全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 23 期 2014 年 12 月

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利用 DNA 条形码检验中药制剂中的羚羊角药材
张龙霏 1，陈绍民 2，田景振 1，张永清 1*
1. 山东中医药大学，山东 济南 250355
2. 山东省食品药品监督管理局，山东 济南 250011
摘 要：目的 研究以线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 I（COI）基因作为 DNA 条形码检验中药制剂中羚羊角的可行性。
方法 以不同厂家生产的 8 种含羚羊角中药制剂为材料，经充分研磨后，采用 DNA 提取试剂盒提取样品中 DNA，以引物
LCO1490 和 HCO2198 或特异性引物 0703 扩增线粒体 COI 基因片段序列，PCR 产物直接双向测序，将测序结果在 GenBank
中进行 BLAST 比对，并以 DNAMAN 和 MEGA5.2 软件构建同源树和 NJ 树，以赛加羚羊（gb|JN632700.1）和羚羊角标准
药材序列为对照，判定制剂中羚羊角的真实性，并以 Kimura-2-parameter 模型计算种内、种间遗传距离。结果 8 种中药制
剂中羚羊角的 COI 基因序列长度均为 658 bp，在同源树和 NJ 树中可与赛加羚羊和羚羊角标准药材聚成一支，并与 outgroup
完全分开。种内遗传距离为 0～0.064，平均遗传距离为 0.020，种间遗传距离为 0.167～0.195。结论 以线粒体 COI 基因作
为 DNA 条形码检验中药制剂中羚羊角方法是可行的，但因羚羊其他器官也含有相同基因，为保证检验结果的准确性，还需
配合使用其他检验方法。
关键词：羚羊角；细胞色素 C 氧化酶亚基 I；DNA 条形码；中药制剂；PCR 扩增
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)23 - 3467 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.23.021
Identification of Saigae Tataricae Cornu in Chinese materia medica preparation
using DNA barcoding
ZHANG Long-fei1, CHEN Shao-min2, TIAN Jing-zhen1, ZHANG Yong-qing1
1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China
2. Shandong Food and Drug Administration, Jinan 250011, China
Abstract: Objective To discuss the feasibility of using partial sequence of mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene as
DNA barcoding to identify Saigae Tataricae Cornu (STC) in Chinese materia medica (CMM) preparation. Methods The DNA
barcoding identification was constructed in STC samples from eight different manufactories. The genome DNA was extracted by DNA
extraction kit from adequately ground samples. The COI nucleotide sequences were PCR amplified with the Primers LCO1490 and
HC02198 or specified primer 0703 and sequenced bi-directionally. The BLAST comparison was made in GeneBank, and the
phylogenetic trees were constructed with the homologisation tree (DNAMAN) and Neighbor-Joining (NJ, MEGA 5.2) method. Saiga
tatarica (gb|JN632700.1) and STC were selected as reference medicinal materials and the genetic distance was calculated using
Kimura-2-parameter. Results The lengths of partial mitochondrial COI gene collected from STC in eight samples of CMM preparation
were about 658 bp. The phylogenetic tree showed that the samples of CMM preparation and reference substance assembled distinctly, and
were completely separated from the outgroup. The intraspecific genetic distances of these samples ranged in 0—0.064 with an average of
0.020, and the interspecific genetic distances ranged in 0.167—0.195. Conclusion The mitochondrial COI gene is a valid DNA barcoding
gene for STC identification in CMM preparation. But other organs in antelope also contain the same gene. In order to ensure the accuracy
of the results, other texst methods also need to be used cooperatively.
Key words: Saigae Tataricae Cornu; cytochrome C oxidase subunit I; DNA barcoding; Chinese material medica; preparation; PCR amplification

收稿日期：2014-04-09
基金项目：山东省自主创新专项（2013CXC20401）
作者简介：张龙霏（1988—），女，中药学硕士，讲师，从事中药质量分析研究。E-mail: zlfelf@126.com
*通信作者 张永清（1962—），男，山东平邑人，理学博士，教授，博士生导师，从事中药资源及其质量控制研究。E-mail: zyq622003@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 23 期 2014 年 12 月

