全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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鼓槌石斛特异性 PCR 分子鉴定
郑司浩，黄林芳*，陈士林*
中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 研究能够特异性鉴别鼓槌石斛的 PCR 引物，并优化 PCR 检测体系，确立一种快速、准确鉴别鼓槌石斛的方
法。方法 从 GenBank 数据库中下载石斛属 rDNA ITS 序列 170 余条，运用 MEGA 5.0 对所有序列进行同源性比较，找出各
变异位点，在非保守区设计 1 对特异性引物。对 35 份石斛属植物 DNA 模板进行特异性引物 PCR 扩增，显示阳性者为鼓槌
石斛。结果 将退火温度升至 58 ℃时，鼓槌石斛能被该引物特异性地扩增出来，而其他石斛属植物均为阴性，且该引物的
灵敏度可达到 0.69 ng/μL。结论 建立一种特异性鉴别鼓槌石斛的方法，运用该特异性引物可实现从同源物种中快速、准确
地鉴定出鼓槌石斛，具有特异性好，操作简便、高效、准确等优点。
关键词：鼓槌石斛；特异性；PCR；分子鉴定；石斛属
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)06 - 0744 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.06.021
Specific PCR molecular identification of Dendrobium chrysotoxum
ZHENG Si-hao, HUANG Lin-fang, CHEN Shi-lin
Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To design a pair of PCR primers that could identify Dendrobium chrysotoxum specifically, to optimize the system
of PCR detection, and to establish a method to identify D. chrysotoxum rapidly and accurately. Methods From GenBank database, rDNA
170 ITS sequences in the plants of Dendrobium Sw. were downloaded and compared with all sequences using MEGA 5.0; The variation
sites were located, and a pair of specific primers in the non-conservative district were designed. PCR amplification was performed using
the specific primers with 35 DNA templates in the plants of Dendrobium Sw., D. chrysotoxum was positive. Results D. chrysotoxum
could be specifically amplificated by specific primers when the annealing temperature was raised to 58 , while other plants of ℃
Dendrobium Sw. were shown as negative, and the sensitivity of the primer could reach 0.69 ng/μL. Conclusion This study designs a
method that could identify D. chrysotoxum specifically. Using this specific primer could identify D. chrysotoxum rapidly and accurately
from the homologous species. This method is well-performed in specificity, and it is more simple, convenient, efficient, and accurate than
other methods, such as morphological and microscopical identification, chromatograph, and spectral method.
Key words: Dendrobium chrysotoxum Lindl.; specificity; PCR; molecular identification; Dendrobium Sw.

鼓槌石斛 Dendrobium chrysotoxum Lindl. 是
《中国药典》2010 年版石斛的主要来源之一，有益
胃生津，滋阴清热之功效[1]。在民族药中主治病后
虚热、口干烦渴、肿痛，称为南该龙。早在《神农
本草经》中就已有记载。鼓槌石斛不仅是名贵中药
材，同时也具有很高的观赏价值。鼓槌石斛中主
要含有毛兰素（erianin，3-羟基-4, 3′, 4′, 5′-四甲氧
基联苄）、毛兰菲（confusarin，2, 7-二羟基-1, 5, 6-
三甲氧基菲）、β-谷甾醇等成分[2]，现代药理研究
表明，鼓槌石斛主要成分毛兰素抗肿瘤作用显著，特
别是对肝癌的抑癌率达 50.82%[3-4]。由于盲目过度
采挖、生境破坏及其自身天然更新能力差、生长缓
慢等原因，鼓槌石斛野生资源骤减，栽培状况也由
于技术不成熟、管理和采收不合理等因素导致产量
较低。市场上鼓槌石斛的混伪品，如球花石斛 D.
thyrsiflorum Rchb.、重唇石斛 D. hercoglossum Rchb.

收稿日期：2013-01-15
作者简介：郑司浩（1989—），男，硕士，研究方向为中药质量评价与品质鉴定。Tel: 18911037217 E-mail: zshzha@163.com
*通信作者 黄林芳 Tel: (010)57833197 E-mail: lfhuang@implad.ac.cn
陈士林 E-mail: slchen@implad.ac.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月

