全 文 ：台宁6 病毒学杂 志
V i r o l o g 云e -
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长叶车前花叶病毒上海分离株单克隆抗
体的制备及其免疫学特性
五 单克隆抗体免疫反应方法及在株系鉴别上的应用
涂正金 于善谦
( 复旦大学生物系 , 上海 )
提 要
采用 两种不同的 E L IS A 方法 比较了长叶车前花叶病毒上 海分离株 ( R M V o h )7 种单 克
隆抗体对完整病毒及其外壳蛋白的反应 。 结果表明不 同的单克隆抗体在两 种 E LI S A 方 法
中的反应特性各异 。 这可能由于 E LI S A 方法 对抗原结构的影响而导致抗原抗体结 合的不
同 。 比较烟草花叶病毒群的 7 个分离株对 R M v s h 单克隆抗体和兔多克隆抗体的反应 。 结
果表明单克隆抗体能与属于 R M V 的 3 个分离株起反应 , 并能将它们区分开 来 , 与 属 于
T M v 的 4 个分离株均无反应 。 而兔多克隆抗体与这 7 个分离株均有较强的反应 , 但难以
区分各株系 。 表明单克隆抗体在株系鉴别上具有高度的特异性 。
血清学关系很早就被用来研究表达病毒及其株系间的相互关系 。 如用血清学差异指
数 ( S e r o l o g i e a l D i f f e r e n t i a t i o n I n d e x 简称 S D I ) 表示差异的数量关系 [ ’ 〕 。 近十多年
来广泛使用的 E IL S A 方法 , 由于不 同的使用 目的和要求 , 已发展了多 种 实 验 分 析 方
法 2t] , 并广泛地用于单克隆抗体试验 。 该方法大大提高了血清学方法的特异 性 和 灵 敏
度 。 已经用于烟草花叶病毒 3[] 、 大麦黄矮病毒川 等的株系鉴别 上 。 本文报道 用 不 同 的
E LI S A 方法对单克隆抗体与长叶车前花叶病毒及其外壳蛋白结合的影响及在株 系 鉴 别
上的应用 。
材 料 与 方 法
一 、 病毒株系及其单克隆抗体 : 长叶车前花叶病毒上海分离株同前 fsJ , 外壳蛋白
制备采用醋酸法 `6J 。 其它病毒株系有长叶车前花叶病毒 H “ lm “ “ ` 株来自美国 , 油 青 菜
分离株 ( R M V ha ) 〔7] 由浙江农业大学提供 。 烟草花叶病毒青菜分离株 ( T M V n k ) 和 辣
椒分离株 ( T M V P ) 由江苏农业科学院提供 。 番茄乌心果 ( oT M V ) 『8了由本室 分 离 。 烟
草花叶病毒 普通株 ( T M V 。 ) 来白中国科学院微生物研究所 。 R M V ” h 的 7 种单克隆抗体
的制备及特性见前文 〔。 〕。
二 、 不同 E L I S A 方法对病毒及外壳蛋 白的反应 : 实验所采用的 E LI S A 方法 均列
本文于 1 9 8 7年 1 月 3 日收到
病毒学 杂志4 , 1 9 8 8
V i
r o l o g i e a S i n l o
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3 7 7
于表 1 中。 E LI S A 方法 1用于单克隆抗体的筛选 。 兔 R M V ” h 抗血清按常规方法制备 , 四
次硫 酸按沉淀和 D E A E 一 纤维素柱层析纯化 , 使用浓度为 1 0八g / m ]。 R M V s h 和外壳蛋白
( R M v s h
一 p ) 抗原浓度为 2 0群 g / m l 。 测定采用表 1 中的 E L I S A 方法 2 和 3 。 单克隆抗
体和多克隆抗体依效价作适当稀释 , 其它步骤同前文 〔g , 。 同样测定抗体在不同稀释度下
与抗原的作用曲线 。
表 1 不同 E L I S A 测定方法
1 D i f f
e r e n t E L I S A m e t h o d 3
步 骤 方 法 l 方法 2 方法 3
1 包被液 抗原 /包被液 兔抗体 /包被液
2 抗原 /磷酸缓冲液 牛血清白蛋 白饱和 牛血清白蛋 白饱和
3 牛血清白蛋白饱和 第一抗体 ( 鼠 ) 抗原 /磷酸缓冲液
4 待测抗体 酶联第二 抗体 第一抗体 ( 鼠 )
5 酶联第二抗体 底物水解 酶联第二抗体
6 底物水解 底物水解
三 、 不同病毒分离株对单克隆和多克隆抗体的反应 : 选用烟草花叶病毒群的 7个
分离株 R M V s h 、 R M V H 。 l m e 。 , 、 R M V h a T M V n k 、 T M V p 、 T o M V 、 T M V e , 用 间 接
EL I SA 方法和琼脂双扩散法测定各病毒株系与单克隆和兔多克隆抗体的反应 。
今士 旦王奋目 刁 、
一 、 不同 E LI S A 方法对单克隆抗体与病毒及外壳蛋白结合的影响 : 用 E LI S A 方法