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羚羊角 Saigae Tataricae Cornu 为牛科动物赛加
羚羊 Saiga tatarica Linnaeus 的角，属于名贵中药材，
性寒，味咸，归肝、心经，可平肝熄风、清肝明目、
散血解毒，主治肝风内动、惊痫抽搐、妊娠子痫、
高热痉厥、癫痫发狂、头痛眩晕、目赤翳障、温毒
发斑、痈肿疮毒等症[1]，其临床疗效卓著，在小儿
高热等危重病症治疗中发挥着重要作用。由于野生
资源逐年减少，赛加羚羊已被世界自然保护联盟
（IUCN）列入了世界濒危动物红色名录，且标注为
极濒危类目[2]。在资源减少、货源短缺、市场价格
居高不下的情况下，加强中药制剂中羚羊角药材的
检测尤为重要。目前，《中国药典》2010 年版检测
中药制剂是否含有羚羊角的方法，一是显微观察，
二是薄层色谱，二者操作复杂，且结果受仪器和操
作者的影响较大，因此寻找一种简便快捷、准确性
高的检测方法非常有必要。DNA 条形码（DNA
barcoding）作为一种现代生物技术，是以 DNA 为
基础的系统分类新方法之一，能够弥补传统形态学
鉴定的某些局限，有效实现少量甚至微量样品中物
种的鉴定[3-4]，并迅速在动植物甚至微生物领域发挥
了卓越作用[5-10]，引起了国内外极大的关注和愈发
深入的研究。目前国内外尚无以 DNA 条形码方法
检识中药制剂中羚羊角的相关报道，本实验将该技
术应用于中药制剂中羚羊角的检测，旨在为提高中
药制剂质量控制技术水平提供新的思路与方法。
1 仪器设备、试剂与材料
1.1 仪器设备
DNA 样品粉碎研磨仪（Retsch，MM400，德国），
水浴锅（上海申光，双列四孔，中国），梯度 PCR
扩增仪（Eppendorf，Mastercycler gradient，德国），
离心机（Thermo，LEGEND MICRO 21，美国），移
液器（Thermo，Scientific Finnpipette F1，美国），
电泳仪（BIO-RAD，Power pac 300，美国），紫外
凝胶成像仪（Syngene，英国），ABI 3730XL 测序仪
（Applied Biosystems Co.，美国）。
1.2 试剂
血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒
（Tian-gen Biotech Co.，中国），2×Taq PCR Master
Mix（Tian-gen Biotech Co.，中国），100 bp DNA
Ladder Marker（Tian-gen Biotech Co.，中国），溴化
乙锭（EB，ethidium bromide）。
1.3 材料
羚羊角标准药材，编号 LYBZ01YP（简称 YP），
中国食品药品检定研究院，批号 1064-0301；羚羊
角粉，编号 LYDP01LA（简称 LA），山东嘉泰中药
饮片公司生产，批号 121102，经山东中医药大学周
凤琴教授鉴定为羚羊角 Saigae Tataricae Cornu 粉
末；羚羊清肺散，编号 LYZJ01AA（简称 AA），哈
尔滨儿童制药有限公司生产，批号 110201；复方西
羚解毒片，编号 LYZJ01AB（简称 AB），山东宏济
堂制药集团有限公司生产，批号 121010；羚羊感冒
片，编号 LYZJ01AC（简称 AC），北京同仁堂科技
发展股份有限公司生产，批号 1120665；奇特羚羊
清肺丸，编号 LYZJ01AD（简称 AD），赤峰天奇制
药有限责任公司生产，批号 20120408；羚羊角颗粒，
编号 LYZJ01AE（简称 AE），吉林省健今药业股份
有限公司生产，批号 20120805；金羚感冒片，编号
LYZJ01AF（简称 AF），山东润华药业有限公司生
产，批号 121008；小儿七珍丸，编号 LYZJ01AG（简
称 AG），山西双人药业有限责任公司生产，批号
121104。以上除羚羊角标准药材购自山东省食品药
品检验所外，其他样品均购自济南漱玉平民大药房
有限公司。
2 方法
2.1 DNA 提取
各样品先以研钵研碎（糖衣片须先去糖衣），再
以 DNA 样品粉碎研磨仪研磨 2 min（30 次/s），必
要时可重复研磨 2 min。研磨后，称取一定量，羚
羊角对照品与羚羊角粉 20～25 mg，其他制剂 30～
35 mg，每样品重复 5 次。采用 DNA 提取试剂盒进
行提取，在每份称量好的样品中加缓冲液 200 μL，
振荡至彻底悬浮，然后加入蛋白酶 K（Proteinase K）
20 μL，56 ℃水浴 8 h 或过夜（水浴过程中颠倒离
心管数次以混匀样品）；简短离心后加缓冲液 200
μL，70 ℃水浴 10 min；加无水乙醇 200 μL，充分振
荡 15 s；将所得溶液及絮状沉淀完全转移至吸附柱
中，12 000 r/min 离心 30 s；加缓冲液 500 μL，12 000
r/min 离心 30 s，弃废液；加入漂洗液 700 μL，12 000
r/min 离心 30 s，弃废液；再次加入漂洗液 700 μL，
12 000 r/min 离心 30 s，弃废液；12 000 r/min 空离
30 s，弃废液，室温放置 15 min；将吸附柱和所得
产物转移至干净离心管中，于吸附柱上悬空滴加洗
脱缓冲液 70 μL，室温放置 2～5 min，12 000 r/min
离心 2 min；收集离心得到的试液，并将收集到的
试液悬空滴加至吸附柱，室温放置 2～5 min，12 000
r/min 离心 2 min，以提高 DNA 得率。最后离心得
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到的试液即为所需的样品 DNA，弃置吸附柱，编号
后于−20 ℃冻存。
2.2 PCR 扩增
参考陈士林[11]方法。采用 25 μL PCR 反应体系：
样品 DNA 模板 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5
μL，正反向引物（COI：LCO1490、HCO2198；设
计引物：0703-01、0703-02）分别 1 μL，ddH2O 8.5
μL，以封口膜封盖体系后进行 PCR 扩增。PCR 反
应条件为 COI 体系：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变
性 1 min，45 ℃退火 1.5 min，72 ℃延伸 1.5 min，
5 个循环；94 ℃变性 1 min，50 ℃退火 1.5 min，
72 ℃延伸 1 min，35 个循环；72 ℃再延伸 5 min，
4 ℃保存。设计引物体系：94 ℃预变性 5 min，94
℃变性 1 min，53 ℃退火 1.5 min，72 ℃延伸 1.5
min，40 个循环，72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。所
用引物均由北京六合华大基因合成，见表 1。
表 1 引物序列信息
Table 1 Primer sequence information
引物名称 序列信息
正向 LCO1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
反向 HCO2198 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’
正向 0703-01 5’-AATCAAACCCCTGTTCTTAG-3’
反向 0703-02 5’-TGATGTAAAGTAGGCTCGTG-3’

