全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 23 期 2014 年 12 月 ·3392·
基于化学指纹图谱和生物毒性检测的何首乌质量评控
庞晶瑶 1, 2#，王伽伯 2#，马致洁 1，朱 云 3，邹正升 4，滕光菊 4，梁庆生 4，李永纲 3，曹俊岭 5，
赵奎君 1*，肖小河 3*
1. 首都医科大学附属北京友谊医院 中药剂科，北京 100050
2. 解放军 302 医院 全军中药研究所，北京 100039
3. 解放军 302 医院 中西医结合肝病诊疗与研究中心，北京 100039
4. 解放军 302 医院 非感染肝病诊疗与研究中心，北京 100039
5. 北京中医药大学附属东直门医院，北京 100007
摘 要：目的 近年来何首乌肝中毒事件频发，针对网络销售制何首乌大量增加及质量监测缺失的问题，检测不同批次从网
络上购买（网购）的制何首乌质量和肝细胞毒性大小，并比较何首乌不同炮制工艺的减毒效果，为规范和提高何首乌临床用
药的安全性提供参考。方法 采用指标成分定量测定、化学指纹图谱和肝细胞毒性评价方法，考察部分网络销售的制何首乌
质量差异；比较不同炮制方法对何首乌肝细胞毒性降低效果。结果 网购的 26 批制何首乌二苯乙烯苷在 0.004%～3.442%，
其中有 8 批不符合《中国药典》2010 年版规定；指纹图谱相似度在 0.052～0.998，其中有 6 批差异巨大；对肝细胞毒性（IC50）
差异较大，其中 4 批网购的制何首乌样品毒性大于生何首乌对照药材。何首乌常压清蒸法减毒速度较慢，蒸制 12 h 毒性仅
下降 13.6%；高压清蒸法和高压黑豆汁蒸法减毒速度相对较快，蒸制 5～6 h 毒性下降 22.1%左右且趋于稳定。结论 网络销
售的制何首乌质量参差不齐，相当部分炮制减毒不充分，增加了何首乌肝中毒的风险，应加强何首乌炮制工艺规范化研究；
何首乌高压清蒸法的炮制减毒效果较好、时间较短，建议推广采用。
关键词：网络购买；何首乌；制何首乌；肝毒性；质量监测；炮制工艺；安全性；指纹图谱；二苯乙烯苷；高压清蒸法
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)23 - 3392 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.23.007
Quality evaluation and control of Polygoni Multiflori Radix based on chemical
fingerprint and toxicity monitoring
PANG Jing-yao1, 2, WANG Jia-bo2, MA Zhi-jie1, ZHU Yun3, ZOU Zheng-sheng4, TENG Guang-ju4, LIANG
Qing-sheng4, LI Yong-gang3, CAO Jun-ling5, ZHAO Kui-jun1, XIAO Xiao-he3
1. Traditional Medicament Department, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050,China
2. China Military Institute of Chinese Materia Medica, 302 Military Hospital, Beijing 100039, China
3. Integrative Medical Center, 302 Military Hospital, Beijing 100039, China
4. Diagnosis and Treatment Center for Non-infectious Liver Diseases, 302 Military Hospital, Beijing 100039, China
5. Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100007, China
Abstract: Objective Recently hepatotoxicity induced by Polygoni Multiflori Radix Praeparata (PMRP) frequently happened. To
aim at dealing with the problems of latest increase of online shopping PMRP and lack of quality monitoring mechanism, the quality
and hepatotoxicity of various batches of online shopping PMRP were analyzed, the toxicity-attenuation effects of various processing
technologies of Polygoni Multiflori Radix (PMR) were compared, and the reference for clinical safe medication of PMR was provided.