2 和 3 测定 7 种单克隆抗体与完 整病毒及外壳蛋白的反应结果见表 2 。 7种单克隆抗体
分为两组 : I H 2 、 12 H 3用 抗原直接包被的 E LI S A 方法 2 时基本无反应 , 而用方法 3 时 ,
抗原先吸附于兔抗体则对完 整病毒和病毒外壳蛋白都有明显的反应 , 且前者强于后者 。
了H l 等其它 5个单克隆抗体在 E LI S A 方法 2 中对两种抗原反应都较强 , 在方法 3 中对完
整病毒反应较弱 , 但对外壳蛋白反应强烈 。 小 鼠和兔多克隆抗体在各种测定方法中反应
都很强 。
表 2
T a b 2 E f f e o t
不 同 E L I S A 方法对单克隆抗体与病毒及外壳蛋白反应的影响
o f d i f f
e r e n t E L I S A m e t h o d s o n d e t e r m i n a t i o n o f v 主r u . a n d i t目 亡 o a t
P r o t e i n b y m o n o e l o n a l a n t i b o d i e s
.
抗 体 及 稀 释
E L I S A 抗 原 I H 2 了H l x o H 一 l l H Z 1 2 H 3 1 7 H 6 2 9 H I M P e . R P e . 户
方法 1 : 1 0 4 ] : 10 4 一 l o 4 x : 1 0 4 1 : x o 4 1 : x o 4 1 : x o ` z : 10 8 1 : 1 0 ,
R M V s h
R M V s h
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2
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.
10 2
4 1 9 0
.
0 6 9 1
.
44 3 1
.
4 3 1 1
.
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5 4 8
3 3 2 0
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.
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.
1 7 9 1
.
5 3 1 1
.
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18 0 1
.
67 4 0
.
2 3 3 0
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3 4 5 2
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9 2 9 0 2 4 7 1 9 39 1
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_
60 3 一
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M P
。 : 鼠多克隆抗体 , . ’ R P 。 : 兔多克隆抗 体. 底物水解 。 . 5 小时 .
3 78病毒学杂志 4, 19 8 3
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抗体稀释度
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x 10
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抗体稀释度
A n t i b o d y D i l u t i o n
X 1 0
.
4
图 1 多克隆抗体和单克隆抗体与病毒及外壳蛋白的 E L sI A 反应曲线
( A )
: B A L B /
c小鼠多克隆抗 体 , ( B ) : 单克隆抗体 I H 2 , ( c ) : 单克隆抗体 l o H I ,
( v )
:
R M v s h
,
( p )
:
R M V s b
,
( 一一 ) : E L I s A 方法 2 , ( 一 ) : E L I s A方 法 3
F 19 1 S e h e m a t i e i l l u s t r a t i o n o f t h
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功 o n o e l o n a l a n t i b o d i e s w i t h v i r u s a n d i t s e o a t P r o t e i n .