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f.、流苏金石斛 Flickingeria fimbriata (Bl.) Hawkes、
齿瓣石斛 D. devonianum Paxt.、束花石斛 D.
chrysanthum Wall. ex Lindl.、美花石斛 D. loddigesii
Rolfe、叠鞘石斛 D. aurantiacum Rchb. f. var.
denneanum (Kerr) Z. H. Tsi、密花石斛 D. densiflorum
Wall. 等越来越多，传统的形态学鉴别方法很难准
确鉴定。本实验旨在建立一种快速、准确鉴别鼓
槌石斛的方法，利用 GenBank 数据库中石斛属
ITS 序列，运用生物学软件 MEGA、DNAMAN
在鼓槌石斛的 ITS 序列非保守区设计出一对约
20 bp 可以特异性检测鼓槌石斛的 PCR 引物，对
35 份石斛属植物的 DNA 模板进行 PCR 扩增，显
示为阳性者即为鼓槌石斛，并对引物的灵敏度进
行考察。本研究为鼓槌石斛的鉴别提供了一种分
子检测方法，该方法操作简便、快速，引物灵敏
度高。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验所用材料采自广西、四川、云南等地，
共计 35 份，见表 1，其来源由中国科学院植物所郎
楷永教授鉴定。引物由诺赛公司合成，引物序列为
上游引物 F：5’-CAAAGGATGGACGAACCCA-3’
和下游引物 R：5’-CGCAGCCAACGAGATGATT-3’。
所用试剂盒购自 TianGen 公司，型号为植物基因组
DNA 提取试剂盒（离心柱型）200 preps。所用 PCR
仪型号为东胜龙 ETC-811。
表 1 样品来源
Table 1 Source of samples
编号 材料 采集时间 采集地点 编号 材料 采集时间 采集地点
1 鼓槌石斛 Dendrobium
chrysotoxum
2011-04-29 云南普洱 19 铁皮石斛 D. officinale 2011-04-21 广西百色
2 鼓槌石斛 2011-05-01 四川雅安 20 铁皮石斛 2011-04-21 广西百色
3 鼓槌石斛 2011-03-16 广西百色 21 铁皮石斛 2011-05-07 云南普洱
4 鼓槌石斛 2011-04-29 云南普洱 22 球花石斛 D. thyrsiflorum 2011-05-01 四川雅安
5 鼓槌石斛 2011-05-01 四川雅安 23 球花石斛 2011-03-16 广西百色
6 鼓槌石斛 2011-03-16 广西百色 24 重唇石斛 D. hercoglossum 2011-05-02 四川雅安
7 金钗石斛 D. nobile 2011-05-01 云南瑞丽 25 重唇石斛 2011-05-01 云南瑞丽
8 金钗石斛 2011-05-10 广西百色 26 流苏金石斛 Flickingeria 2011-05-02 广西百色
9 金钗石斛 2011-05-15 贵州赤水 fimbriata
10 金钗石斛 2011-05-01 云南瑞丽 27 流苏金石斛 2011-05-02 四川雅安
11 金钗石斛 2011-05-10 广西百色 28 细茎石斛 D. moniliforme 2011-05-04 云南瑞丽
12 金钗石斛 2011-05-07 云南西双版纳 29 细茎石斛 2011-05-05 四川雅安
13 流苏石斛 D. fimbriatum 2011-03-16 广西百色 30 齿瓣石斛 D. devonianum 2011-05-04 云南瑞丽
14 流苏石斛 2011-05-10 云南瑞丽 31 束花石斛 D. chrysanthum 2011-03-16 广西百色
15 流苏石斛 2011-04-28 云南普洱 32 美花石斛 D. loddigesii 2011-03-16 广西百色
16 流苏石斛 2011-03-16 广西百色 33 细叶石斛 D. hancockii 2011-03-16 广西百色
17 流苏石斛 2011-05-10 云南瑞丽 34 叠鞘石斛 D. aurantiacum 2011-03-16 广西百色
18 流苏石斛 2011-04-28 云南普洱 35 密花石斛 D. densiflorum 2011-03-16 广西百色

1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 取各样品的叶片或根约 30 mg，
磨样机磨碎，用试剂盒法提取样品 DNA。提取时，
先加入缓冲液 GP 1 700 μL，巯基乙醇 1 μL，65 ℃
水浴 2 h（期间注意振荡次数）；取出加入氯仿-异戊
醇（24∶1）的混合液 700 μL，混合仪摇匀 5 min，
12 000 r/min离心5 min后取上清液，加入异丙醇700
μL，混合仪混匀 15～20 min；将混合液倒入吸附柱
内，放入离心管内 12 000 r/min 离心 40 s；弃废液，加
缓冲液 500 μL，12 000 r/min 离心 40 s；弃废液，加漂
洗液 700 μL，12 000 r/min 离心 40 s；弃废液，加漂洗
液 500 μL，12 000 r/min 离心 40 s；弃废液，空管离心
2 min，室温风干，加 100 μL ddH2O 洗脱，12 000 r/min
离心 2 min。将提取的DNA 模板−20 ℃保存。
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1.2.2 引物筛选 首先用 ITS 通用引物 ITS 5F 和
ITS 4R 对上述提取的 DNA 模板进行 PCR 扩增，检
测 DNA 提取的质量。通过生物学软件 MEGA、
DNAMAN 对GenBank 数据库下载 170余条石斛属
rDNA ITS 序列进行对比，在鼓槌石斛非保守区设计
出 3 对约 20 bp 长的特异性引物（图 1），经 DNA
合成仪合成后，分别对所提的 DNA 模板进行特异
性扩增，筛选出的鼓槌石斛扩增条带清晰、其他种
显示为阴性的引物，即为可以特异性检测鼓槌石斛
的 PCR 引物。