收稿日期：2014-04-16
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373984）
作者简介：庞晶瑶，女，硕士在读。Tel: 13811928630 E-mail: pjy101411@163.com
王伽伯，男，博士，助理研究员。Tel: (010)66933325 E-mail: pharm_sci@126.com
*通信作者 赵奎君 Tel: (010)63138562 E-mail: zhao1959292@sina.com
肖小河 Tel: (010)66933322 E-mail: pharmacy302@126.com
#为共同第一作者
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 23 期 2014 年 12 月 ·3393·
Methods The quality variance of these PMRP was evaluated and the hepatotoxicity-attenuation effects of various processing
technologies were compared by adopting index component content determination, chemical fingerprint, and liver cell toxicity
evaluation. Results The content of diphenylethylene glycosides in 26 batches of online shopping PMRP was 0.004%—3.442%,
therein eight batches could not conform to Chinese Pharmacopoeia 2010; The chemical fingerprint similarity was between 0.052 and
0.998, therein great differences among six batches existed; The hepatotoxicity difference was significant as 9.7 times, therein the
toxicity of four groups of online shopping PMRP samples was higher than that of PMR medicinal material. The toxicity of PMRP
attenuated slowly using atmospheric pressure steaming method, and the toxicity by steaming 12 h declined only 13.6%; The toxicity of
PMRP attenuated relatively fast by high-pressure steaming and high-pressure black soya bean steaming methods, and the toxicity by
steaming 5—6 h declined by 22.1% and tended towards stability. Conclusion The quality of online shopping PMRP varies greatly and
inadequate processing method increases the liver poisoning risk of PMRP to some extent, which indicates that the researches on
technology standardization of PMRP should be strengthened. As well, the high-pressure steaming method can ensure the safety of
PMRP and shorten the processing time greatly, which should be expected as a promising processing method.
Key words: online shopping; Polygoni Multiflori Radix; Polygoni Multiflori Radix Praeparata; hepatotoxicity; quality detection;
processing technology; security; fingerprint; diphenylethylene glycosides; high pressure steaming method