( A )
: B A L B /
e 二 o u s e P o l y e l o n a l a n t i b o d y , ( B ) : M o n o e l o n a l
a n t i b o d y I H 2
,
( C )
:
M o n o
e l o n a l a n t i b o d y l o H 一, ( V ) : R M v s h
,
( p )
:
R M v s h e o a t p r o r e i n
,
( 一一 ) : E L I s A m e t h o d Z , ( 一 )
E L I S A m e t h o d 3
.
I H 2
、
l o H I 及鼠多克隆抗体 ( M P 。 )在不同稀释度下对病毒及外壳蛋白抗原 ( 2 0户g /
m l ) 的反应曲线如图 1 所示 。 从图 I A 可见多克隆抗体对抗原反应用 E LI S A方法 3 较 方
法 2 灵敏度高 。 图 I B 示单克隆抗体 I H 2 在 E LI S A 方法 3 中对完整病毒反应 较 强 , 与
外壳蛋白反应较弱 , E LI S A 方法 2 与两者基本无反应 。 图 I C 则表明单克 隆 抗 体 1 0 H I
用 E L IS A 方法 3 时对外壳蛋白反应强度较病毒粒子高 5 . 1倍 , 完整病毒反 应 很 弱 。 而
E LI s A 方法 2 中对病毒的反应强度高于外壳蛋 白。
二 、 病毒株系的鉴另lJ : 7 种单克隆抗体在一定稀释度下与烟草花叶病毒群的 7 个分
离株及健三生烟抽提物 , 用 E LI S A 方法测定反应 , 结果列于表 3 中 。 7 种单克 隆 抗 体
对 R M V s h 、 R M v H 。 ,二 e 。 , 、 R M v h a 都有反应 , 而对 T M V n k 、 T M V p 、 T o M v 、 T M v e
均无反应 。 但 R M V s h 兔多克隆抗体与上述 7 个分离株均有强烈反应 。 健株对照 均无反
应 。
单克隆抗体 1 1 H 2 、 1 2 H 3 及兔多克隆抗体与不同浓度的抗原反应曲线如图 2 所示 。
单克隆抗体 1 1H 2 ( 图 Z A ) 对 R M v s h 反应最强 , R M V ; , 。 , 。 e : , 中等但较 R M V h a 强 。
而单克隆抗体 1 2 H 3 ( 图 Z B ) 对 R M v s h 反应仍最 强 , R M V h a 反应 比 R M V H 。 , m e . ` 反
应强 。 两者与 T M v n k 、 T M v P 、 T “ M v 、 T M V “ 均无反应 。 兔多克隆抗体与上述 7 个分
离株均有较强反应 , 但很难区分各株系 ( 图 2c ) 。
润 .学象 志
i Vro lo gi e`
4
,
1 9台8
S 公n i 心 -
3 7 9
表 3 单克隆抗体与烟草花叶病毒群的几个分离株的反应
T a b 3 R e a e t i o n o f m o n o e l o n a l a n t i b o d 宝e s w i t h s o m e s t r a 宝。 5 o f T o b a m o v i r u 3 e s
E L I S A 病 毒 分 离 株 ( 2 0拌g / m l )
单克隆抗体 稀释度 R M v : h R M v H R M V h a T M V n k T M V P T o M V T M V e H e a l t h
方 法
I H 2
1 2 H 3
2 X 1 0
’
2 X 1 0
.
(飞 . 2 5 4 0 . 0 8 {
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抗原 A n t i g e n s (拌 g /m l ) 抗原 A n t i g e n s (召 g /m l )
图 2 多克隆抗 体和单克隆抗体与烟草花叶病毒群的几个分离株的反应曲线
( A )
: 单克隆抗体 , 1 1 H 2 ( B ) : 单克隆抗体 1 2 H 3 , ( c ) : 兔多克隆抗 体 ,
( l )
:
R M v , h
,
( 2 )
:
R M v H o l o e
s ’ ,
( 3 )
:
R M v 五a ,
( 4 )
:
T M v n k
,
( 5 )
: T M v P
,
( 6 ) T
o M v
,
( 7 )
: T M v e
.
