全 文 ：·1444· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月

白藜芦醇抑制血管平滑肌细胞成骨样转化的实验研究
张明慧 1，王本泉 2，蔡晓青 1，刘 彪 2，王斯璐 2，吴存造 2，白永恒 2，陈必成 2，刘 毅 1*，邵蓉蓉 1
1. 温州医科大学附属第一医院 肾内科，浙江 温州 325000
2. 温州医科大学附属第一医院 移植科，浙江 温州 325000
摘 要：目的 研究白藜芦醇（resveratrol，Res）对血管钙化的抑制作用，观察不同浓度的 Res 对高钙高磷诱导的人脐动脉
血管平滑肌细胞（hVSMC）成骨样转化的影响。方法 体外培养 hVSMC 细胞，通过形态学和 α-SMA 标记进行鉴定。用高
钙高磷（钙 2.5 mmol/L、磷 3.0 mmol/L）培养基诱导 hVSMC 成骨样转化，通过茜红素染色法鉴定成骨样转化。以普通培养
hVSMC 作为对照组，加高钙高磷为阳性对照组，实验组为阳性对照加不同浓度的 Res（5、10、20 μmol/L）干预，培养 12 d
后，检测各组细胞含钙量，实时荧光定量 PCR 检测 hVSMC 成骨样转化相关基因骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨形态蛋白
（BMP-2）、骨桥蛋白（OPN）的表达水平；Western blotting 和免疫荧光标记方法检测 BAP、BMP-2、OPN 蛋白的表达。结
果 与对照组比较，阳性对照组细胞内含钙量明显升高约 5倍，α-SMA蛋白表达下降，而成骨样细胞特异性标记BAP、BMP-2、
OPN mRNA 和蛋白质表达均显著升高（P＜0.01）。不同浓度 Res 干预后后，细胞内含钙量下降，BAP、BMP-2、OPN mRNA
水平降低（P＜0.05、0.01）；BMP-2 及 OPN 的蛋白表达显著降低（P＜0.01），并与 Res 浓度呈负相关。结论 hVSMC 在高
钙高磷条件下发生成骨样转化，而 Res 抑制此过程的进展并与其浓度呈正相关。
关键词：白藜芦醇；人脐动脉血管平滑肌细胞；成骨样转化；骨桥蛋白；骨形态蛋白
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)10 - 1444 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.10.017
Inhibition of resvertrol on osteoblast-like trans-differentiation of vascular smooth
muscle cells
ZHANG Ming-hui1, WANG Ben-quan2, CAI Xiao-qing1, LIU Biao2, WANG Si-lu2, WU Cun-zao2,
BAI Yong-heng2, CHEN Bi-cheng2, LIU Yi1, SHAO Rong-rong1
1. Division of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
2. Centre for Transplantation, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
Abstract: Objective To investigate the inhibition of resvertrol (Res) on angiosteosis, and to observe the effects of Res at different
concentration on osteogenic conversion of human umbilical artery vascular smooth muscle cells (hVSMCs) induced by elevated
calcium (Ca2+) and phosphate (P) culture. Methods The hVSMCs were cultured in vitro, and identified by morphology and α-smooth
muscle actin (α-SMA) antibody. High calcium (2.5 mmol/L) and high phosphate (3.0 mmol/L) culture was used to induce the osteogenic
differentiation of hVSMCs. The calcification was confirmed by Alizarin red staining. Cells were divided into five groups such as normal
control (NC, normal concentration of Ca2+ and P), positive control (PC, high Ca2+ and high P), and three Res (5, 10, and 20 μmol/L)
groups. Calcium deposition in cells was measured by Arsenazo III after 12 d. Real-time PCR and Western blotting were used to detect
mRNA and protein expression of BAP, BMP2, and OPN. Results Compared to NC group, calcium deposition in the cells dramatically
increased by five times in PC group, the protein expression of α-SMA decreased, and the mRNA and protein expression of BAP, BMP-2,
and OPN obviously increased (P < 0.05). Res at different concentration could reduce the cellular Ca2+. The levels of BAP, BMP2, and
OPN were highest in PC group than NC and three Res groups. Furthermore, the expression of BMP2 and OPN decreased with increasing
Res concentration. Conclusion Res prevents the process of the osteogenic differentiation of hVSMCs induced by high calcium and high
phosphate. The degree of osteogenic differentiation is falling with increasing Res concentration.
Key words: resvertiol; human umbilical artery vascular smooth muscle cells; osteogenic differentiation; osteopontin; bone morphogenetic protein-2

