全 文 ：·2042· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月

野百合碱诱导胰腺癌细胞 BxPC-3 呈巨型多倍体化研究
曾军英 1, 2，李胜华 1, 2，伍贤进 1, 2*，丁丹勇 1, 2，刘 婷 1, 2
1. 民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南 怀化 418008
2. 怀化学院 生命科学系，湖南 怀化 418008
摘 要：目的 观察野百合碱体外诱导人胰腺癌细胞株 BxPC-3 形成多倍体巨细胞的作用。方法 BxPC-3 细胞以 1×104/mL
的浓度接种于含野百合碱（0、5、10、20 μg/mL）的 RPMI 1640 培养液内 72 h，Giemsa 染色分析细胞形态，流式细胞术分
析 DNA 量，Annexin V-FITC/PI 双标法流式细胞术观察野百合碱对 BxPC-3 细胞凋亡的诱导作用，染色体展示分析野百合碱
处理后 BxPC-3 多倍体巨细胞的染色体组，Western blotting 检测周期蛋白 Cyclin B1 的表达。结果 Giemsa 染色显示，多倍
体细胞体积大，多核。流式细胞仪检测细胞 DNA 量表明，野百合碱处理 72 h 出现 4N、8N 巨型 BxPC-3 多倍体细胞，诱导
细胞凋亡，下调 Cyclin B1 蛋白表达，并与野百合碱的质量浓度呈依赖关系。染色体展示分析再次证明了巨型多倍体细胞的
形成。结论 野百合碱通过抑制周期蛋白 Cyclin B1 的表达，导致多倍体巨细胞增加，出现 4N、8N 巨型 BxPC-3 多倍体细
胞，促使 BxPC-3 细胞凋亡或死亡。
关键词：野百合碱；胰腺癌细胞；多倍体巨细胞；周期蛋白 Cyclin B1；细胞凋亡
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)14 - 2042 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.14.016
Effect of monocrotaline on induction of pancreatic cancer cell BxPC-3 into
polyploid giant cells
ZENG Jun-ying1, 2, LI Sheng-hua1, 2, WU Xian-jin1, 2, DING Dan-yong1, 2, LIU Ting1, 2
1.. Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources, Huaihua 418008, China
2. Department of Life Sciences, Huaihua University, Huaihua 418008, China
Abstract: Objective To observe the effect of monocrotaline (MCT) extract from Crotalaria sessiliflora on inducing human pancreatic
cancer cell BxPC-3 into polyploid giant cells in vitro. Methods BxPC-3 cells (1 × 104/mL) were inoculated with MCT (0, 5, 10, and 20
μg/mL) in RPMI-1640 for 72 h, respectively, then the cell morphology was observed by Giemsa staining, and the DNA content was measured
by flow cytometry; BxPC-3 cells-induced apoptosis was checked by AnnexinV-FITC/PI double staining using flowcytometry, BxPC-3
polyploid giant cell genome was checked by chromosome spreading assay, and Cyclin B1 expression also was analysed by Western blotting.
Results Giemsa staining and DNA content by flow cytometry showed that MCT induced BxPC-3 cell into polyploid giant cells in vitro.
MCT treatment for 72 h appeared 4N, and 8N polyploid giant of BxPC-3 cells, induction of apoptosis, decreased the expression of cyclin B1
in a dose dependent manner. Chromosome analysis demonstrated once again that polyploid giant cell was mainly in 8N. Conclusion
Monocrotaline might exert its antitumor effect by blocking the cell cycle, inducing apoptosis, and down-regulating Cyclin B1 protein.
Key words: monocrotaline; pancreatic cancer cells; polyploid giant cells; Cyclin B1; apoptosis

野百合为蝶形花科（Papilionaceae）猪屎豆属
Crotalaria Linn. 植物野百合 Crotalaria sessiliflora
L. 的干燥全草，别名农吉利、鼠蛋草、响铃草、芝
麻响铃铃、细叶芝麻铃等，其味淡，性平，功能为
清热、利湿、解毒[1]。在我国广泛用于多种疾病的
治疗，主治痢疾、疮疖、耳鸣耳聋、头晕目眩及各
种癌症如皮肤鳞状上皮癌、食管癌、宫颈癌等[2]。
野百合碱（monocrotaline）是野百合主要的活性成
分。胰腺癌恶性程度高、预后差，且发病率近年来
有上升趋势。目前，胰腺癌的早期诊断比较困难，