F 19 2 s e h e m a t i e i l l u s t
r a t i o n o f t h e r e a e t 呈o n o f P o l y e l o n a l a n d m o n o e l o n a l a n t i b o 、
d i e s w i t h s o m
e s t r a i n s o f T o b a m o v i r u s e g
( A )
:
M o n o e l o n a l a n t i b o d y l l H 2
.
( B )
:
M o n o e l o n a 卫 a n 亡i b o d y 1 2 H 3 ,
( e )
: R a b b i t P o l了e l o n a l a n t i b o d y ,
用琼脂双扩散法比较单克隆抗体和多克隆抗体对病毒分离株的免疫沉淀反应特性如
图 3 所示 。 I H 2 、 1 2 H 3 与 R M v s h 、 R M v H 。 工。 。 : ` 、 R M v 五a 3 个分离株都产生一 条 沉
淀线 , 而对其它 4个分离株均无反应 ( 图 3 A , 3 B ) 。 兔多克隆抗体与 7个分离株均产生
免疫沉淀线 ( 图 3c ) ,
3 8 0
病毒学 杂志 4 , 1. 吕8
v i r o l o g i e 一 s i o i e .
图 3 单克隆抗体和兔多克隆抗体对几个病毒株系的免疫双扩散反应
(
a
)
: I H 2
,
( b ) 一2 H 3 , ( 。 ) : R p e , ( l ) : R M v s 五, ( 2 ) R M v H
( 3 )
: R M V 五 a , ( 4 ) : T M v n k , ( 5 ) : T M V p , ( 6 ) T o M v
,
( 7 )
: T M V e
.
F 19 3 I m m u n o d i f f u s i o n r e a e t i o n o f m o n o e l o n a l a n t i b o d y a n d r a b b i t p o l y e l o n
a
l
a n t i b o d y w i t h s o m e s r t a i n s o f 丫 i r u s e s
.
讨 论
以 E L IS A 方法 1 筛选的单克隆抗体用 E LI S A 方法 2 和 E LI S A 方法 3 测定与病毒及
其外壳蛋白的结合作用 , 结果表明不同 E LI S A 方法明显地影响到单克隆抗体的 筛 选 及
抗原抗体反应测定的结果 。 E LI S A 方法 2 中 , 抗原在高碱性 ( p H g . 6 ) 的包被液中直接
吸附于聚苯 乙烯板表面 , 可能对抗原结构改变较大 〔 ’ 。 , 。 E LI S A 方法 3 中抗原在 中性溶
液中吸附有利于保持结构的完整 。 单克隆抗体 I H 2 、 12 H 3 在 E LI S A 方法 2 中与抗原基
本不反应 , 而在方法 3 中与完整病毒反应较强 , 与外壳蛋白反应较弱 。 7 H I 等 5 个单克
隆抗体在 E LI S A 方法 2 中与完整病毒及外壳蛋白反应都较强 , 但在 E LI S A 方法 3 中对
完整病毒结合大大低于外壳蛋 白。 从而推断 : I H 2 、 12 H 3 结合的抗原决定簇可 能 属 于
与结构有关的不连续决定簇 ( D i s e o n t i n u e d e t e r m i n a n t ) 。 后 5 种单克隆抗体结合的抗
原决定簇可能属于顺序有关的连续决定簇 ( oC nt in u e de et r m in a n t ) , 在病毒结构 较完
整时可能处于隐蔽部分 , 也有人称隐蔽决定簇 ( C r y p t o P e ) 〔川 。 A I M o u d a l ] a l 〔` 2 , 在 比
较 T M v 单克隆抗体时也发现了类似的现象。 因此在筛选单克隆抗体及进行株系鉴另lJ时
要注意不同测定方法可能带来的差异 。
间接 E LI S A 法测定所制备的 7 个单克隆抗体与不同株系的反应 。 结果 7 个 单 克隆
抗体都与属于 R M v 的 3个分离株反应 , 不能与 T M v 各分离株反应 。 不同的单 克 隆抗
体可以区分 R M v 的不同株系 。 R M v s h 兔多克隆抗体能与所用的 7个分离株 起 反 应 ,
但很难将它们 区分开来 。 免疫双扩散反应结果也相似 。 因此 R M Vs h 兔多克隆抗体包 含
了能与 R M v 及 T M v 各株系起反应的抗体 。 而我们所制备的 B A L B c/ 小鼠的 7 种单克
隆抗体都不能与 T M V 反应 。 至今仅 iD “ t : g “ nt ” 〕用 S T U 品系小 鼠制备的 T M v 单克隆抗
体与 R M v 有反应外 , 其它用 B A L B / C 小鼠制备的 T M V 单克隆抗体均未发现 与 R M v
有反应 〔`幻 。 这可能由于 T M v 与 R M v 外壳蛋白氨基酸同源性仅为 4 %灿 , , 而 同 源 部
分可能对 B A L B / c 小鼠的免疫原 性很弱或无免疫原性所致 。 但这有待进 一 步研 究 证
寒,
病毒学杂志
V i r o l o g i e a
4
, 1 9 8 8
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〔 2 〕
〔 3 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 6 〕
〔 7 〕
〔 8 〕
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〔 ! O〕
〔2 1 〕