收稿日期：2013-09-23
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY12H05004）；温州市科技局社会发展科学研究项目（Y20100224）；浙江省科技厅项目（2010C33094）
作者简介：张明慧，女，温州医学院研究生，从事肾脏病学相关研究。Tel: 18858707656 E-mail: zhmh87@163.com
*通信作者 刘 毅 E-mail: liudu@medmail.com.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月 ·1445·

心血管疾病是慢性肾脏病患者死亡的主要原
因，而动脉中膜钙化是终末期肾病患者心血管病变
的重要病理基础之一[1-2]，因而如何预防血管钙化具
有重要的临床意义。最近有研究发现白藜芦醇（3, 4,
5-三羟基二苯乙烯，resveratrol，Res）可以抑制平
滑肌细胞的增殖与凋亡[3]，对心血管系统具有长期
保护作用，但对人动脉血管平滑肌细胞（human
vascular smooth muscle cells，hVSMC）钙化过程的
影响尚未见相关报道。本研究观察 Res 对高钙、高
磷条件下 hVSMC 的成骨样转化作用，并探索其可
能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
Res，质量分数（HPLC）≥98%，批号 YY90051，
上海博蕴有限公司。高糖DMEM（含葡萄糖4.5 g/L）、
胎牛血清，澳洲 HyClone；青链霉素、胰酶，美国
Gibco；钙离子检测试剂盒（南京建成生物有限公
司）；抗 α-SMA 抗体、抗骨桥蛋白（OPN）抗体，
美国 abcom；抗骨形态蛋白（BMP-2）抗体（美国
Abgent）；抗 GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记二
抗，Solarbio；化学发光检测试剂盒（ECL）；Trizol
（美国，Invitation）；逆转录试剂盒和 SYBR Green
Master Mix（日本，Toyobo 公司）。
1.2 原代 hVSMC 培养
无菌条件下取本院妇产科胎儿（男婴，足月）
脐带，剥离脐动脉，无菌 PBS 清洗，剥除外膜，胰
酶消化法提取脐动脉平滑肌细胞，用含 20%胎牛血
清的高糖 DMEM 培养液培养，置于 37 ℃、5% CO2
培养箱中，3 d 后观察细胞贴壁后换液，待细胞生
长至 80%融合进行传代，传代后用含 10%胎牛血清
的 DMEM 培养液培养。免疫组化 α-SMA 鉴定细胞。
实验用第 4～10 代细胞。
1.3 实验分组及处理
细胞生长至 70%～80%融合时更换培养液，用
CaCl2、NaH2PO4 调节培养液中钙磷浓度，分为以下
5 组：对照组（磷 1.4 mmol/L，钙 2.0 mmol/L）；高
钙高磷阳性对照组（磷 3.0 mmol/L，钙 2.5 mmol/L）；
实验组为高钙高磷条件下加入不同浓度（5、10、
20 μmol/L）的 Res，以换用培养液当天记为第 0 天，
培养 12 d，每 2～3 天换液。
1.4 细胞钙化的检测
1.4.1 茜红素染色法对钙化进行定性检测 4%多
聚甲醛固定 30 min 后用 2%的茜红素工作液（pH
4.2）在室温下染色 15 min，显微镜下观察。
1.4.2 钙的定量检测 0.6 mol/L 盐酸在 37 ℃下脱
钙 24 h，利用钙和 Arsenazo 反应生成蓝紫色物质，
通过与参考品同时测定其在650 nm处的吸光度（A）
值计算各组的含钙量。BCA 法检测细胞蛋白的量，
用蛋白定量标化检测含钙量。
1.5 实时荧光定量 PCR 检测相关基因表达
收集各组细胞，Trizol 法抽取细胞总 RNA，反
转录成 cDNA，进行 PCR，反应体系为 10 μL，反
应条件：95 ℃、3 min；95 ℃、15 s，62 ℃、1 min，
重复 40 个循环。以 2−ΔΔCt表示实验组目的基因的表
达相对于对照组的变化倍数，以 GAPDH 作为内参。
1.6 Western blotting 检测相关蛋白表达
每组蛋白的上样总量约为 20 μg，将各组样本
加入预制的 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分
离后，湿转至 PVDF 膜，5%的脱脂牛奶封闭 1.5 h，
加一抗，4 ℃条件下孵育过夜，TBST 充分洗涤，
室温下用含辣根过氧化酶标记二抗的 5%脱脂牛奶
TBST 液孵育 1 h，TBST 洗涤后 ECL 发光，用 X
线拍片记录实验结果。
1.7 免疫荧光
以 4%多聚甲醛固定细胞爬片，0.5% Triton
X-100 室温下作用 30 min，加入 PBS 稀释的一抗，
4 ℃下孵育过夜，37 ℃复温 30 min，PBS 洗涤 3
次后加二抗避光孵育 50 min，观察，拍照。
1.8 统计学分析
所有计量资料用 ±x s 表示，符合正态分布且方
差齐性的数据，组间资料比较采用 t 检验或单因素
方差分析（One-way ANOVA）进行统计学分析。采
用 SPSS 16.0 进行统计分析。
2 结果
2.1 hVSMC 的原代培养和鉴定
48 h 后细胞贴壁，原代培养获得的细胞呈典型的
hVSMC 形态：细胞长梭形或多边形，胞质丰富，细
胞核居中，呈卵圆形，倒置显微镜下观察细胞生长呈
典型的“峰谷样”。免疫组化 α-SMA 染色见细胞胞浆
内 α-SMA 表达丰富，高倍镜下呈细丝状。α-SMA 染
色阳性率超过 95%，纯度符合实验要求。见图 1。
2.2 成骨样转化 hVSMC 的鉴定
高钙高磷培养液培养细胞 12 d 后，细胞层可见
颗粒样沉积，而对照组细胞间未见沉积，茜红素染
色结果显示，对照组未见明显异常物质，高钙高磷
组可见橘红样团块形成，见图 2。
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原代培养（×200） α-SMA（×200） α-SMA（×400）
图 1 hVSMC 的 α-SMA 鉴定
Fig. 1 α-SMA identification of hVSMC


