全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 4 期 2014 年 2 月

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• 药材与资源 •
ITS 和 psbA-trnH 序列鉴别绿绒蒿属藏药植物
倪梁红 1，赵志礼 1*，孟千万 1，嘎 务 2，米 玛 2
1. 上海中医药大学中药学院，上海 201203
2. 西藏藏医学院，西藏 拉萨 850000
摘 要：目的 应用核基因 ITS 和叶绿体 psbA-trnH 序列对绿绒蒿属 Meconopsis Vig. 藏药进行鉴别。方法 采集欧贝（ ）
3 种基原植物罂粟科绿绒蒿属毛瓣绿绒蒿 Meconopsis torquata、红花绿绒蒿 Meconopsis punicea、全缘叶绿绒蒿 Meconopsis
integrifolia，才温（ ）2 种基原植物罂粟科绿绒蒿属总状绿绒蒿 Meconopsis racemosa、多刺绿绒蒿 Meconopsis horridula，
对植物核糖体 DNA 内转录间隔区、叶绿体 psbA-trnH 非编码区序列进行测定与分析。结果 ITS 序列分析显示，总状绿绒
蒿与多刺绿绒蒿序列一致，其余任意两种间具有变异位点；psbA-trnH 序列分析显示，任意两种间均有变异位点；两者结合
可有效对所有 5 种植物进行区分鉴定。结论 ITS 和 psbA-trnH 序列相结合可用于绿绒蒿属藏药欧贝和才温的分子鉴定。
关键词：ITS；psbA-trnH；藏药；绿绒蒿属；欧贝；才温；毛瓣绿绒蒿；红花绿绒蒿；全缘叶绿绒蒿；总状绿绒蒿；多刺绿绒蒿
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)04 - 0541 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.04.017
Identification of Tibetan medicinal plants of Meconopsis Vig. using ITS and
psbA-trnH sequence
NI Liang-hong1, ZHAO Zhi-li1, MENG Qian-wan1, GAAWE Dorje2, MI Ma2
1. Department of Pharmacognosy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, China
2. Tibetan Traditional Medical College, Lhasa 850000, China
Abstract: Objective To identify the common Tibetan traditional medicine of Meconopsis Vig. using nuclear gene internal transcribed
spacer (ITS) and chloroplast psbA-trnH sequence. Methods Ethnopharmacological study was carried out, three species of Ou-Bei (M.
torquata, M. punicea, and M. integrifolia) and two species of Cai-Wen (M. racemosa and M. horridula) were collected. The ribosomal
DNA ITS and chloroplast psbA-trnH noncoding region sequences were determined and analyzed. Results The ITS sequences of M.
racemosa and M. horridula were completely the same, while variable site could be detected in each pairwise comparison of ITS sequences
in other species; The psbA-trnH sequence analysis showed that the variable sites could be detected in each pairwise comparison of the
sequences. The combination of them could be used to identify all the five species. Conclusion The combination of ITS and psbA-trnH
sequence could be used to identify the Tibetan traditional medicine Ou-Bei and Cai-Wen in Meconopsis Vig.
Key words: ITS; psbA-trnH; Tibetan traditional medicine; Meconopsis Vig.; Ou-Bei; Cai-Wen; Meconopsis torquata Prain; Meconopsis
punicea Maxim.; Meconopsis integrifolia (Maxim.) Franch.; Meconopsis racemosa Maxim.; Meconopsis horridula Hook. f. et Thoms.

绿 绒 蒿 属 Meconopsis Vig. 是 罂 粟 科
（Papaveraceae）的第二大属，我国有 38 种，集中分
布于西南部，是一类具有较高经济、药用价值的高
山植物[1]。藏医药学是传统医学宝库的重要组成部
分，具有丰富的民族特色，自古以来就以该属多种
植物入药[2]。藏药“欧贝”（ ）来源于本属多种
植物，可清肝热、肺热，并能治热邪引起的喉阻塞。
根据花色不同，欧贝又分为不同品种，其中蓝色花
的称为“欧贝完保”，红色花的称为“欧贝玛保”，
黄色花的称为“欧贝赛保”[2-3]。藏药“才温”（ ）