其中，COI 引物为动物 DNA 提取通用引物，
0703 为混合动物样品条件下专属性较强的特异性
引物，以 Primer5.0 在赛加羚羊线粒体全基因组
（gb|JN632700.1）中寻找 COI 序列设计并经验证。
必要时可将 PCR 产物作为 DNA 模板重复进行 PCR
扩增程序，以提高样品浓度。PCR 扩增产物经 1%
琼脂糖 EB 凝胶电泳检测，其长度用 100 bp DNA
Ladder Marker 确定，有单一明亮条带的样品送北京
六合华大基因科技股份有限公司青岛测序部进行纯
化和双向测序。
2.3 序列比对
测序信息返回后，采用 CodonCode Aligner
V2.06 对所得峰图进行处理，将同一样品的 5 个序
列数据拼接并校正，去除引物及低质量区域，每个
样品均获得长度为 658 bp 的单一序列，且各序列均
已上传至美国国立生物技术信息中心（简称
NCBI），GenBank 登录号为 KF735178～KF735210。
在采用 DNA 条形码鉴定物种时，一般采用相
似 性 搜 索 法 BLAST-Based Method 、 距 离 法
Distance-Based Method 及 建 树 法 Tree-Based
Method[12-13]，此外还有学者提出了 PCI（probability
of correct identification）[14]等方法。本实验采用了
相似性搜索法和建树法 2 种方法。
3 结果与分析
将各样品序列与赛加羚羊基因组的 BLAST
进行比对，结果显示，羚羊角标准药材及 8 个中
药制剂样品 DNA 提取物与赛加羚羊线粒体全基
因组（gb|JN632700.1）高度相似，相似度均达
到 98%以上，说明上述中药制剂中均含有赛加羚
羊 DNA 组分，提示所用羚羊角为正品羚羊角。
只有 AD 的相似度较低，仅为 96%，因此不能排
除后者有采用赛加羚羊近缘种的角作为原料的
可能。为深入研究样品 AD 所用羚羊角与赛加羚
羊之间的亲缘关系，本课题组进行了进一步的数
据处理和分析。
采用 DNAMAN 对上述样品序列进行多序列比
对并建树（同源树），因赛加羚羊是高鼻羚羊属中的
唯一种，因而选择以同科近缘种灰小羚羊 Sylvicapra
grimmia（Huiling，gb|HQ644119.1）作为 outgroup
进行对照，结果见图 1。
图 1 结果显示，各样品序列和 GenBank 中下载
的赛加羚羊序列能与 outgroup 完全分开并聚类成为
一支，且支持率均≥70%，因此基本可以认定各样
品均含有赛加羚羊 DNA 组分。各样品序列存在微
小差异，可能与赛加羚羊因生活环境不同而导致的
基因突变有关，其中 AD 与其他样品在进化距离上
存在一定差异的原因尚需深入探究。

