，配备有纳流（nano）喷
雾源，德国布鲁克公司；Ultimate 3000液相色谱仪，
戴安公司，DU-800 紫外可见分光光度仪，美国贝
克曼公司。
茯苓菌种湘靖 28 购自于湖南怀化靖州湘桂黔
药用菌研究所，胰蛋白酶（蛋白质组学级，CAS号
9002-07-7）、碳酸氢铵（CAS 号 1066-33-7）、三氯
乙酸（CAS号 76-03-9）、三氟乙酸（CAS号 76-05-1）、
苯甲基磺酰氟（CAS号 76-05-1）、二硫苏糖醇（CAS
号 3483-12-3）、碘乙酰胺（CAS号 87-51-4）、Hepes
（CAS 号 7365-45-9）和甲酸（CAS 号 64-18-6）购
自于美国 Sigma公司；丙烯酰胺（CAS号 79-06-1）、
甲叉-双丙烯酰胺（CAS号 110-26-9）、甘氨酸（CAS
号 56-40-6）、三羟甲基氨基甲烷（CAS号 77-86-1）
和十二烷基硫酸钠（CAS号 151-21-3）购自于美国
Amresco 公司；考马斯亮蓝 G-250（CAS 号
6104-58-1）购自于美国 Bio-Rad实验室；色谱纯乙
腈（CAS 号 75-05-8）购自生工生物工程（上海）
有限公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
2 方法和结果
2.1 菌种的活化及发酵培养
制备 PDA斜面培养基 5支，将菌种湘靖 28接
种到 PDA培养基后放入 26 ℃恒温培养箱中培养 3
d 左右，然后将固体培养菌种接种到液体培养基进
行种子活化培养 7 d，种子液体培养基配方为：葡萄
糖 20 g、酵母浸膏 4 g、蛋白胨 6 g、MgSO4•7H2O 1
g、KH2PO4 2 g、维生素 B1（VB1）40 mg、蒸馏水
1 000 mL、pH自然（4.9）。然后再配制液体深层发
酵培养基，其配制方法为葡萄糖 20 g、蛋白胨 10 g、
MgSO4•7H2O 1.5 g、KH2PO4 3 g、VB1 40 mg、蒸馏
水 1 000 mL、pH自然（4.9）。在 250 mL三角瓶分
别装入 45 mL液体发酵培养基和 5 mL种子液，以
26 ℃和 160 r/min转速摇瓶培养 6 d。将培养好的发
酵液，4 ℃、11 000 r/min离心 20 min，上清液即为
粗酶液。
菌种活化与发酵培养时每天进行鉴定，发现白
色菌丝长势良好，生长迅速，没有出现杂菌的污染。
菌种液体发酵培养时每天检测菌丝体的生长情况，
发现有染菌的就将其剔除，保留发酵正常的，6 d
发酵过程中发现 3瓶染菌，剩下的 25瓶发酵正常。
收集发酵液离心得到粗酶液约 1 200 mL，菌丝体湿
质量 17.12 g。
2.2 茯苓发酵液蛋白质质量浓度测定
茯苓发酵液蛋白质质量浓度测定采用 Bradford
法。具体过程简述如下：取 6支编号的干净试管分
别加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL
牛血清白蛋白溶液，向前 5支试管中加蒸馏水至溶
液总体积为 1.0 mL。再向 6支试管中分别加入 5 mL
的考马斯亮蓝G-250染液，混匀后室温下静置 5 min
后在 595 nm处比色，记录每个溶液的吸光度（A595）
值并制作标准曲线，得到回归方程。另取 3支干净
试管，每支试管分别加入 5 mL的考马斯亮蓝 G-250
染液和 1.0 mL样品粗酶液，同样混匀后在 595 nm
处比色记录得到样品溶液 A595值，取平均值代入回
归方程计算得到粗酶液中蛋白质的质量浓度。
经测定得到 6支试管溶液的 A595值分别为 0、
