全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 4 期 2013 年 2 月

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• 药材与资源 •
多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响
李晓灿，詹亚光，王晓东，刘英甜，李 丹，荣令珍，范桂枝*
东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040
摘 要：目的 分析外源多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响。方法 在白桦悬浮细胞的生长末期添加 0.1 mmol/L
和 1.0 mmol/L 的腐胺（Put）、精胺（Spm）和亚精胺（Spd），采用比色法和 RT-PCR 方法分析白桦三萜量及其合成关键酶羽
扇豆醇合酶（LUS）基因的表达。结果 除 1.0 mmol/L Spm 处理使白桦悬浮细胞的活力和干质量积累降低外，其他处理均
提高了白桦悬浮细胞的活力、干质量积累和三萜产量，且随着处理时间的延长，干质量积累和三萜产量呈增加趋势。其中
1.0 mmol/L Put 在处理的第 2 天对细胞干质量和三萜产量的促进效应最大，分别比对照增加了 38.89%和 116.35%。LUS 基因
的 RT-PCR 检测结果进一步证实了多胺对白桦三萜积累的促进作用。结论 Put 可有效促进白桦悬浮细胞生长和三萜积累。
关键词：白桦；悬浮细胞；三萜；多胺；羽扇豆醇合酶
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)04 - 0463 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.04.018
Effect of polyamine on growth of Betula platyphylla suspension cells
and triterpenoid accumulation
LI Xiao-can, ZHAN Ya-guang, WANG Xiao-dong, LIU Ying-tian, LI Dan, RONG Ling-zhen, FAN Gui-zhi
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Objective To analyze the effect of exogenous polyamine on the growth of Betula platyphylla suspension cells and
triterpenoid accumulation. Methods At the end of the growth stage, 0.1 mmol/L and 1.0 mmol/L putrescine (Put), spermine (Spm),
and spermidine (Spd) were added to the suspension cells of B. platyphylla, the triterpenoid content and gene expression of lupeol
synthase (LUS) related to the synthesis of triterpenoid were analyzed by chemical colorimetry and RT-PCR, respectively. Results
Except for the treatment with 1.0 mmol/L Spm, the cell viability, dry weight, and triterpenoid production in B. platyphylla suspension
cells induced by Put and Spd were increased, and the dry weight and triterpenoid production of B. platyphylla cells were increasing with
the extension of polyamine treatment time. Among them, dry weight and triterpenoid production were the highest after 2 d Put
induction, which were 38.89% and 116.35% higher than those in the control, respectively. Triterpenoid production in B. platyphylla
cells induced by polyamine was further confirmed by RT-PCR of LUS gene. Conclusion Put could effectively enhance the growth of
B. platyphylla suspension cells and triterpenoid accumulation.
Key words: Betula platyphylla Suk.; suspension cell; triterpenoid; polyamine; lupeol synthase

近年来，利用植物离体培养技术生产有用次生
代谢物质的研究取得了很大进展，如紫草细胞培养
生产紫草素、人参细胞培养生产皂苷、洋地黄细胞
培养生产生物碱等均达到了工业化生产规模，用长
春花细胞培养生产抗癌生物碱已达中试水平[1-3]。然
而次生代谢物质的低产现象是制约细胞培养生产植
物天然产物技术产业化的核心问题之一，理解和掌
握植物细胞次生代谢调控规律是解决这一问题的基
础。虽然，国内外研究者针对植物培养细胞中次生
代谢物质低产问题进行了研究，包括优质细胞系选
育、培养条件优化、培养技术改进及次生物质合成
关键酶基因克隆等[4-7]。但到目前为止，植物细胞次
生代谢物质的低产问题仍未得到很好解决。
诱导子是可以迅速、专一和选择性地诱导植物
多种特定基因表达的物质，如茉莉酸诱导子使金银
花细胞中齐墩果酸增加了 9.4 倍[8]，真菌诱导子使