图 1 样品序列同源树图
Fig. 1 Phylogenetic tree of sample sequence
100% 90% 80%
AA
AB
AG
AE
LA
YP
gb|JN632700.1
AC
AF
AD
Huiling
相似度
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另通过 MEGA5.2 建 NJ 树（Neighbor-Joining
Tree，bootstrap 1 000 次重复）得到相同结果，并能
显示更高精度的图像，可以观察到更全面的各样品
序列差异程度，见图 2。

图 2 样品序列 NJ 树
Fig. 2 NJ tree of sample sequence
在 MEGA5.2 中，采用 Kimura-2-parameter 模
型计算各样品序列间的遗传距离发现，各样品序
列中种内遗传距离为 0～0.064，平均遗传距离为
0.020，种间遗传距离为 0.167～0.195。可用于物种
检验的理想 DNA 条形码应当具有足够小的种内变
异，同时具有明显的种间变异，见表 2。结果显示，
各序列数据中种间最小变异明显大于种内最大变
异，因此，基于 COI 序列的 Kimura-2-parameter 模
型可以用来检验中药制剂中的羚羊角。
4 讨论
羚羊角在中药制剂中多以原药材粉碎配方入
药，除药典中规定的显微鉴别和薄层鉴别是其主要
检测方法外[15-19]，还有蛋白电泳法[20]。显微鉴别主
表 2 序列距离矩阵分析表
Table 2 Distance-matrix analysis of each sequence
编号 AA AB AC AD AE AF AG LA YP Huiling JN632700.1
AA 0 — — — — — — — — — —
AB 0.020 0 — — — — — — — — —
AC 0.022 0.020 0 — — — — — — — —
AD 0.059 0.052 0.057 0 — — — — — — —
AE 0.014 0.012 0.011 0.049 0 — — — — — —
AF 0.028 0.027 0.008 0.064 0.019 0 — — — — —
AG 0.020 0.000 0.020 0.052 0.012 0.027 0 — — — —
LA 0.012 0.011 0.009 0.047 0.002 0.017 0.011 0 — — —
YP 0.012 0.011 0.009 0.047 0.002 0.017 0.011 0.000 0 — —
Huiling 0.179 0.179 0.175 0.195 0.169 0.185 0.179 0.167 0.167 0 —
JN632700.1 0.012 0.011 0.009 0.047 0.002 0.017 0.011 0.000 0.000 0.167 0

要是观察是否具有稍有光泽的不规则碎块，并均匀
分布有裂缝状或长圆形空隙等；薄层鉴别是取样品
和羚羊角对照药材，加石油醚加热回流 1.5 h，滤过
并挥去石油醚后加乙醇加热回流，滤过并蒸干，残
渣以乙醇 1 mL 溶解，作为供试品溶液和对照药材
溶液，以薄层色谱检验，于同一硅胶 G 薄层板上以
正丁醇-冰醋酸-水（3∶1∶1）为展开剂，喷以茚三
酮试液，加热至斑点清晰后，观察两者是否在相应
位置显示相同颜色[1]；蛋白电泳中正品羚羊角共有
6 条谱带，与伪品有一定区别。
以上几种方法均存在明显缺点，显微鉴别不仅
对检验人员要求较高，而且羚羊角的显微特征均数
远小于普通中药材，例如只占黄芩显微特征均数的
一半不到[21]；薄层鉴别难以与其他动物角类相区
别，且重复性较差。由于对中药制剂中的羚羊角至
今没有较为完善的检验方法，从而存在着检测漏洞。
DNA 条形码技术用于物种鉴定得到了国际认可和肯
定，但主要集中于植物方面[22-23]，动物类研究较少，
尤其以 DNA 条形码技术检验中药制剂中的动物类
药材目前尚未见报道。本研究证明，以 DNA 条形码
技术检验中药制剂中的动物类药材是可行的，且有
需样量少、简单快速、重复性和稳定性高，且可通
过现代技术平台实现与国际信息的共享等优点。但
是，该技术对以整体动物入药的中药材是适用的，
而对以某一器官入药的动物来讲，若以其他器官代
用则容易导致检验错误，因此在具体工作中仍然需
要配合使用其他方法，才能确保检验结果的准确性。
参考文献
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AC
AF
gb|JN632700.1
YP
AE
LA
AA
AB
AG
AD
Huiling
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