对照 阳性对照
图 2 培养 hVSMC 细胞的茜红素染色
Fig. 2 Alizarin red staining of hVSMCs
应用钙离子检测试剂盒测细胞含钙量，以蛋白
定量标化：与对照组比较，高钙高磷阳性对照组的
含钙量明显增加，达 5 倍（P＜0.05），见表 1。
2.3 Res 减轻 hVSMC 的成骨样转化
高钙高磷环境下培养的 hVSMC 细胞加入不同浓
度 Res 后，细胞仍有不同程度的成骨样转化，但随着
Res 浓度升高，细胞成骨样转化逐渐减弱，与高钙高
磷组比较，细胞含钙量明显降低（P＜0.05），见表 1。
2.4 Res 下调成骨样转化 hVSMC 的相关基因表达
在正常钙磷浓度的培养基中培养的 hVSMC 细
胞，其成骨样细胞相关基因骨特异性碱性磷酸酶
（BAP）、OPN、BMP-2 的表达较低，诱导成骨样转
表 1 hVSMC 内钙沉积定量检测
Table 1 Quantification of calcium deposition in hVSMCs
组别 C / (μmol·L−1) 含钙量 / (μg·mg−1)
对照 — 19.12±1.98
Res 5 65.14±2.92**
10 38.21±1.86**
20 23.38±3.07*△
高钙高磷 — 100.01±5.52**
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与高钙高磷组比较：△P＜0.05
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; △P < 0.05 vs positive group
化后，BAP、OPN、BMP-2 表达显著升高（P＜0.01）；
随着加入 Res 浓度的升高，成骨样细胞 BAP、OPN、
BMP-2 的表达逐渐下降（P＜0.05、0.01），见图 3。
2.5 Res对成骨样转化hVSMC相关蛋白表达的影响
正常情况下，hVSMC 中 BMP-2、OPN 蛋白表
达较低，高钙高磷诱导 hVSMC 成骨样转化后，
BMP-2、OPN 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），
加入 Res 后，与高钙高磷组比较，BMP-2、OPN 蛋
白的表达随着 Res 浓度的升高而降低（P＜0.01），
见图 4。正常 hVSMC 中 α-SMA 蛋白的表达较高，




与对照组比较：**P＜0.01；与高钙高磷组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01，下图同
**P < 0.01 vs control group; △P < 0.05 △△P < 0.01vs positive group, following figures are same
图 3 Res 对 hVSMC 细胞中 BAP、BMP-2、OPN mRNA 表达的影响
Fig. 3 Effects of Res on mRNA expression of BAP, BMP-2, and OPN in hVSMCs
B
A
P
/ G
A
PD
H