收稿日期：2013-11-19
基金项目：湖南省省教育厅平台项目（11K052）；湖南省高等学校产业化培育项目（13cy026）；湖南省科技计划项目（2013FJ6090）；民族药
用植物资源研究与利用湖南省重点实验室开放基金项目（HHUW2010-65）；湖南省植物学重点建设学科（20110101）
作者简介：曾军英（1971—），男，博士后，主要从事药用植物活性成分及药理学研究。Tel: (0745)2851037 E-mail: junyingzeng@163.com
*通信作者 伍贤进 Tel: (0745)2851037 E-mail: hhuxianjin@163.com
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确诊时多已是进展期，手术切除率低，化疗、放疗
后仍易复发和转移，胰腺癌患者的平均生存期为 6
个月，位居癌症死亡的第 5 位[3]。BxPC-3 细胞系来
源于低分化胰腺导管腺癌患者，其倍增时间为 54 h，
染色体数目为 59 条（2N），具有转移潜能。本研究
选择人胰腺癌细胞株 BxPC-3 作为研究对象，探讨
野百合碱对胰腺癌的抗肿瘤作用及相关机制。
1 材料
1.1 药品与试剂
野百合碱（monocrotaline，MCT，质量分数≥
98%）购于美国 Sigma 公司，用二甲基亚砜（DMSO）
配成储存液，−20 ℃保存，实验时用 RPMI 1640 培
养液稀释，DMSO 的体积分数小于 0.1%。噻唑蓝
（MTT）、碘化丙锭（PI）购自美国 Sigma 公司；
Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公
司；DMEM 培养液为美国 Gibco 公司产品；胎牛血
清为杭州四季青生物公司产品；培养液 RPMI 1640
购自 Gibco 公司；鼠抗人 Cyclin B1 单克隆抗体、
ECL 化学发光试剂盒购自美国 Santa cruz 公司；羊
抗鼠 HRP-IgG 为 Sigma 公司产品。
1.2 仪器
FACS calibur 流式细胞仪（美国 Becton-
Dickinson 公司）、Thermo 细胞培养箱（美国
Thermo 公司）、Olympus 倒置相差显微镜（日本）、
Thermo Varioskan Flash 型多功能酶标仪（美国
Thermo 公司）。
1.3 细胞
人胰腺癌细胞株 BxPC-3 由德克萨斯理工大学
王明海教授惠赠。
2 方法
2.1 细胞培养
BxPC-3 细胞用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640
培养液，在 37 ℃、5% CO2 和一定湿度的培养箱中
孵育，培养液中含青霉素 100 U/mL、链霉素 100
mg/mL，细胞生长达汇合状态时，0.25%胰蛋白酶
消化后传代。全部实验均采用对数生长期细胞，重
复 3 次实验。
2.2 MTT 法检测细胞增殖
实验分为对照组（RPMI 1640）和不同质量浓度
（5、10、20 μg/mL）野百合碱组。MTT 比色法[4]分
别测定野百合碱作用 24、48、72 h 后 BxPC-3 细胞
的吸光度（A570）值，计算细胞增殖率（增殖率＝
实验组 A570值/对照组 A570 值），每组均重复 3 次。
2.3 Giemsa 染色法观察 BxPC-3 细胞形态
细胞按“2.2”项加样品培养 72 h 后终止培养，
取出盖玻片，0.01 mol/L PBS 洗 5 min，置于分析纯
甲醇中固定 10 min 后取出，挥干甲醇。将吉姆萨
（Giemsa）染液与 pH 7.2 的索伦森氏（Sorensen）磷
酸缓冲液以 1∶9 混合成工作液，加于盖玻片上染色
10～20 min（镜下观察染色程度），待细胞充分显色
后流水冲洗盖玻片，立即进行拍照和图像分析。
2.4 细胞倍性分析
5、10 μg/mL 野百合碱分别处理 BxPC-3 细胞 72
h 后，收集漂浮及贴壁细胞，70%冰乙醇固定后，置
于−20 ℃储存备用。以单纯加入 0.1% DMSO 处理作
为对照组。取出备用的收集细胞，用 PBS 洗涤及离
心后，加入 1 mg/mL RNase A 和 50 μg/mL PI，反应
并染色 30 min，流式细胞仪分析细胞倍性。
2.5 细胞染色体分析
取生长状态良好的细胞，接种于 96 孔细胞培
养板内，细胞随机分为对照组和野百合碱（5、10、
20 μg/mL）组，每组设 3 个重复，培养 72 h 后进行
染色体分析。按常规方法制备染色体标本，于收集
细胞前 2 h 加入秋水仙素（终质量浓度为 0.05
mg/mL），常规方法收集细胞，加入 0.075 mol/L KCl
溶液低渗作用 30 min，离心取沉淀细胞，再用甲醇-
冰醋酸（3∶1）混合液固定 2～3 次，每次 20 min。
取 4 ℃洁净载玻片滴片制备染色体标本，用 Giemsa
染色后于光镜下进行核型及染色体数量分析。
2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
分组、给药与细胞培养时间同“2.4”项，每组
设 5 个复孔。各组收集 BXPC-3 细胞 1×106个，离
心，弃上清，用冷 PBS 洗涤 2 次，按照 Annexin V-
FITC/PI 染色试剂盒说明操作，分别加入缓冲液 185
μL、Annexin V 10 μL、PI 5 μL，混匀，避光 20 min，
离心后弃去上清液，再加入冷 PBS 洗涤 1 次，用 PBS
400 μL 悬浮细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2.7 蛋白表达检测
取生长状态良好的细胞，接种于 60 mm 细胞培
养皿内，细胞随机分为对照组和野百合碱（5、10、
20 μg/mL）组，每组设 3 个重复，培养 72 h 后进行
蛋白表达分析。采用 1% NP40 冰上裂解细胞球 30
min，4 ℃条件下 6 500×g 离心 30 min 提取细胞总
蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。取各组细胞总蛋
白 20 μg 上样，进行 8% SDS-PAGE 分离蛋白，电
转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%脱脂奶粉
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封闭 2 h 后，分别加入一抗 Cyclin B1、β-actin（1∶
1 000），室温反应 2 h，TBST 洗涤后加入相应二抗
再反应 1 h，膜经 TBST 洗涤后与电化学发光检测试
剂反应，X 光胶片压片曝光，显示结果。
2.8 统计学处理
数据以 ±x s 表示，应用 SPSS 16.0 统计软件进
行方差分析。
3 结果
3.1 对 BxPC-3 细胞增殖的抑制作用
5、10、20 μg/mL 野百合碱对 BxPC-3 细胞的增
殖有明显的抑制作用，且抑制作用呈剂量和时间依
赖性，见表 1。
3.2 对 BxPC-3 细胞形态的影响
与对照组比较，5 μg/mL 野百合碱处理 72 h 后
出现了巨型多核细胞，体积是对照组细胞的 10～20
倍，且 20 μg/mL 野百合碱处理后，90%的细胞成巨
型多核细胞，见图 1。
表 1 野百合碱对 BxPC-3 增殖的抑制作用 ( ± = 3x s n, )
Table 1 Inhibition of MCT on proliferation
of BxPC-3 cells ( ± = 3x s n, )
增殖率 / % 组别
ρ /
(μg·mL−1) 24 h 48 h 72 h
对照 — 100.0 100.0 100.0
野百合碱 5 77.2±3.3* 64.4±4.8* 41.5±4.3*
10 70.5±7.1** 52.1±5.4** 27.2±6.4**
20 64.8±7.8** 42.9±4.6** 18.6±5.2**
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group