0.075、0.147、0.225、0.292、0.378。通过标准曲线
软件制作得到回归方程：Y＝0.003 7 X－0.000 9，r
为 0.999 6。样品溶液的 A595值分别为 0.272、0.276、
0.281，取平均值 0.276代入回归方程得到样品溶液
蛋白质质量浓度为 74.01 μg/mL，茯苓发酵液中蛋白
质的质量浓度较低。
2.3 茯苓发酵液蛋白质的提取与 SDS-PAGE 发酵
液分离
采用丙酮-三氯乙酸沉淀法提取茯苓发酵液蛋
白质。将含有 20 μmol/L 二硫苏糖醇的 10%三氯乙
酸溶液 20 mL倒入 50 mL粗酶液中混匀，在 4 ℃
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下静置 2 h；4 ℃，15 000×g离心 30 min，保留沉
淀；通过倒置的方法将离心管反扣于干净的滤纸上，
使其干燥。待其干燥后，加入 3 mL预冷丙酮于沉
淀中，混匀并在冰上反应 30 min。4 ℃，15 000×g
离心 20 min，取沉淀在空气中干燥。用含 100 μmol/L
二硫苏糖醇的 2% SDS溶液裂解蛋白，在沸水浴中
煮沸 5 min 后点样进行电泳实验。电泳时参照
Bio-Rad 公司方法进行，采用 Tris-甘氨酸不连续凝
胶系统，凝胶体系为 5%的浓缩胶及 12%的分离胶。
10 mA恒流电泳溴酚蓝线迁移移至分离胶与浓缩胶
界面时，增大电流至 20 mA。待溴酚蓝线距离胶下
沿 0.5 cm处时停止电泳。染色和脱色：将凝胶剥离，
胶先用固定液（乙酸-甲醇-水 1∶4∶5）固定 1 h，
水洗 4次（15 min/次），然后加入 G-250胶体考染
液［100 mL双蒸水＋100 mL 85% H3PO4→混匀后加
100 g (NH4)2SO4→溶解后加 500 mL双蒸水→加 1.2
g考马斯亮蓝 G-250（可过夜）→溶解后加入 200 mL
甲醇→混匀定容到 1 000 mL，保存在棕色瓶中，室
温下储存］中染色 3 h，去掉染色液，水洗 3～5次
至背景清晰。
图 1为茯苓发酵液中蛋白质 SDS-PAGE图谱。
泳道 A和 B上样量为 20 μL，泳道 C和 D上样量为
15 μL，泳道 E上样量为 10 μL；M为Marker；1～
14为酶切条带。从电泳图谱中可知茯苓发酵液蛋白
质相对分子质量（M）主要分布在 2.8×104～1.3×
105区域，其中 2.8×104～7.2×104区域最多，1.3×
105以上区域分布很少。另外，从电泳图中可以发现
不同上样量对电泳条带除了亮度有些细微差异外，
条带数目差异不明显。
2.4 蛋白质条带的胶内酶解、质谱分析与搜寻鉴定
蛋白质原位酶解参照 Hellmann 等[17]的方法进
行。主要步骤为（1）脱色：将胶带切割后，分别置
于 EP 管中，加入 100 μL 脱色液（50%乙腈，25
mmol/L NH4HCO3）于 37 ℃温水浴 30 min，反复操
作至胶块无色透明，最后加入 100 μL 乙腈至胶成白
色胶块，冻干。（2）还原烷基化：向冻干后的胶块
中加入 50 μL 含 10 mmol/L 二硫苏糖醇的 25
mmol/L NH4HCO3溶液，56 ℃水浴 1 h后室温冷却，
吸出多余的液体，加入同体积的含 55 mmol/L碘乙
酰胺的 25 mmol/L NH4HCO3溶液，室温暗处放置
45 min。反应完成后，依次用 25 mmol/L NH4HCO3
溶液、50%乙腈、100%乙腈冲洗。重复操作 1次后
冷冻干燥。（3）酶解：将胰蛋白酶（质谱纯）溶于