对照 高钙高磷 5 10 20
Res / (μmol·L−1)
6
4
2
0
4
3
2
1
0
O
PN
/
G
A
PD
H

B
M
P-
2
/ G
A
PD
H

对照 高钙高磷 5 10 20
Res / (μmol·L−1)
对照 高钙高磷 5 10 20
Res / (μmol·L−1)
** **
**
△△
△△
△△
△△
△△
△△
△
△△
△△
10
8
6
4
2
0
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 10 期 2014 年 5 月 ·1447·



图 4 Res 对 hVSMC 细胞中 OPN 和 BMP-2 蛋白表达的作用
Fig. 4 Effects of Res on protein expression of BMP-2 and OPN in hVSMCs
高钙高磷培养 12 d 后，其表达显著下降（P＜0.01），
Western blotting 印迹实验结果显示，随着 Res 浓度的
升高，α-SMA 蛋白的表达呈上升趋势（P＜0.05、
0.01），见图 5。
2.6 免疫荧光检测 OPN 和 BMP-2 的蛋白表达
正常情况下，hVSMC 中 OPN、BMP-2 蛋白表
达较低，高钙高磷诱导后，OPN、BMP-2 蛋白表达
明显升高（P＜0.05），加入 Res 后，随 Res 浓度升高，
OPN、BMP-2 蛋白表达逐渐下降，见图 6 和表 2。
3 讨论
血管钙化是一种异位钙化，在终末期肾病患者
中十分常见。尤其是进行维持性血液透析时，终末
期肾病患者血管钙化发生早、发展迅速，导致心血
管疾病的死亡率明显增加[4]。大量临床研究证明，严
重的钙磷代谢异常会引起终末期肾病患者的血管




图 5 Res 对 hVSMC 细胞 α-SMA 蛋白表达的影响
Fig. 5 Effect of Res on protein expression of α-SMA
in hVSMCs


对照 高钙高磷 Res 5 μmol·L−1 Res 10 μmol·L−1 Res 20 μmol·L−1
图 6 免疫荧光检测 OPN 和 BMP-2 的蛋白表达
Fig. 6 Protein expression of OPN and BMP-2 by immunofluorescence
钙化[5-7]。相关研究也提出高钙高磷环境引起的动脉
平滑肌细胞（VSMC）的凋亡与转分化促进了终末期
肾病患者血管的钙化[8]。而心血管疾病是肾功能不全
患者最主要的死亡原因，预防或逆转血管钙化对终
末期肾病患者将有明显益处。本研究证实白藜芦醇
对高钙高磷诱导的 hVSMC 的成骨样转化有明显的
抑制作用，对持续血透的终末期肾病患者有潜在的
治疗价值。
前期研究证实慢性肾脏病患者的血管钙化主
要与中膜 VSMC 的变化相关[5,7]。以往实验多采用
鼠 VSMC 或牛 VSMC 研究血管钙化的防治[6,9]，近
几年体外实验中采用 hVSMC 研究钙化过程逐渐增
33 000


44 000

36 000
OPN


BMP-2

GAPDH
高钙高磷 5 10 20 对照
Res / (μmol·L−1)
高钙高磷 5 10 20 对照
Res / (μmol·L−1)
高钙高磷 5 10 20 对照
Res / (μmol·L−1)
O
PN
/
G
A
PD
H

2.0
1.5
1.0
0.5
0
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
B
M
P-
2
/ G
A
PD
H

△△
△△
**
△△
△△
△△
△△
**


α-SMA


GAPDH
43 000


36 000
α-
SM
A
/
G
A
PD
H
8
6
4
2
0
高钙高磷 5 10 20 对照
Res / (μmol·L−1)
高钙高磷 5 10 20 对照
Res / (μmol·L−1)
△△
△
△△
OPN