对照 野百合碱 5 μg·mL−1 野百合碱 10 μg·mL−1 野百合碱 20 μg·mL−1
图 1 二倍体和多倍体 BxPC-3 细胞
Fig. 1 BxPC-3 cells of diploid and polyploid
3.3 对 BxPC-3 细胞倍性的影响
野百合碱诱导 BxPC-3 细胞的结果发现，随
着野百合碱质量浓度的增加，多倍体细胞（4N、
8N）逐渐增加，存在剂量依赖关系（P＜0.05），
见图 2。
3.4 对 BxPC-3 染色体组的影响
根据美国 ATCC 的数据显示，BxPC-3 细胞系
的染色体数目为 59 条（2N）。染色体分析结果表
明，野百合碱诱导 BxPC-3 细胞出现 4N（染色体
数目 118±4）和 8N（染色体数目 236±6），进一
步验证了上述数据的可靠性，见图 3。
3.5 对 BxPC-3 细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI 双标法检测结果显示，不
同质量浓度的野百合碱均可诱导 BxPC-3 细胞凋
亡，凋亡率随野百合碱质量浓度的增加而增大，与
对照组比较差异显著（P＜0.05），且野百合碱不同
质量浓度组间BxPC-3细胞凋亡率比较也有显著差
异（P＜0.05）。结果见图 4。



图 2 流式细胞仪检测野百合碱诱导的 BxPC-3 细胞 DNA 量
Fig. 2 DNA content in MCT-induced BxPC-3 cells analyzed by flow cytometry
2N
2N
2N
4N 4N
8N
8N
4N
0 50 K 100 K 150 K 200 K 250 K
对照 野百合碱
5 μg·mL−1
野百合碱
10 μg·mL−1
0 50 K 100 K 150 K 200 K 250 K 0 50 K 100 K 150 K 200 K 250 K
1 000
800
600
400
200
0
C
ou
nt