收稿日期：2012-07-09
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31100445，31070531）；中央高校基本科研业务专项资金项目（DL12CA05）；黑龙江省博士后科研启动金（415288）
作者简介：李晓灿，博士，现从事植物细胞工程领域的研究。E-mail: gzf325@126.com
*通信作者 范桂枝 Tel: (0451)82191752 E-mail: gzf325@126.com
网络出版时间：2013-01-16 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130116.1026.004.html
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亚麻细胞中足叶草毒素量增加了 7 倍[9]。为此，诱
导子被认为是提高植物次生代谢物质产量最有效的
方法之一。但是，大部分诱导子在促进目的次生代
谢物质合成的同时，却不同程度地抑制了细胞生长，
最终导致次生代谢物质产量的提高程度仍不能满足
生产需求。如能找到同时促进细胞生长和次生代谢
物质积累的诱导子，将有助于解决植物细胞培养生
产次生代谢物质低产的问题。
本课题组的前期研究表明，具有药用价值的白
桦三萜类物质可以在白桦愈伤组织中积累[10-12]，但
其量极低。本研究将腐胺（Put）、亚精胺（Spd）、
精胺（Spm）添加到白桦悬浮细胞培养体系中，分
析多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响，以
期找到既能促进细胞生长又能促进次生代谢物质积
累的诱导子。
1 材料与仪器
白桦 Betula platyphylla Suk. 母树取自东北林
业大学白桦强化种子园 5～7 年生嫁接优树（接穗
30 年生），外植体取自其诱导的组培苗，由东北林
业大学生命科学学院詹亚光鉴定。HY—6A 双层振
荡器，UV—2800 紫外分光光度计，PE 公司 2400
型 PCR 仪。
2 方法
2.1 白桦悬浮细胞制备
用白桦组培苗茎段进行愈伤组织诱导，使用NT
固体培养基，其中包括 0.1 mg/L 6-BA、0.01 mg/L
TDZ、20 g/L 蔗糖、5.3 g/L 琼脂，pH 6.0～6.5。每
20～25 d 继代 1 次，多次继代后将松散愈伤组织接
入不加琼脂的 NT 液体培养基中悬浮培养，250 mL
摇瓶中盛有 90 mL 培养液，pH 5.5～6.0，每瓶接种
4 g 鲜质量的愈伤组织，每隔 15 d 继代 1 次，培养
温度为 25～27 ℃，光照强度为 2 000 lx，每天光照
16 h，摇床转速为 120 r/min。
2.2 外源多胺的添加
在白桦悬浮细胞培养的第 8 天，分别加入 0.1、
1.0 mmol/L 的 Put、Spd、Spm，以加入等体积无菌
水作对照。在处理后第 1、2、4、8 天取样测定细胞
活力、干质量和三萜量。
2.3 细胞活力的测定
取白桦悬浮细胞鲜样 0.20 g，加入 2.5 mL 现配
的 0.4%氯化三苯四氮唑（TTC），再加入 2.5 mL PBS
缓冲液（pH 7.0），常温下暗处理 14 h。去除上清溶
液，用 5 mL 蒸馏水清洗细胞，待细胞沉淀静止后，
吸去上清再次洗涤细胞，共重复 3 次。用 5 mL 95%
乙醇脱色处理，于 60 ℃水浴 30 min，每隔 5 min
轻晃倒置试管摇匀。待细胞沉淀后用紫外分光光度
计测定上清溶液的吸光度（A）值，即代表细胞活
力，A 值大则细胞活力强[13]。
2.4 三萜的提取与测定
三萜的提取采用超声波醇提法，利用紫外分光光
度计法测定其量[12]。将白桦悬浮细胞烘干至恒质量
后，研磨成粉末状，每样品称量 0.05 g 加入 2 mL 95%
乙醇浸提过夜，重复提取 3 次，将提取液混合。于 70
℃水浴 1 h，超声（10 kHz）提取 40 min，静置沉淀
后滤过，取上清溶液蒸干，并加入 2 mL 醋酸乙酯复
溶，得待测样品。测定时，取样品 100～200 μL，置
于 70 ℃水浴，待样品蒸发完全后，加入 200 μL 5%
香草醛-冰醋酸混合液（现用现配）和 800 μL 高氯酸，
继续 70 ℃水浴反应 15 min，反应结束后迅速冷却，
醋酸乙酯定容到 5 mL，混合均匀。空白对照加入同
样试剂。以紫外分光光度计 551 nm 处测定 A 值。
用白桦酯醇对照品制作标准曲线，回归方程为
Y＝0.087 1 X＋0.000 2，r 为 0.999 3。白桦脂醇在
0.02～0.10 mg 具有良好的线性关系。
2.5 LUS 基因的表达分析
2.5.1 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 采用
Tris-CTAB法[14]提取白桦悬浮细胞的RNA，用AMV
反转录酶（大连 TaKaRa 公司）合成 cDNA 第一链。
2.5.2 半定量 RT-PCR 分析 LUS 的引物参照文献方
法 [14]，其正向引物为 TTGAAGACGTGCAAGAA-
CCTG，反向引物为CATCAATGAGGGATAACAAGG，
以白桦组成型表达的 Tubulin 基因为内参（正向引物
TCAACCGCCTTGTCTCTCAGG，反向引物 TGGC-
TCGAATGCACTGTTGG）。PCR 反应条件为 94 ℃、3
min；94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、50 s，35 个循
环；72 ℃、7 min；4 ℃保存。
3 结果与分析
3.1 外源多胺对白桦悬浮细胞活力的影响
将 0.1、1.0 mmol/L 的 Put、Spm 和 Spd 分别
添加到培养 8 d 的白桦悬浮培养体系中，TTC 法
分析多胺处理对白桦细胞活力的影响。研究发
现，在多胺处理的 1～8 d 内，除 1 mmol/L Spm
使白桦细胞活力降低 11.97%～80.32%外，外源
多胺处理均不同程度提高了白桦悬浮细胞活力
（图 1）。其中，0.1 mmol/L Spm 处理的白桦悬浮
细胞，在处理后第 1 天达最大值，比对照增加了
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40.50%；同样，0.1、1.0 mmol/L Spd 也在处理的
第 1 天达最大值，分别比对照增加了 25.77%和
27.39%；而 0.1、1.0 mmol/L Put 在处理的第 8 天
达最大值，分别比对照增加了 26.22%和 80.50%。