1～14-质谱鉴定条带 M-Marker A、B-20 μL C、D-15 μL E-10 μL
1—14-MS identification bands M-Marker A, B-20 μL C, D-15 μL
E-10 μL

图 1 茯苓发酵液中蛋白质 SDS-PAGE
Fig. 1 SDS-PAGE of proteins in P. cocos fermentation broth

1 mmol/L的盐酸中，终质量浓度为 1 μg/μL，−20 ℃
保存。溶液使用前，用 25 mmol/L NH4HCO3溶液将
胰蛋白酶的终质量浓度配制成 0.02 μg/μL。向每个
胶条加入约 8 μL 的酶液使其充分吸胀，然后去掉多
余的酶液，加入 50 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液覆
盖。37 ℃水浴酶解过夜（16 h）。酶解后的肽片段
依次用 50 μL 含 0.1% TFA的 30%乙腈溶液、50%
乙腈和 90%乙腈溶液梯度萃取，合并萃取液，冻干
后置−20 ℃保存，备用。
胶内酶解后的样品用 10 μL样品溶解液（5%乙
腈的水溶液）重新溶解后转入进样瓶，准备 nano
LC-MS/MS分析。质谱仪为德国 Bruker公司的电喷
雾-四极杆-飞行时间串联质谱Micro TOFQ-II，配备
戴安公司的 Ultimate3000毛细管液相色谱仪（Nano
LC）和纳升（Nano）喷雾源。采用正离子模式下，
用 Glu-fib的串联碎片进行校正，质量误差为±0.1。
雾化气为氮气，碰撞气为氩气，离子源温度为
150 ℃，锥孔电压为 1 200 V。仪器的MS和MS/MS
的转换通过 micro TOF control 3.0控制软件自动切
换，限制条件为MS信号强度大于 1 000。自动进样
1.7×105
1.3×105