C
ou
nt

C
ou
nt

300
200
100
0
250
200
150
100
50
0
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 14 期 2014 年 7 月 ·2045·



2N 4N 8N
图 3 染色体展示检测 BxPC-3 的染色体数目
Fig. 3 Chromosome number of BxPC-3 cells




图 4 经野百合碱处理后 BxPC-3 细胞的凋亡情况
Fig. 4 Induced apoptosis of BxPC-3 by MCT treatment
3.6 对 BxPC-3 细胞 Cyclin B1 蛋白表达的影响
与对照组比较，不同质量浓度的野百合碱作用
于 BxPC-3 细胞 72 h 后 BxPC-3 细胞 Cyclin B1 的蛋
白表达水平下降，差异显著（P＜0.05），且呈剂量
依赖性，见图 5。



对照 5 10 20
野百合碱 / (μg·mL−1)
图 5 野百合碱抑制 BxPC-3 细胞 Cyclin B1 蛋白的表达
Fig. 5 Inhibition of MCT on protein expression
of Cyclin B1 in BxPC-3 cells
4 讨论
野百合碱是从中药野百合中分离得到的单体
化合物。体外和动物实验表明，野百合碱能够抑
制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的
增殖与生长，其作用机制涉及直接杀伤肿瘤细胞、
抑制核酸代谢、抑制肿瘤血管生成、诱导细胞凋
亡、促进细胞分化等诸多方面[2]，目前对于野百
合碱抗肿瘤的作用机制还缺乏深入研究。本研究
探索野百合碱对胰腺癌细胞的增殖抑制作用及其
分子机制，以期为寻找新抗癌药物提供有价值的
信息。
在基因毒性化合物、放射线、应激等 DNA 损
伤情况下，肿瘤细胞往往形成多倍体单核巨细胞和
多核巨细胞，这些巨细胞大部分趋于死亡或凋亡，
促进多倍体细胞形成是控制某些恶性肿瘤进展的
一种途径，但目前对肿瘤巨细胞形成和演变仍存在
很大争议 [5]。本研究表明，应用野百合碱诱导
BxPC-3 细胞多倍体化，在 5～20 μg/mL 随着野百合
碱质量浓度的增加和作用时间的延长，多倍体化细
胞逐渐增加，并且存在着明显的时间和剂量依赖关
系。野百合碱诱导的多倍体 BxPC-3 细胞含有多个
细胞核，而不是分叶核，说明其已发生了核分裂。
实验通过细胞形态学和流式细胞术分析，野百合碱
诱导 BxPC-3 细胞的体积增大，2N 和 4N 细胞逐渐
减少，8N 细胞逐渐增多，也进一步证明了野百合
碱诱导 BxPC-3 细胞巨型多倍体化。野百合碱处理
100 101 102 103 104
104
103
102
101
100
Annexin V
PI
10
4
103
102
101
100
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
FL
2-
H

FL
2-
H

FL
2-
H

FL1-H FL1-H FL1-H
对照 野百合碱 5 μg·mL−1 野百合碱 10 μg·mL−1
Cyclin B1
β-actin
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BxPC-3 细胞后，细胞核分裂，而胞质不分裂，提
示细胞停滞在细胞周期的 G2/M 期。
细胞周期的调控在肿瘤的发生和治疗中有重
要作用[6]。Cyclin B 是作用于 G2/M 期的重要周期
蛋白，可以促进 G2/M 期转换而加速细胞周期进
程。随着正常细胞周期和肿瘤细胞周期的深入研
究，可以认为 Cyclin B 的异常表达与多种肿瘤的
发生、发展相关，是一个极好的肿瘤标志物，对
肿瘤的恶性生物学行为，及肿瘤的预后有意义[7]。
Cyclin B1 在 G2 期表达增加，Cyclin B1 与 p34cdc2
形成激酶复合物，控制细胞由 G2 进入 M 期。本
研究结果显示，野百合碱作用 72 h 后，BxPC-3
细胞 Cyclin B1 蛋白表达下降，提示野百合碱可能
通过降低 Cyclin B1 蛋白表达将细胞阻滞在 G2/M
期，抑制细胞增殖。
野百合碱通过抑制周期蛋白Cyclin B1的表达，
导致多倍体巨细胞增加，出现 4N、8N 巨型 BxPC-3
多倍体细胞，促使 BxPC-3 细胞凋亡或死亡，然而
其具体的作用机制还有待于进一步研究。
参考文献
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