收稿日期：2013-10-15
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173654）；上海市教委预算内科研项目（2011JW11）
作者简介：倪梁红（1980—），男，讲师，主要从事中药资源与品种鉴定工作。E-mail: nlhtcm@126.com
*通信作者 赵志礼，教授，博士生导师，主要从事中药资源与品种鉴定工作。E-mail: zhilzhao@sohu.com
网络出版时间：2014-01-08 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7501/j.issn.0253-2670.2014.01.html
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来源于本属植物，可清骨中之热，治头伤、骨折、
跌打损伤等症[2-3]。近年来，本课题组开展了藏药的
品种整理及民族植物学调研工作[4-5]。因本属植物种
类较多，不同地区欧贝来源的多样性及传统鉴定方
法的局限性，需深入进行整理鉴定工作。
随着分子生物学技术的快速发展，植物 DNA 序
列被大量应用于药材品种的分子鉴定，因其能准确、
快速鉴定物种，因此对于药材原植物鉴定、解决长
久以来原植物辨识错误的现状，具有极为明显的优
势[6-7]。其中植物核糖体 DNA 内转录间隔区（rDNA
ITS 区）序列进化速率较快，可提供较为丰富的变异
位点和信息位点[8-10]；叶绿体 psbA-trnH 非编码序列，
因其变异程度相对较高，变异显著且容易扩增，现已
被广泛用于分子鉴定[11-12]。对于亲缘极为相近的物种，
单一序列有时无法提供很好的分辨率，通过应用多个
基因片段区分，尝试多个分子标记相结合的办法，可
提供更全面的信息，使物种间的鉴别效率更高[6]。
本实验在民族植物学考察、经典分类学鉴定基
础上，采集欧贝完保、欧贝玛保、欧贝赛保、才温
基原植物，分别测定其 ITS、psbA-trnH 序列并分析
其差异，以期为藏药欧贝和才温的分子鉴定方法建
立提供基础资料。
1 材料
实验材料均为自采，其中毛瓣绿绒蒿从西藏自
治区藏药厂药材库房收集，产地为拉萨市堆龙德庆
县，同时取新鲜叶片经硅胶快速干燥，备用。药材
凭证标本经上海中医药大学赵志礼教授鉴定，存放
于上海中医药大学中药学院药用植物标本室，样品
信息见表 1。
2 方法
2.1 序列测定
在 CTAB 法[13]的基础上略做改进提取总 DNA。
ITS、psbA-trnH 序列的扩增引物分别参考 Yuan[14]
和 Sang[11]。ITS 序列引物分别为 YP1：5’-GGAAGT-
AGAAGTCGTAACAAGG-3’；YP4：5’-TCCTCCGC-
TTATTGATATGC-3’。PCR 条件为 95 ℃，5 min；
95 ℃，1 min，52 ℃，1 min，72 ℃，1.5 min，共
31 个循环；72 ℃，10 min。psbA-trnH 序列引物分
别为 PA：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’；
TH：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’。PCR
条件为 94 ℃，5 min；94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；
72 ℃，1.5 min；30 个循环, 72 ℃，7 min。扩增产
物送上海英骏生物技术有限公司纯化并测序
（Axygen 胶回收试剂盒，ABI 3730xl 型测序仪）。
2.2 序列数据分析
ITS 及 psbA-trnH 序列起止范围参考 GenBank
中罂粟科序列。所得序列输入计算机后，采用
MEGA5.0、MegAlign7.1.0（44）软件进行分析。
表 1 样品与凭证标本
Table 1 Samples and voucher specimens
样品 凭证标本号 采集地
毛瓣绿绒蒿 M. torquata 2011XZ003 西藏自治区藏药厂
2010LRH02-1 四川若尔盖辖曼乡草坡 全缘叶绿绒蒿（居群 1）M. integrifolia
2010LRH02-2 四川若尔盖辖曼乡草坡
2011XZ228-1 西藏拉萨夺底沟山坡草地 全缘叶绿绒蒿（居群 2）
2011XZ228-2 西藏拉萨夺底沟山坡草地
2010LRH01-1 四川若尔盖辖曼乡草坡
2010LRH01-2 四川若尔盖辖曼乡草坡
红花绿绒蒿 M. punicea
2010LRH01-3 四川若尔盖辖曼乡草坡
2010LRH03-1 西藏拉萨夺底沟山坡草地
2010LRH03-2 西藏拉萨夺底沟山坡草地
总状绿绒蒿 M. racemosa
2010LRH03-3 西藏拉萨夺底沟山坡草地
2011XZ219-1 西藏拉萨夺底沟山坡石缝
2011XZ219-2 西藏拉萨夺底沟山坡石缝
多刺绿绒蒿 M. horridula
2011XZ219-3 西藏拉萨夺底沟山坡石缝
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3 结果与分析
3.1 分类位置的确定
经标本的形态学观察与分类学鉴定，并查阅
中国科学院西北高原生物研究所标本馆相关标
本，确定欧贝完保基原植物为毛瓣绿绒蒿、欧贝
玛保基原植物为红花绿绒蒿、欧贝赛保基原植物
为全缘叶绿绒蒿，才温基原植物为总状绿绒蒿、
多刺绿绒蒿。
3.2 序列的获得
应用 PCR 产物直接测序的方法，获得各样本的
ITS、psbA-trnH 完整序列，各居群内部序列皆一致。
各序列长度见表 2。
表 2 ITS 及 psbA-trnH 序列长度
Table 2 Sequence lengths of ITS and psbA-trnH
物 种 ITS1 / bp 5.8 S / bp ITS2 / bp 总长 / bp psbA-trnH / bp
毛瓣绿绒蒿 251 162 252 665 248
全缘叶绿绒蒿 (居群 1) 251 162 250 663 245
全缘叶绿绒蒿 (居群 2) 251 162 249 662 251
红花绿绒蒿 254 162 252 668 242
总状绿绒蒿 252 162 250 664 238
多刺绿绒蒿 252 162 250 664 238