引物 ITS 5F 和 ITS 4R 为 ITS 通用引物，ITS F 和 ITS R 为扩增鼓
槌石斛的特异性引物
ITS 5F and ITS 4R are universal primers of ITS sequence, ITS F and ITS
R are specific PCR primer of D. chrysotoxum
图 1 ITS 区引物结构示意图
Fig. 1 Structure of primers in ITS region
1.2.3 PCR 扩增和电泳检测 通过反复试验，对
扩增的条件和体系参数进行优化。PCR 体系总体
积为 26 μL，其中包含：DNA 模板 3 μL、ddH2O 12.3
μL、Mg2+ 2 μL、缓冲液 2.5 μL、Dye 染料 2 μL、
dNTPs 2 μL、Taq DNA 聚合酶 0.2 μL、引物 F/R
各 1 μL。PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 1 min，58 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1.5
min，共 30 个循环；最后 72 ℃延伸 7 min。扩增
结束后以 1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析
系统分析并记录结果。
1.2.4 引物灵敏度考察 对所提鼓槌石斛的 DNA
模板进行质量浓度测定，选取一个合适的 DNA 浓
度（20.7 ng/μL），对其进行梯度稀释，分别稀释 10
倍（2.07 ng/μL）、15 倍（1.38 ng/μL）、30 倍（0.69
ng/μL）。对所稀释的 DNA 模板用相同的 PCR 体系
和反应条件进行特异性引物扩增，检测该引物所能
检测的 DNA 模板浓度的下限。
1.2.5 鼓槌石斛特异性引物验证 收集 16 份鼓槌
石斛样品，每份取约 30 mg，按照上述方法进行DNA
提取、ITS 通用引物检测 DNA 的质量、特异性引物
PCR 扩增、电泳检测，反应体系和条件参照“1.2.3”
项方法，验证特异性引物的作用效果。
2 结果与分析
2.1 ITS 通用引物检测 DNA 模板质量
运用 ITS 的通用引物对模板进行扩增，目的是
确定 DNA 的提取质量。如图 2 所示，扩增所用的
DNA Marker 为 2 000，其从上到下的条带分别表示
2 000、1 000、750、500、250、100 bp，可见通用
引物扩增的样品 ITS 序列均约 750 bp。由图明显看
出，所提取 DNA 的质量都能达到扩增要求，模板
的杂质较少，可以进一步筛选引物。

M-Marker 1～35-样品
M-Marker 1—35-samples
图 2 ITS 通用引物 PCR 产物电泳检测图
Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplification
products by ITS universal primer
2.2 特异性引物 PCR 扩增
用筛选好的 PCR 引物对达到扩增要求的 DNA
模板进行扩增。结果如图 3 所示，1～6 号鼓槌石斛
样品扩增呈阳性，条带整齐、清晰，大小约 400 bp，
而其他样品均呈阴性，无条带扩增。由此证明该引
物具有良好的特异性。
2.3 特异性引物灵敏度考察
使用相同的 PCR 反应体系和条件，对不同质量
浓度梯度的 DNA 模板进行特异性引物 PCR。条带依

图 3 特异性引物 PCR 产物电泳检测图
Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplification
products by specific primer
28SITS F 400 bp ITS R 18S
ITS 5F ITS 4R
750 bp
M CK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 CK M M
500 bp
M CK 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 CK M
500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
750 bp
750 bp
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据 DNA 模板浓度的大小逐渐变暗，当浓度稀释 30 倍
时，条带不明显，因此，该引物对鼓槌石斛的检测灵
敏度可达 0.69 ng/μL，即可检出样品中约 2.07 ng/μL
的鼓槌石斛，检测灵敏度高，见图 4。
2.4 鼓槌石斛特异性引物的验证
随机收集市售的 16 份鼓槌石斛样品，按照上述
步骤，运用特异性引物进行鉴别。1～4 号和 9～12
号有扩增条带，且非常清晰，纯度高，鉴定为鼓槌
石斛；其他样品扩增结果为阴性，无条带，鉴定其
均不是鼓槌石斛。经鉴定，5～8 泳道对应的样品为
金钗石斛，13～16 泳道对应的样品为流苏石斛，见
图 5。