图 1 外源多胺对白桦悬浮细胞活力的影响
Fig. 1 Effect of exogenous polyamine on cell viability
of B. platyphylla suspension cells
由此可知，多胺对白桦细胞活力的影响存在种类
和浓度效应，其中 Put 的促进效应最大。
3.2 外源多胺对白桦悬浮细胞干质量和三萜积累
的影响
0.1、1.0 mmol/L Put、Spm 和 Spd 处理 1～8 d
后，白桦悬浮细胞干质量、三萜量和产量（三萜产
量＝三萜量×干质量）的变化见表 1。外源多胺对
白桦悬浮细胞干质量的积累趋势与细胞活力变化基
本相同，除 1.0 mmol/L Spm 处理使三萜量和三萜产
量降低了外，其余处理均不同程度促进了干质量的
积累，且随处理时间延长，干质量积累呈增加趋势。
其中，0.1、1.0 mmol/L Put 在处理第 2 天增幅最大，
分别比对照增加了 17.28%和 38.89%。
3 种多胺均不同程度的促进了三萜的合成。其
中，1.0 mmol/L Spd 在处理第 1 天达最高值，比对
照增加了 61.01%；0.1 mmol/L Spm，0.1 mmol/L Spd，
表 1 多胺对白桦悬浮细胞干质量和三萜合成的影响
Table 1 Effect of polyamine on dry weight and triterpenoid synthesis of B. platyphylla suspension cells
处理 处理时间 / d 处理方法 干质量 / (g·L−1) 三萜量 / (mg·g−1) 三萜产量 / (mg·L−1)
1 1 CK 1.68±0.22 8.24±0.24 13.87±0.41
2 1 0.1 mmol·L−1 Spm 1.52±0.07 9.84±0.24 14.99±0.37
3 1 1.0 mmol·L−1 Spm 1.15±0.10 10.35±0.21 11.97±0.25
4 1 0.1 mmol·L−1 Spd 1.64±0.21 10.32±0.26 17.02±0.43
5 1 1.0 mmol·L−1 Spd 1.45±0.24 13.26±0.14 19.30±0.21
6 1 0.1 mmol·L−1 Put 1.74±0.05 11.83±0.07 20.64±0.13
7 1 1.0 mmol·L−1 Put 1.87±0.26 12.10±0.30 22.73±0.57
8 2 CK 1.62±0.18 7.62±0.23 12.35±0.38
9 2 0.1 mmol·L−1 Spm 2.10±0.26 9.18±0.19 19.35±0.39
10 2 1.0 mmol·L−1 Spm 1.21±0.13 8.68±0.16 10.50±0.20
11 2 0.1 mmol·L−1 Spd 1.62±0.03 9.82±0.08 15.93±1.31
12 2 1.0 mmol·L−1 Spd 1.94±0.03 9.28±0.21 18.03±0.40
13 2 0.1 mmol·L−1 Put 1.90±0.28 11.32±0.15 21.51±0.33
14 2 1.0 mmol·L−1 Put 2.25±0.28 11.87±0.17 26.71±0.34
15 4 CK 2.00±0.04 10.66±0.15 21.32±0.30
16 4 0.1 mmol·L−1 Spm 1.98±0.06 11.92±0.09 23.70±1.82
17 4 1.0 mmol·L−1 Spm 1.03±0.11 10.46±0.19 10.78±1.99
18 4 0.1 mmol·L−1 Spd 2.08±0.18 13.23±0.20 27.56±1.62
19 4 1.0 mmol·L−1 Spd 1.63±0.04 12.53±0.08 20.55±1.38
20 4 0.1 mmol·L−1 Put 2.13±0.19 12.71±0.12 27.17±2.54
21 4 1.0 mmol·L−1 Put 2.26±0.22 12.76±0.10 28.92±2.22
22 8 CK 3.24±0.26 9.52±0.14 30.92±0.45
23 8 0.1 mmol·L−1 Spm 3.43±0.07 8.71±0.32 29.92±1.11
24 8 1.0 mmol·L−1 Spm 1.29±0.07 13.09±0.12 16.98±1.54
25 8 0.1 mmol·L−1 Spd 3.28±0.14 11.01±0.17 36.16±0.54
26 8 1.0 mmol/L Spd 3.13±0.06 10.35±0.23 32.51±0.73
27 8 0.1 mmol/L Put 3.54±0.21 9.13±0.15 32.38±0.53
28 8 1.0 mmol/L Put 3.28±0.48 10.21±0.06 33.57±1.95