9.5×104

7.2×104

5.4×104


4.3×104


3.4×104



2.8×104






1.7×104


1.0×104
1

2
3
4

5
6

7

8
9

10

11





12

13

14
A B C D E M
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系统连接 1 个 C18预柱（5 mm×320 μm）和 1 个
C18毛细管柱（15 cm×75 μm）。样品经预柱脱盐和
浓缩后，梯度洗脱经 C18毛细管柱进行肽段分离。
洗脱梯度为 0～4 min，5%乙腈；4～40 min，5%～
50%乙腈；40～45 min，50%～90%乙腈；45～55
min，90%乙腈；55～65 min，90%～5%乙腈；体积
流量为 300 nL/min；分离后的肽片段直接进入离子
源。1次选择 3个最大强度的肽段进行MS/MS分析，
同一质荷比的离子被排除采集。使用 Mascot 软件
（Matrix Science Ltd.，UK）中的串级质谱数据搜索
功能（MS/MS Ions Search）进行搜索（http://www.
matrixscience.com）。数据库的搜索选择下列参数：
固定修饰选择 carbamoylmethylation（C），限制性切
割酶选择 Trypsin，允许最大漏切位点（missed
cleavages）数为 1，肽段的 M 容差（tolerance）为
0.5，二级离子的M容差为 0.5，结果报告数目选择
auto。肽段的得分（mowse scores）超过域值
（threshold）的视为可信的鉴定肽段[18]。
为了使这些分离了的蛋白质被有效地鉴定，
SDS-PAGE胶带被取下，经脱色、还原烷基化后采
用胰酶酶解。酶解结束后，用不同浓度的乙腈对胶
带进行萃取，合并萃取液并冻干后保存于冰箱。质
谱分析时，每一胶带酶解后的多肽混合物先通过
Dionex的反相 nano LC分离后在线进入Bruker公司
的 micro TOFQ II质谱分析系统进行质谱分析。获
得的数据经 Bruker公司的 Data Analysis 4.0软件分
析后输出 mgf文件。将得到的 mgf文件采用Mascot
软件中的串级质谱数据搜索功能（MS/MS Ions
Search），搜库时所选取的物种库为真菌库。
通过质谱分析和搜库鉴定，从茯苓发酵液中共
鉴定了 51 种蛋白质（表 1），其中最多的是一些具
有生物活性的酶类：过氧化氢酶、丝氨酸/苏氨酸蛋
白激酶、碱性蛋白酶、糖化酶、溶菌酶、甘油醛-3-
磷酸脱氢酶甘露醇脱氢酶、S-腺苷高半胱氨酸水解
酶、丝氨酸羟甲基转移酶、天冬氨酸蛋白酶、透明
质酸合成酶、解旋酶、ATP合成酶、DNA聚合酶、
琥珀酰-CoA 连接酶、转醛醇酶、吡咯啉-5-羧酸还
原酶、N-末端乙酰转移酶、柠檬酸合成酶、胞嘧啶
脱氨酶、线粒体金属肽链内断酶、内切核酸酶等。
图 2为条带 4的Mascot搜库结果，通过图谱可以知
道条带 4所鉴定的蛋白数量和种类。去冗余后共鉴
定得到了 10类蛋白质，主要有过氧化氢酶、丝氨酸
羟甲基转移酶、ATP合成酶、DNA聚合酶和外膜脂
蛋白等。图 3为过氧化氢酶 B二级质谱图。除了上
述酶类外，在茯苓发酵液中还鉴定到一些重要的蛋
白质分子，如细胞壁蛋白、钙通道蛋白、外膜脂蛋
白、微管蛋白折叠辅助因子和转录延伸因子等。
蛋白质作为生命活动的体现者和物质基础，在
生命活动过程中具有十分重要的作用。虽然茯苓使
用历史悠久、研究较为广泛，但对茯苓蛋白质所知
甚少。本研究首次对茯苓发酵液中蛋白质进行了初
步研究，获知了茯苓发酵液中总蛋白质量浓度及组
成发酵液的蛋白质种类。该研究具有重要的意义，
为开展茯苓蛋白质相关研究打下了良好的基础。后