何首乌为传统著名补益类中药，不仅在中医临
床上应用较多，在民间也备受追捧，使用人群广泛。
然而，近年来有关何首乌导致肝损伤的报道频发。
以“何首乌”和“肝毒性”为关键词检索中国知网
和 PubMed 数据库，何首乌及其相关制剂引起肝损
伤的病例报道超过 150 余例。对这些病例调查分析
表明，药材质量不合格和不合理用药是何首乌产生
肝损害的重要原因。笔者在临床发现，近年来因服
用从网络购买（网购）的何首乌制品后导致肝中毒
的病例多发。由于网络售药缺少监管，何首乌产品
质量难以保障，可能存在因质量不合格增加何首乌
肝中毒的风险。炮制减毒是保障何首乌用药安全的
重要措施。据本草记载，何首乌炮制方法较为复杂，
如“赤白各一斤，米泔浸三日，去皮铺黑豆上，砂
釜蒸之，如此九次”、“制法以竹刀刮去皮，拌黑豆
九蒸九晒”、“米泔浸拌，黑豆同蒸”等[1]；而现代
厂家往往对何首乌炮制工艺较为简略，存在炮制不
规范或不合格的情况，甚至有不法厂家采用墨汁或
染料浸泡、代替蒸制的现象[2-3]。古代应用何首乌几
乎没有中毒的记载，而当前何首乌中毒事件频发，
表明何首乌的炮制方法十分重要[4]。如今网络销售
的何首乌鱼龙混杂，很可能没有达到有效的炮制减
毒，其真实性和规范性受到质疑。为此，本实验对
网络销售的部分制何首乌进行质量检测，同时结合
何首乌肝细胞毒性检测，探讨不同炮制方法减毒的
有效性，为加强市售何首乌产品质量监控、降低肝
中毒风险提供科学依据。
1 材料与仪器
RPMI 1640 培养基（Gibco，批号 1161726），
胎牛血清（Gibco，批号 505985），胰蛋白酶（Gibco），
乙醇（北京化工厂，批号 20111013），乙腈（色谱
纯，Fisher 公司，批号 116525），甲醇（色谱级，德
国 Merck 公司），二苯乙烯苷（批号 110844-201109，
质量分数≥98%，购自中国食品药品检定研究院），
去离子水经（18.2 MΩ）Millipore Milli-Q 系统
（Millipore Co.，美国）超纯水器净化。26 批网购（编
号 1～18、20～27）制何首乌药材购于淘宝网（除
了一家同仁堂商品，其余均为无营业执照、无销售
发票、无生产批次的“三无”产品），生何首乌对照
药材（编号 19，批号 934-200106）购自中国食品药
品检定研究院。研究炮制工艺用的生何首乌（批号
10050904）购于北京绿野药业有限公司，经解放军
第 302 医院肖小河研究员鉴定为蓼科植物何首乌
Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根。
Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪（美国
Waters），SynergyTM HT 多功能酶标仪（美国 BioTek
公司），TC10TM 自动细胞计数器（美国 Bio-Rad
Laboratories），超净工作台（苏州净化设备有限公
司），KQ—500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超
声仪器有限公司），旋转蒸发仪（德国 Heidolph 公
司），ZK—82B 型真空干燥箱（上海市实验仪器总
厂），恒温二氧化碳培养箱（NAPCO），AL204 微量
分析天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）。
2 方法
2.1 何首乌炮制品制备
将生何首乌药材洗净，放入真空干燥箱内 60
℃干燥 12 h，分别按下述方法炮制。
2.1.1 常压清蒸法[5] 取干燥后生何首乌样品适
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量，加入 60%的水闷润 6 h 至透心，切成 2 cm 见方
小块，分别进行常压蒸制 2、4、6、8、10、12 h，
干燥，备用。
2.1.2 高压清蒸法[6] 取干燥后生何首乌样品适
量，加入 60%的水闷润 6 h 至透心，切成 2 cm 见方
小块，放入高压锅中，分别进行加压蒸制 1、2、3、
4、5、6 h，干燥，备用。
2.1.3 高压黑豆汁蒸法[7] 称取黑豆适量，加水，
电炉上加热至沸，小火煮 2 h，取黑豆汁，残渣加水
再煮 1 h，合并 2 次黑豆汁。取干燥后生何首乌样品
适量，加入 60%的黑豆汁闷润 6 h 至透心，切成 2 cm
见方小块，分别进行加压蒸制 1、2、3、4、5、6 h，
干燥，备用。
2.2 供试品制备
取网购或不同方法炮制的何首乌样品各 30 g，
用 70%乙醇提取 2 次，第 1 次加 10 倍量溶剂，超
声提取 1 h，第 2 次加 8 倍量溶剂，超声提取 1 h。
合并 2 次乙醇提取液，浓缩并减压干燥，制得干粉
备用。
2.3 指标成分定量测定
参照《中国药典》2010 年版一部方法测定[8]。
2.4 指纹图谱检测
2.4.1 样品制备 取已粉碎过筛药材粉末 10 g，加
入 50%乙醇 100 mL，超声处理 30 min，滤过浓缩
后，冷冻干燥，计算出膏率，分别称取适量何首乌
提取粉末于量瓶中，加甲醇配成 40 mg/mL 的供试
品溶液，过 0.22 μm 滤膜进样。
2.4.2 液相条件 色谱柱为 Waters CSH C18 分析柱
（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-0.5%
甲酸水溶液，梯度洗脱：0～7 min，5%～35%乙腈；
7～9 min，35%～45%乙腈；9～13 min，45%～65%
乙腈；13～16.99 min，65%～80%乙腈；16.99～17
min，80%～5%乙腈；17～18 min，5%乙腈；检测
波长 254 nm；柱温 25 ℃；体积流量 0.5 mL/min；
进样量 5 μL；分析时间 18 min。
2.5 肝细胞毒性评价
正常人肝细胞株 L02 系（购自中国科学院上海
生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞
库），在含有 10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100
μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养基中，37 ℃、5%
CO2 进行常规培养，实验均在细胞生长对数期进行。
用培养基将不同的何首乌提取物溶解为 8 mg/mL
（以生药计）的药液，用 0.22 μm 的无菌滤膜滤过。
将 100 μL的L02细胞以 3.5×104个/mL 的浓度接种
在 96 孔板上，培养 24 h 后，吸弃培养基，加入配
制好的何首乌药液 200 μL，每个样品设 6 个复孔，
作用 24 h 后，吸弃药液，加入 MTS，在培养箱内
反应 4 h 后检测 490 nm 处吸光度（A）值，计算细
胞抑制率（抑制率＝1－A 样品/A 空白）。
3 结果
3.1 不同批次何首乌中二苯乙烯苷定量测定结果
和对照指纹图谱相似度结果
27 批何首乌药材中二苯乙烯苷定量测定结果
和对照指纹图谱的相似度结果见表 1。
3.2 不同批次何首乌的 UPLC 表征结果
指纹图谱的建立参考课题组前期实验结果[9]。
采用 2004 版中国药典委员会颁布的中药色谱指纹
图谱相似度评价系统软件，对所得的 27 批何首乌药
材指纹图谱进行分析，其中 19 号样品为何首乌对照
药材（图 1-A），生成对照指纹图谱，同时对 27 批何
表 1 27 批何首乌药材中二苯乙烯苷定量测定结果和对照指纹图谱的相似度
Table 1 Quantitative determination of diphenylethylene glycosides and UPLC fingerprint similarity of 27 batches of PMR
编号 二苯乙烯苷 / % 相似度 编号 二苯乙烯苷 / % 相似度 编号 二苯乙烯苷 / % 相似度
1 1.858 0.997 10 2.302 0.995 19 3.442 0.992
2 1.453 0.993 11 1.448 0.986 20 — 0.761
3 2.685 0.995 12 2.539 0.995 21 0.463 0.132
4 3.428 0.993 13 1.483 0.995 22 0.004 0.843
5 2.333 0.997 14 1.359 0.997 23 0.262 0.742
6 — 0.052 15 2.991 0.994 24 0.249 0.995
7 1.624 0.996 16 1.674 0.998 25 0.614 0.188
8 2.560 0.998 17 1.503 0.993 26 0.018 0.992
9 1.278 0.990 18 3.262 0.996 27 1.623 0.991
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1-没食子酸 2-二苯乙烯苷 3-大黄素
1-gallic acid 2-diphenylethylene glycosides 3-emodin