M-Marker 1～3-0.69 ng·μL−1 DNA
4～6-1.38 ng·μL−1 DNA 7～9-2.07 ng·μL−1 DNA
图 4 特异性引物灵敏度检测
Fig. 4 Sensitivity investigation of specific primer

图 5 特异性引物扩增市售鼓槌石斛样品的电泳检测图
Fig. 5 Electrophoresis of PCR amplification products
by specific primer for sold samples
of D. chrysotoxum
3 讨论
随着分子生物学的迅猛发展，一些先进的分子
鉴定技术逐渐应用到中药材的基原鉴定中，如限
制性片段长度多态性（restriction fragment length
polymorphism, RFLP）技术、随机扩增多态 DNA
（random amplified polymorphism DNA，RAPD）技
术、简单重复序列区间（ inter-simple sequence
repeat,， ISSR）、扩增片段长度多态性（amplified
restriction fragment polymorphism，AFLP）技术等分
子标记技术[5]。它们各有优势，但缺点也非常明显，
RFLP 技术稳定、重复性强，但探针的制备繁琐，
且探针具有专一性；RAPD 技术对物种间的亲缘关
系鉴别具有重要意义，但重复性差，反应条件多变；
ISSR 技术快速、简便，但扩增条件对结果影响较大，
且反应体系和条件不同；AFLP 技术则需要有较高
的理论知识和试验技能，可推广性不强。Hebert
等[6-7]在 2003 年提出 DNA barcodes 技术，对于植物
的分子鉴定研究是一个重大的进步。随后研究的热
点围绕不同条形码序列对于不同植物的鉴定展开，
虽然至今没有一个通用的序列可对所有的植物进行
分子鉴定，条形码技术仍然对植物的分类和鉴定提
出了新的方向和挑战。陈士林等[8-9]首次将 DNA 条
形码技术引入中药鉴定体系，包括中药 DNA 条形
码序列的筛选确定、中药 DNA 条形码鉴定流程和
中药 DNA 条形码鉴定数据库系统构建；基于 753
个不同属 4 800 种 6 600 份药用植物测定 ITS2 序列
的鉴定成功率达 92.7%，建议将 ITS2 序列作为植物
鉴定的通用序列；并成功对蓼科、芸香科、锦葵科、
黄芪属、金银花、麦冬、大青叶、威灵仙、砂仁、
鳖甲、川木通、党参、赤芍、蒿本、金钱草、有
毒中药洋金花等多种药用植物进行 DNA 条形码
鉴定[10-13]；Kress 等[14]通过分析 DNA 条形码在开花
植物鉴定中的应用，指出 ITS 和 trnH-psbA 联合使
用，可以鉴别出大部分的植物，并在烟草和茄属植
物样品中得到验证。
石斛是一种传统的名贵中药材，价格昂贵，且
需求量大。鼓槌石斛是一种民族傣药，目前民族药
材品种已达 8 000 多种，2007 年国家相关部门发布
“关于切实加强民族医药事业发展的指导意见”[15]，
鼓励发展民族药学，同时，民族药同样面临质量标
准控制的难题。随着野生资源的匮乏以及栽培种植
中出现的越来越多的技术问题，导致市场上关于鼓
槌石斛的混淆品越来越多，而传统的鉴别方法不能
准确而有效的进行鉴别。分子生物学的发展让研究
者把焦点聚集在对中药材的分子鉴定方面。刘石泉
等 [16]通过对霍山石斛及其相似种的位点特异性
PCR 研究，设计出霍山石斛的位点特异性鉴别引
物，可高效、准确地鉴别霍山石斛。本研究通过运
M CK 1 2 3 4 5 6 7 8 CK M
M CK 9 10 11 12 13 14 15 16 CK M
500 bp
500 bp
M 1 2 3 CK 4 5 6 CK 7 8 9 CK M
500 bp 500 bp
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用生物学软件对比 170 余条石斛属 ITS 序列，在鼓
槌石斛的非保守区设计出一对特异性 PCR 引物，并
优化了 PCR 反应的条件，可以特异性地、快速准确
地鉴别鼓槌石斛。本研究提供了一种操作简便、省
时、准确、经济的鉴别鼓槌石斛的方法，并为石斛
属及其他种类药材的鉴定提供了依据。
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