表 1 茯苓发酵液中蛋白质质谱鉴定结果
Table 1 MS identification of proteins from P. cocos fermentation broth
序号
质谱鉴
定片段
蛋白识别码 得分 M
谱图匹
配次数
特异性谱图
匹配次数
肽段序列
匹配数
特异性肽段
序列匹配数
蛋白描述
1 4 EFTU_PSEFS 109 43 878 16 8 9 4 延伸因子 Tu
2 OPRI_PSEAE 91 8 887 1 1 1 1 主要外膜脂蛋白
3 SUCC_PSE14 62 41 494 2 2 2 2 琥珀酰-CoA连接酶 [ADP形成] β 亚基
4 GLYA2_AGRFC 65 44 919 2 1 1 1 丝氨酸羟甲基转移酶 2
5 CH60_PSEFS 49 56 988 4 1 4 1 6×104伴侣蛋白
6 ATPA_PSEFS 46 55 416 4 1 4 1 ATP合成酶 α 亚基
7 DPO3A_CHLPN 32 141 354 1 1 1 1 DNA聚合酶 III α 亚基
8 HYAS3_XENLA 26 22 879 1 1 1 1 透明质酸合成酶 3（片段）
9 MFNA_META3 25 44 240 1 1 1 1 L-酪氨酸/L-天冬氨酸脱羧酶
10 5 AMYG_SCHCM 685 61 189 19 14 8 7 糖化酶 ARB_02327-1
11 ALP1_SCHPO 33 127 676 3 1 2 1 微管蛋白折叠辅助因子 D
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续表 1
序号
质谱鉴
定片段
蛋白识别码 得分 M
谱图匹
配次数
特异性谱图
匹配次数
肽段序列
匹配数
特异性肽段
序列匹配数
蛋白描述
12 TFC5_SCHPO 30 59 104 1 1 1 1 转录因子 TFIID组分 B″
13 6 P5CR_SCHPO 42 30 254 2 2 1 1 吡咯啉-5-羧酸还原酶
14 YDYB_SCHPO 35 106 186 1 1 1 1 pH值和 SEC7结构域蛋白 C11E3.11c
15 FCY1_YEAST 31 17 838 1 1 1 1 胞嘧啶脱氨酶
16 PEPA_ASPAW 26 41 266 1 1 1 1 天冬氨酸蛋白酶 PEP1
17 7 ATG9_CANGA 30 107 516 3 2 1 1 自噬相关蛋白 9
18 YQ52_SCHPO 23 111 089 1 1 1 1 未鉴定的蛋白质 C162.02c
19 CISY2_YEAST 23 51 381 1 1 1 1 过氧化物酶体柠檬酸合成酶
20 8 TOM1_ASHGO 38 373 992 5 3 2 1 可能的 E3泛素连接酶蛋白 TOM1
21 SLX4_NEUCR 25 110 140 1 1 1 1 结构特异性内切核酸酶亚基 SLX4
22 8 DENR_DEBHA 22 21 976 1 1 1 1 翻译机制相关蛋白 22
23 REC10_SCHPO 20 90 561 1 1 1 1 减数分裂重组蛋白 rec10
24 CCH1_SCHPO 18 214 510 2 1 1 1 钙通道蛋白 CCH1
25 9 TAL1_SCHPO 56 35 330 2 1 2 1 转二羟丙酮基酶，转醛醇酶
26 CATB_EMENI 47 79 329 2 1 2 1 过氧化氢酶 B
27 G3P1_YEAST 29 35 842 1 1 1 1 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 1
28 CATA_YEAST 14 58 804 1 1 1 1 过氧化物酶体过氧化氢酶 A
29 10 BUB1_SCHPO 40 118 564 2 1 1 1 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶 BUB1
30 11 ORYZ_ASPFL 135 42 743 8 5 2 2 碱性蛋白酶 1
31 NAT1_YEAST 34 99 299 1 1 1 1 N-末端乙酰转移酶复合物亚基 NAT1
32 RL7_NEUCR 30 28 727 1 1 1 1 60S核糖体蛋白 L7
33 RPB1_PICGU 19 176 405 1 1 1 1 DNA指导的 RNA聚合酶 II亚基 RPB1
34 12 MTDH_HYPJE 105 28 631 2 2 1 1 NADP依赖性甘露醇脱氢酶
35 EFGM_ASPCL 38 90 013 1 1 1 1 线粒体延伸因子 G
36 TIM50_CANAL 21 54 322 1 1 1 1 线粒体进口内膜转位酶亚基 TIM50
37 MDE2_SCHPO 19 31 955 3 1 1 1 Mei4依赖性蛋白 2
38 RUVB2_ASHGO 14 51 650 3 1 2 1 RuvB样解旋酶 2
39 DOP1_YEAST 13 195 648 4 1 2 1 迟钝相关蛋白质
40 13 SNX3_CRYNB 34 16 998 2 1 1 1 排序连接蛋白-3
41 KAPR_DEBHA 34 49 729 3 1 1 1 cAMP依赖性蛋白激酶调节亚基
42 PFF1_SCHCM 33 98 364 2 1 1 1 液泡膜蛋白酶
43 13 SAHH_YEAST 26 49 721 2 1 2 1 S-腺苷高半胱氨酸酶
44 NSA2_PHANO 22 29 954 1 1 1 1 核糖体合成的蛋白质 NSA2
45 SIP5_MAGO7 22 87 291 1 1 1 1 蛋白质 SIP5
46 14 SPT6_NEUCR 91 163 328 5 3 2 1 转录延伸因子 SPT-6
47 PHIA_ASPNC 64 19 396 1 1 1 1 细胞壁蛋白质 PHIA
48 SEC31_SCHPO 37 133 044 1 1 1 1 蛋白质转运蛋白 sec31
49 LYS_ARTBC 34 25 319 2 1 1 1 N,O-二乙酰溶菌酶
50 OMA1_SCHPO 27 38 928 2 1 2 1 线粒体金属肽链内断酶 OMA1
51 YG4I_YEAST 23 45 471 2 1 2 1 未表征 GTP结合蛋白 YGR210C
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图 2 条带 4 Mascot搜库结果
Fig. 2 Mascot search library results of Strip 4