图 1 何首乌对照药材的 UPLC 图谱 (A) 和 27 批何首乌
UPLC 指纹图谱匹配图 (B)
Fig. 1 UPLC of reference PMR (A) and UPLC fingerprint
matching figure of 27 batches of PMR (B)

首乌药材的指纹图谱进行匹配（图 1-B），并对其相
似度进行分析，以对照指纹图谱为标准，27 批药材
相对对照指纹图谱的相似度在 0.052～0.998（表 1）。
3.3 不同批次何首乌体外肝毒性评价结果
采用 MTS 检测方法评价 27 批何首乌药材对人
正常肝细胞（L02）的生长抑制情况，并采用 SPSS
20.0 软件计算不同药材的 IC50 值（图 2）。
生何首乌对照药材的 IC50 值为 3.5 mg/mL，26
批制何首乌的 IC50 值差异较大，其中有 4 批（第 3、
4、7、18 号）药材的 IC50 值小于 3.5 mg/mL，毒性
大于生何首乌，还有 3 批（第 10、15、16 号）制何
首乌的毒性接近于生何首乌。另外 4 批（第 22、23、
24、27 号）药材在质量浓度为 18 mg/mL 时，仍得
不到其 IC50值。
3.4 何首乌炮制品毒性评价结果
以人正常肝细胞系 L02 细胞为模型，采用 MTS
检测方法评价常压清蒸法、高压清蒸法及高压黑豆
汁蒸法对何首乌进行炮制后的炮制品对 L02 细胞的
生长抑制情况（图 3）。
从结果可以看出，3 种炮制方法的细胞抑制率
基本均随着炮制时间的增加而减小。从图 3 中还可
以看出何首乌常压清蒸法减毒速度较慢，蒸制 12 h