3.3 种间、居群间分辨率的评价
应用 ClustalW 软件对所有 ITS、psbA-trnH 序列
分别进行对位排列，MEGA 5.0 分析软件计算序列
变异值。
ITS 序列分析结果显示，任意 2 组序列比较，
除总状绿绒蒿与多刺绿绒蒿无位点差异，其余均有
位点变异情况，其中全缘叶绿绒蒿两个居群序列间
存在 11 个变异位点。K2P 遗传距离变异幅度为：0
（总状绿绒蒿与多刺绿绒蒿）、0.120（毛瓣绿绒蒿与
红花绿绒蒿）（表 3）。
psbA-trnH 序列分析结果显示，任意 2 组序列比
较时，均出现变异情况，其中全缘叶绿绒蒿 2 个居
群序列间存在 6 个变异位点。K2P 遗传距离变异幅
度为 0.026（全缘叶绿绒蒿居群 1 与居群 2；总状绿
绒蒿与多刺绿绒蒿）、0.109（毛瓣绿绒蒿与红花绿
绒蒿）（表 4）。
3.4 UPGMA 系统树
从 Genbank 下载罂粟科罂粟属虞美人 Papaver
rhoeas L. 序列为外类群（ITS 序列号 DQ912886；
psbA-trnH 序列号 JN584665），分别以 ITS 序列、
psbA-trnH 序列构建 UPGMA 系统树（Kimura
2-parameter 模型，bootstrap 1 000 次重复）。基于 ITS
序列的系统树显示，外类群首先区分开；其余，全
缘叶绿绒蒿 2 个居群聚在一起，多刺绿绒蒿和总状
绿绒蒿聚在一起，然后与红花绿绒蒿聚类，毛瓣绿
绒蒿单独为一支，见图 1。基于 psbA-trnH 序列的系
统树显示，外类群首先区分开；其余，全缘叶绿绒
蒿两个居群聚在一起，多刺绿绒蒿和总状绿绒蒿聚
在一起，然后与红花绿绒蒿聚为一大支，毛瓣绿绒
蒿单独为一支，见图 2。
表 3 6 个分类群 ITS 序列成对比较时的位点变异值（上三角：变异位点；下三角：遗传距离）
Table 3 Numbers of site mutations (above diagonal) and pairwise K2P genetic distance (below diagonal) of six taxa
based on ITS sequence
物 种 毛瓣绿绒蒿 全缘叶绿绒蒿 (居群 1) 全缘叶绿绒蒿 (居群 2) 红花绿绒蒿 总状绿绒蒿 多刺绿绒蒿
毛瓣绿绒蒿 — 66 62 72 70 70
全缘叶绿绒蒿 (居群 1) 0.108 — 11 42 41 41
全缘叶绿绒蒿 (居群 2) 0.101 0.017 — 42 42 42
红花绿绒蒿 0.120 0.067 0.067 — 44 44
总状绿绒蒿 0.116 0.065 0.067 0.070 — 0
多刺绿绒蒿 0.116 0.065 0.067 0.070 0 —
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表 4 6 个分类群 psbA-trnH 序列成对比较时的位点变异值（上三角：变异位点；下三角：遗传距离）
Table 4 Values of site mutations (above diagonal) and pairwise K2P genetic distance (below diagonal) of six taxa
based on psbA-trnH sequence
物 种 毛瓣绿绒蒿 全缘叶绿绒蒿 (居群 1) 全缘叶绿绒蒿 (居群 2) 红花绿绒蒿 总状绿绒蒿 多刺绿绒蒿
毛瓣绿绒蒿 — 23 22 24 21 15
全缘叶绿绒蒿 (居群 1) 0.104 — 6 12 14 19
全缘叶绿绒蒿 (居群 2) 0.100 0.026 — 14 14 20
红花绿绒蒿 0.109 0.053 0.062 — 15 21
总状绿绒蒿 0.095 0.062 0.062 0.067 — 6
多刺绿绒蒿 0.067 0.085 0.090 0.095 0.026 —