0.1 mmol·L−1 Spd
CK 0.1 mmol·L−1 Spm 1.0 mmol·L−1 Spm
1.0 mmol·L−1 Spd 0.1 mmol·L−1 Put
1.0 mmol·L−1 Put
1 2 4 8
1.8
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0
A
值

t / d
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0.1、1.0 mmol/L Put 在处理第 2 天达最高值，分别
比对照增加了 20.46%、28.86%、48.56%；同样，在
多胺处理后第 2 天达最大值。其中，0.1、1.0 mmol/L
Put 在处理第 2 天增幅最大，分别比对照增加了
74.23%和 116.35%。
3.3 外源多胺对 LUS 基因表达的影响
结果显示，外源多胺在处理 2 d 后三萜积累量
达最大值。白桦悬浮细胞三萜的主要成分之一为白
桦酯醇，其合成关键酶羽扇醇合酶的基因 LUS 已被
克隆。为进一步从转录水平验证外源多胺对白桦三
萜合成的影响，本课题组利用 RT-PCR 方法分析了
外源多胺对 LUS 基因表达的影响。研究发现，LUS
基因表达对多胺的响应趋势与三萜积累相同（图
2），其中，1.0 mmol/L Spd 和 1.0 mmol/L Put 促进
效应最大，分别比对照增加了 50.03%和 35.71%。

图 2 外源多胺对 LUS 基因表达的影响
Fig. 2 Effect of exogenous polyamine on LUS gene expression
4 讨论
多胺（polyamines，PAs）是生物代谢过程中
产生的一类具有生物活性的低相对分子质量脂肪
族含氮碱，是 Put、Spd、Spm 和尸胺（Cad）的总
称，广泛存在于生物有机体中。PAs 作为一种生理
活性物质，与植物的生长发育、形态建成和胁迫响
应关系密切[15-16]。许多研究表明，适当浓度的多胺
能促进细胞及组织生长[17-19]。本研究也发现，除 1.0
mmol/L Spm 处理外，Put 和 Spd 均促进了白桦细胞
干质量增加。进一步分析 PAs 对白桦悬浮细胞活力
的影响发现，Put 和 Spd 处理增加了白桦悬浮细胞活
力，1.0 mmol/L Spm 处理却降低了白桦悬浮细胞活
力。由此初步推断，Put 和 Spd 处理后白桦悬浮细胞
干质量积累的增加可能是由于其细胞活力增加所致。
PAs 和次生代谢物质积累均是植物逆境下的表
征，二者是否有关联呢？研究发现，外源 Spd 和 Put
显著提高了甜菜毛状根中甜菜素产量[17]，外源 Spm
显著增加了利马豆中挥发性萜类物质[18]。本实验的
研究结果也显示，外源 Put、Spm 和 Spd 均能促进
白桦悬浮细胞中三萜的合成，其中 1.0 mmol/L Put
促进效果最佳，在诱导后第 2 天三萜量比对照增加
了 55.77%，三萜产量增加了 116.35%。同时，从转
录水平进一步证实了 PAs 对白桦三萜积累的促进效
应。由此可知，外源 PAs 可促进植物次生代谢物质
的积累，且此促进存在种类和浓度效应。
综上所述，外源 PAs 可促进白桦悬浮细胞生长
和三萜积累，是同时促进细胞生长和次生代谢物积
累的多胺诱导子，从而为有效解决植物细胞培养生
产次生代谢物质的低产问题提供了思路，下一步将
深入研究 Put 促进三萜积累的机制。
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LUS
Tubuim
0.1 1.0 0.1 1.0 0.1 1.0 CK
Spd Spm Put
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
处理浓度 / (mmol·L−1)
相
对
表
达
量

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