“−”表示在研究的何首乌生药材质量浓度在 0.6～18 mg/mL，质量
浓度为 18 mg/mL 时，仍得不到 IC50值
“−” indicates that concentration of PMR ranges in 0.6—18 mg/mL,
when concentration is 18 mg/mL, still can not get IC50

图 2 何首乌样品对人正常肝细胞 (L02) 的 IC50值
Fig. 2 IC50 values of PMR against human normal
liver cells (L02)




图 3 何首乌不同炮制方法的炮制品对L02细胞的抑制情况
Fig. 3 Inhibition of PMR samples by different processed
methods against human normal liver cells (L02)

毒性仅下降 13.6%，高压清蒸法和高压黑豆汁蒸法
减毒速度相对较快，蒸制 5～6 h 毒性下降 22.1%左
右且趋于稳定，但随炮制时间变化的稳定性有待于
进一步考察。
4 讨论
近年来，临床上有关何首乌及其制剂导致肝损
伤的报道频发，引起人们的广泛关注。为保障公众
用药安全，2013 年 10 月国家食品药品监督管理总
局（CFDA）决定将养血生发胶囊、首乌丸、首乌
片、首乌延寿片及首乌延寿颗粒等 5 个含何首乌的
非处方药品种转为处方药管理，并对上述 5 个品种
及白蚀丸的说明书进行修订。笔者在临床调研发现，
很多患者都是服用从网络购买的何首乌制品导致肝
中毒。由于网络销售药品的质量监管困难，导致网
购中药的质量参差不齐。本实验对 26 批网购药材中
1
2
3
1 3
2
0 2.61 5.22 7.83 10.43 13.04 15.65 18.26
t / min
16
12
8
4
0
IC
50
/
(m
g·
m
L−
1 )

1 5 9 13 17 21 25
批次
生首乌对照药材
90
85
80
75
70
65
60
抑
制
率
/
%

常压清蒸法
高压清蒸法
高压黑豆汁蒸法
0 2 4 6 8 10 12
t / h
R
S27


↑


S1
A
B
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 23 期 2014 年 12 月 ·3396·
二苯乙烯苷的量测定发现有 6 批没有达到《中国药
典》2010 年版规定的检测值，有 2 批为伪品。同时
细胞毒性实验检测发现制何首乌样品中有 4 批毒性
大于生何首乌，3 批毒性接近生何首乌，约有三分
之一的样品没有有效地炮制减毒，政府部门应大力
加强对何首乌及其他中药的监管。
综上分析，何首乌炮制的有效程度与细胞毒性
密切相关。目前尽管对何首乌的炮制进行了一些研
究，但全国还没有统一的炮制工艺方法和技术参数。
并且何首乌炮制前后主要化学成分的量及药理作用
有很大差别[10-14]，因此规范现有的炮制工艺显得尤
为重要。
根据《中国药典》2010 年版规定，何首乌的炮
制采用黑豆汁制法，将何首乌用黑豆汁拌匀置非铁
质容器用炖法或蒸法炮制成制何首乌[8]。本实验采
用常压清蒸法、高压清蒸法和高压黑豆汁蒸法对生
何首乌进行炮制，根据结果分析，3 种炮制方法均
能不同程度的降低何首乌的肝毒性，高压清蒸法能
更快更稳地降低何首乌的肝细胞毒性，减少炮制时
间。从中医的角度讲，黑豆色黑入肾，用黑豆汁炮
制可能有利于增强何首乌的补益功效，保健效果更
佳。本实验仅从毒性的角度对何首乌进行探讨，今
后可能会对何首乌“存效”、“增效”，以及两者之间
的联系兼顾“减毒”等多方面进行探索。
综上，网络销售的何首乌产品质量参差不齐，
建议民众谨慎购买；国家监管部门应大力加强网络
销售何首乌及其他中药的质量监控，提高网络销售
中药产品质量；同时应重视和加强何首乌炮制减毒
工艺规范化研究，提高何首乌炮制品质量，减少或
避免临床上肝中毒的发生。
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