图 3 过氧化氢酶 B二级质谱图
Fig. 3 MS/MS spectrum of catalase B

续可以从已鉴定的蛋白质中筛选出一些质量浓度较
高、活性较强的蛋白质分子开展结构与功能研究。
另外，项目的实施有利于茯苓发酵液的成分的初步
了解，对开展茯苓发酵液保健饮料的开发利用也具
有良好的指导作用。
3 讨论
鉴于茯苓悠久的历史及其功效，近年来对茯苓
开展了广泛的研究。但茯苓研究主要集中在多糖和
三萜类化合物等次生代谢产物的化学成分及其药理
保健功效上，对茯苓蛋白质的研究很少。有些问题
一直未弄清楚，如茯苓蛋白部分由哪些蛋白质组成、
组成茯苓的各营养成分中蛋白质含量占多少、茯苓
的药理保健功能是否与茯苓蛋白质有关？本课题以
茯苓菌种湘靖 28为实验材料，通过液体发酵培养，
有机酸沉淀、考马斯亮蓝染色、SDS-PAGE 分离、
胶内酶解、质谱分析和搜库鉴定等方法首次对茯苓
发酵液中的蛋白质进行了质谱分析与鉴定，对发酵
液的总蛋白质质量浓度进行了测定。所鉴定的蛋白
质大部分在蛋白库中得分较高，搜库鉴定时所选取
的是茯苓所属的真菌库，因此这些鉴定结果可信度
很高。
众所周知，微生物发酵液蛋白质主要是一些由
菌丝体分泌的且具有生物活性的胞外酶和分泌蛋白
质。这可以从实验鉴定结果得到佐证。课题组最后
从茯苓发酵液中鉴定得到了 51种蛋白质，大部分属
于具有催化活性的酶类。其中以水解酶最多，主要
有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、碱性蛋白酶、糖化酶、
溶菌酶、S-腺苷高半胱氨酸水解酶、天冬氨酸蛋白
酶、核酸内切酶等；另外还包括甘油醛-3-磷酸脱氢
酶、甘露醇脱氢酶、过氧化氢酶、吡咯啉-5-羧酸还
原酶等氧化还原酶；透明质酸合成酶、ATP合成酶、
琥珀酰-CoA连接酶、柠檬酸合成酶等合成酶及丝氨
酸羟甲基转移酶、转醛醇酶、N-末端乙酰转移酶、
胞嘧啶脱氨酶等转移酶。
现就鉴定的几种主要的酶归类并简介如下：第
一类为具有保健功能的酶类，包括过氧化氢酶和溶
G V D F T E D P L L Q G R
y9 y8 y7 y6 y5 y3 y2
b3 b7 b10 b11
y(2)
y(3)
y(5)
y(6)
y(7)
y(8)
y(9)
b(3)
b(7) b(10)
b0(11)
b(11)
200 400 600 800 1 000 1 200
m/z
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菌酶。① 过氧化氢酶（catalase）是一类广泛存在
于动植物及需氧微生物体内的末端氧化还原酶，主
要功能是催化 H2O2 发生歧化反应生成水和氧气，
清除体内的 H2O2，从而使细胞免于遭受 H2O2的毒
害，是生物防御体系的关键酶之一[19]。它在农业、
医药、食品加工、纺织、印染和环保等方面有十分
重要的应用价值[19-21]。② 溶菌酶（lysozyme）是一
种低相对分子质量的糖苷水解酶。这种酶可以分解
微生物的细胞壁，使细菌失去细胞壁的保护并在胞
内高渗透压的作用下破裂死亡，实现杀菌目的。溶
菌酶作为高等有机体的组织及体液中最强大的抗菌
剂之一，是生物机体对抗外源病原菌侵袭的重要防
御因子。它不仅参与机体免疫，同时还有杀菌和维
护机体健康的作用[22]。第二类是与代谢调控有关的
酶类，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、S-腺苷高半胱氨