BMP-2
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表 2 各组 OPN、BMP-2 平均荧光强度
Table 2 Mean fluorescence intensity of OPN and BMP-2
组别 C / (μmol·L−1) OPN BMP-2
对照 — 1.704±0.125 1.776±0.057
高钙高磷 — 15.743±0.219* 11.343±0.195*
Res 5 13.873±0.254* 10.207±0.466*
10 10.960±0.043* 8.427±0.249*
20 6.685±0.161* 3.685±0.162*
与对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group
加[10]，可以更好地反映人血管钙化的发生机制，为
钙化的防治提供依据。因此本实验中，培养胎儿脐
动脉平滑肌细胞作为观察对象，通过形态学和特异
性标记蛋白 α-SMA 免疫化学鉴定，研究 hVSMC 在
中膜钙化中的变化。肾功能衰竭的患者中，高钙高
磷血症是一种重要的并发症，在异位钙化中起着重
要的作用。高磷主要促进 VSMC 的成骨样转变，而
高钙是促进 VSMC 的凋亡和基质囊泡的形成[11]。早
在 2004 年，Yang 等[12]证实高钙、高磷可刺激 VSMC
形成钙盐沉积，近几年也有研究证明[13-14]，高磷高钙
环境下 VSMC 发生转分化，导致钙盐沉积。本研究
中，建立高钙高磷环境（钙 2.5 mmol/L、磷 3.0
mmol/L）显示与其他研究者的结果一致：高钙高磷
对 hVSMC 诱导 12 d 后，形成明显的钙盐沉积，茜
素红染色可见细胞团块处有橘红色的钙盐沉积形成。
近几年对高钙高磷诱导血管钙化的机制研究
较多，很多研究显示血管钙化本质上是与骨形成相
似的高度可调控的过程[15]。成骨样转化相关因子如
BAP、OPN、BMP-2 等被证明是参与血管钙化的关
键分子，并可用于表型鉴定。BAP 为骨特异性碱性
磷酸酶，在 VSMC 的成骨样变中表达最早，反映
VSMC 的变化。BMP-2 和 OPN 均属于非胶原骨基
质蛋白。OPN 是一种分泌性糖基化磷酸蛋白，在骨、
软骨等组织中广泛表达，参与调节骨的矿化过程。
BMP-2 属于转化生长因子（ transforming growth
factor，TGF）家族，其作用是启动骨形成，在动脉
硬化斑块和中膜钙化的血管中高表达，还可能与基
质 Gla 蛋白（MGP）等其他钙化抑制因子的失活物
结合形成促进血管钙化的复合物加速血管的钙化。
α-SMA 则是血管平滑肌细胞的特异性标记蛋白，由
激素和细胞增殖所调节，细胞的转化以及动脉粥样
硬化等条件会改变 VSMC 中 α-SMA 的表达。Ｍoe
等[16]报道中指出以血透患者血清为高磷水平，其培
养的 VSMC 中的 BMP-2 表达升高。王宁宁等[17]的
研究中也提出体外高钙高磷会引起 VSMC 的转分
化，相关因子表达升高。本研究结果证实，高钙高
磷可诱导 VSMC 的转分化，高钙高磷组 OPN、
BMP-2、BAP 的表达显著高于对照组。
Res 是一种多酚类物质，存在于多种植物中，
目前为止未发现有毒副作用。Res 具有多种药理作
用，如抗炎、抗凋亡、抗增殖、抗氧化及雌激素样
效应，还具有较好的抗肿瘤作用[18-19]。Res 可抑制
VSMC 的增生，高浓度的 Res 则会导致激活的
VSMC 凋亡。Bruedigam 等[20]研究证明 Res 对罗格
列酮导致的 VSMC 的钙化有抑制作用。Ichiki 等[3]
证实 Res 是一种 ET-1 拮抗剂，可抑制 Ang II 导致
的 VSMC 的凋亡与增生，但对于 Res 在高钙、高磷
诱导的 VSMC 转分化中的作用，目前研究较少。本
研究以高钙高磷诱导的 hVSMC 成骨样变为基础，
加入不同浓度的 Res，观察 Res 在 hVSMC 成骨样
变过程中的作用。研究结果显示：加入不同浓度的
Res 后，随着 Res 浓度的增高，钙盐沉积逐渐减少，
成骨样转化相关基因 BAP、OPN、BMP-2 的 mRNA
表达逐渐下调。Western blotting 印迹亦证实，随着
Res 浓度的增高，OPN、BMP-2 的表达逐渐下降，
而 VSMC 的特异性标记 α-SMA 的表达逐渐增高。
这些结果表明Res在高钙高磷诱导的VSMC钙化过
程中有抑制作用，Res 浓度越高，其抑制作用越强。
这为以后探索 Res 对血管的保护作用提供依据，具
有一定的临床意义。
总之，高钙高磷对 hVSMC 有主动调节骨转化
的作用，成骨样细胞相关蛋白的产生，VSMC 中
α-SMA 的丢失及钙盐的沉积导致血管的钙化。而
Res 对此过程中起抑制作用，减轻了 hVSMC 的钙
化，对终末期肾病患者的血管保护具有潜在的重大
意义。但 Res 抑制高钙、高磷诱导的 VSMC 的钙化
的具体分子机制仍不清楚，需要进一步的研究与深
入探讨。
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