图 1 基于 ITS 序列构建的 UPGMA 系统发育树
Fig. 1 UPGMA systematic tree based on ITS sequences

图 2 基于 psbA-trnH 序列构建的 UPGMA 系统发育树
Fig. 2 UPGMA systematic tree based on psbA-trnH sequences
4 讨论
欧贝和才温类藏药来源于绿绒蒿属多个近缘
种，是重要的藏药品种，欧贝又分为欧贝完保等不
同品种，其主要治疗的病症各有差异[3]，因此品种
的正确鉴定对于安全用药具有重要的意义。在调研
中发现，实际用药和药厂收购中存在品种错误和混
乱的现象，因此，本实验收集不同品种欧贝和才温
类药材的 5 种基原植物，测定并分析其 ITS 和
psbA-trnH 序列，以期为本属藏药植物的分子鉴定提
供依据和基础工作。
植物 DNA 序列现被大量应用于药材的分子鉴
定，目前已成为植物分类和鉴定研究的热点[6]。对
于亲缘很近的物种，单一片段的分析存在局限性，
应用多个片段结合的方法可以获得更全面的信
息。本实验中，ITS 区序列分析显示，不同物种序
列间总体存在较多变异位点，但总状绿绒蒿和多刺
绿绒蒿的序列一致，结合叶绿体 psbA-trnH 序列可
有效将两者区分。同时，这两个片段对于全缘叶绿
绒蒿不同居群间有区分意义。基于两种序列的系统
树均分为两支，一支为毛瓣绿绒蒿（具盘绿绒蒿亚
属），其他 4 种（绿绒蒿亚属）聚为一支，与传统分
类学观点完全一致。利用多片段相结合，如双亲遗
传的核基因序列和母系遗传的叶绿体基因序列相结
合，可使对物种的鉴别效率更高。
总状绿绒蒿与多刺绿绒蒿的主要区别在于前者
具高的茎，茎除上部外均具叶，有时有基生花葶混
生，《西藏植物志》将其处理为多刺绿绒蒿的变种
Meconopsis horridula Hook. f. et Thoms. var.
racemosa (Maxim.) Prain[15]。在野外观察及标本查阅
中发现，多刺绿绒蒿极少，典型的总状绿绒蒿具单
一且高的总状花序，较易鉴别，有些个体的总状花
序短且混生有大量基生花葶，与多刺绿绒蒿极为
相似。本实验中，两者的 ITS 区序列完全一致，
psbA-trnH 序列有差异，但因两个物种分别采自不同
的生境，不确定是否为环境影响导致位点变异。下
一步需加大样本量，选取更多的序列进行比较分析。
根据文献报道[2]，欧贝的传统药用部位为花。
但调研中发现，因环境破坏、过量采挖等影响，绿
全缘叶绿绒蒿 (居群 1)
全缘叶绿绒蒿 (居群 2)
总状绿绒蒿
多刺绿绒蒿
红花绿绒蒿
毛瓣绿绒蒿
虞美人
0.06 0.04 0.02 0
遗传距离

全缘叶绿绒蒿 (居群 1)
全缘叶绿绒蒿 (居群 2)
红花绿绒蒿
总状绿绒蒿
多刺绿绒蒿
毛瓣绿绒蒿
虞美人
0.06 0.04 0.02 0
遗传距离
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绒蒿属资源量日益减少。为满足市场药材需求，现
大多采用整个地上部分入药。对这些珍贵的藏药资
源，在开发利用的同时，应进行有效保护。
欧贝为典型的多来源藏药，品种较多，来源复
杂。根据文献报道[3]，欧贝完保的正品来源为五脉
绿绒蒿，毛瓣绿绒蒿作为代用品。根据调研，现拉
萨地区欧贝完保的主流品种来源为毛瓣绿绒蒿。因
自然、人为等多方面因素影响，现今藏药品种与传
统来源存在差异，需结合文献和实际调研进行整理
考证。
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