酸水解酶、丝氨酸羟甲基转移酶和甘露醇脱氢酶。
① 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase，GAPDH）是糖酵解、糖异生和卡尔
文循环途径中的关键酶，参与糖酵解过程中第 1个
ATP的形成，是维持生命活动能量形成的基本酶类
之一[23-24]。② S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosyl
homocysteine hydrolase，AdoHcyase）是生物细胞中
广泛存在的一种蛋白水解酶。其功能主要是催化细
胞 S-腺苷高半胱氨酸可逆水解生成腺苷和高半胱氨
酸。由于该酶具有重要的细胞内甲基循环的代谢调
节作用，在人类、哺乳动物、植物、真菌和原核生
物中已被广泛研究[25-26]。③ 丝氨酸羟甲基转移酶
（serine hydroxymethyltransferase，SHMT）是体外酶
促法制备 L-丝氨酸的关键酶[27]。L-丝氨酸是生糖氨
基酸，由于其处于多条代谢途径，难以从生物体内
直接大量分离，故具有许多重要的生理功能和作用，
在化工、制药、食品、化妆品和生物农药等行业有
着广泛的应用[28]。近年来，由于发现丝氨酸衍生物
具有抗癌功效[29]，使得其需求量日益增大，是市场
上价格最昂贵的氨基酸之一。④ 甘露醇脱氢酶
（mannitol dehydrogenase，MTD）是植物、细菌和
动物体内合成甘露醇的关键酶。由于甘露醇具有特
殊的物理和化学性质，因此在食品、医药和化工等
行业有着广泛应用[30]。第三类为重要的工业用酶，
主要有碱性蛋白酶和糖化酶。① 碱性蛋白酶
（alkaline protease）是一类广泛存在于动植物及微生
物中，在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类。它是
一类非常重要的工业用酶，在食品、洗涤及制革等
行 业 中 有 着 广 泛 的 用 途 [31-33] 。 ② 糖 化 酶
（glucoamylase）是由一系列微生物分泌的，具有外
切酶活性的胞外酶。糖化酶作为生产燃料乙醇必须
的生物催化剂，是世界上应用范围最广、最重要的
工业酶制剂之一[34]。第四类为细胞信号分子，主要
是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。丝氨酸/苏氨酸蛋白激
酶（serine/threonine protein kinase）是最重要的一类
蛋白激酶，通过催化多种功能蛋白的磷酸化，从而
调节细胞多种生命活动过程[35-37]。综上所述，茯苓
发酵液中蛋白质种类丰富，所鉴定的很多酶在制药
和食品等领域应用广泛，这有利于茯苓发酵液的药
理研究和作为食品保健饮料的开发与利用。
后续可以开展以下工作：首先，可以对茯苓发
酵液中的蛋白质进行分离纯化，选取一些含量较高、
活性较强的成分进行深入系统的研究。其次，本课
题对提取的茯苓蛋白质只进行了 SDS-PAGE分离，
后续可以在此基础上进行双向凝胶电泳实验，所鉴
定的蛋白质种类可能会比现有鉴定的种类更多。最
后，测定得到发酵液中蛋白质的质量浓度为 74.01
μg/mL，其量较低，可以展开菌种育种的相关研究，
采用一些相关的方法提高茯苓菌种产酶的能力从而
提高发酵液中蛋白质的质量浓度。
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