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V a n R e g e n m o r t e l , M
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5 4 1一
P r e p a r a t io n a n d Im m u n o lo g ie a l P r o p e r t ie s O f M o n o e lo n a l
A n t i七o d ie s t o R ib g r a s s M o s a ie V i r u : ( RMV s h )
11 M e t h o d
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o n o e l o n a l A n t i b o d i e s
a n d i t s A P P l y i n g i n t h e D i f f e r e n t i a t i o n o f V i r u s S t r a i n s
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T h e r e a e t i o n s o f s e v e n m o n o e l o n a l a n t i b o d i e s s P e o i f i e f o r S h a n g h a i I s o l a t e
o f R i b g r a s s M o s a i e V i r u s ( R M V
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o n a n d i t s e o a t P r o t e i n b y t w o
d i f f e r e n t E L J S A m e t h o d s w e 一℃ e o m P a r e d 。 T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e P r o P e r -
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e s o f r e a e t i o n o f s o m e m o n o e l o n a l a n t i b o d i e s i n t w o d i f f e r e n t E L I S A m e
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e r e d i f f e r e n t
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I t m a y b e t h a t t h e a n t i g e n s t r u e t u r e w a s e f f e e t e d b y t h e
d i f f e r o n t E L I S A m e t h o d s , s o t 卜a t t h e e a F a b i l i t y o f t h e b i n d i n g o f a n t i g e n t o
a n t i b o d y w a s e h a n g e d
。
T h e r e s u l t s o f d e t e r m i n a t i o n o f s e v e n s t r a i n s o f T o b
-
a m o v i r u s e s u s i n g m o n o e l o n a l a n t i b o d i e s a n d r a b b i t P o l y e l o n a l a n t i b o d i e s i n d i
-
e a t e d t h a t a l l nr o n o e l o n a l a n t i b o d i e s z 。 。 e t o d o n l y w i t h t h r e e s t r a i n s o f R M V ,
n o t w i t ll o t h e r s t r a i n s o f T M V
。
T h r e e s t r a i n s o f R M V e o u l d b e d f f e r e n t i a -
t e d b y t h e s e 讯 o n o e l o n a l a n t i b o d i e s . A l l s t r a i n s w h i e h w e r e t e s t e d e o u l d r e a e t
w i t h r a b b i t P o l y e l o n a l a n t i b o d i e s s t r o n g l y , b u t t h e y w e r e d i f f i e t l ] t t o b o d i f
-
f e r e n t i a t e d
.
T h e m o n o e l o n a l a n t i b o d e s w e P r e p a r e d a P P e a
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d a h g h s p e e i f i e i t y
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r d i f f e r e n t i a t i o n o f v i r u s s t r 找 i n s ,