全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 9 期 2016 年 5 月

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• 药材与资源 •
ITS2 条形码序列对海南大戟科植物的鉴定
李 栎 1，徐腊红 2，唐历波 1*
1. 海南医学院理学院，海南 海口 571101
2. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275
摘 要：目的 利用 DNA 条形码技术评估 ITS2 序列对海南大戟科植物的鉴定能力。方法 利用 PCR 测序法，对供试样本
ITS2 片段进行双向测序，所得序列经 Codon Code Aligner 拼接后，利用 MEGA 6.0 进行相关数据分析，构建邻接（NJ）树。
利用 TAXON DNA 软件分析序列种内、种间变异并作 barcoding gap 分析。从 ITS2 数据库中获得供试样本的预测 ITS2 二级
结构。结果 大戟科供试样本 ITS2 序列中变异位点与信息位点分别占总序列长度的 84%和 69.67%。供试各种在构建的 NJ
树中均各自成束，表现出单系性；基于 ITS2 序列的种内最大变异距离值 0.067 3；种间最小变异距离值 0.119 1，各 ITS2 二
级结构种内无明显差异；种间存在明显差异。结论 所得 ITS2 条形码序列对海南大戟科植物鉴定能力强，可作为 DNA 条
形码序列对海南大戟科植物进行快速鉴定。
关键词：大戟科；ITS2；DNA 条形码；鉴定；PCR 测序
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)09 - 1572 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.09.021
Identification of plants in Euphorbiaceae in Hainan by ITS2 barcoding sequence
LI Li1, XU La-hong2, TANG Li-bao1
1. College of Science, Hainan Medical University, Haikou 571101, China
2. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
Abstract: Objective To evaluate the ability of ITS2 region as a DNA barcode for identifying the plants in Euphorbiaceae in Hainan.
Methods The ITS2 of ribosomal DNA was amplified and sequenced by bidirectional sequencing of PCR products. Sequence
assembly and consensus sequence generation were performed by using Codon Code Aligner. Phylogenetic study was performed using
software MEGA 6.0 in accordance with Kimura-2-parameter (K2P) model, and the phylogenetic tree was constructed by using the
Neighbor-joining (NJ) method. The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 Database server. The distribution of
intra-versus inter-specific variability was compared using DNA bar coding gaps. Results The variable sites and the informative sites
were accounted for 84% and 69.67% of the ITS2 regions length. In the cluster dendrogram, all species showed monophyletic. The
maximum intra-specific distance was 0.067 3, and the minimum inter-specific distance was 0.119 1. There was significant bar coding
gap between intra-specific and inter-specific variation. To compare the ITS2 secondary structure, we noticed that it had no obvious
distinguishment of intra-specific, while had obvious distinguishment of inter-specific. Conclusion ITS2 sequence can be used as a
DNA barcode for the rapid identification of the plants in Euphorbiaceae in Hainan.
Key words: Euphorbiaceae; ITS2; DNA bar coding; identification; bidirectional sequencing of PCR products

大戟科（Euphorbiaceae）是被子植物中的一个
大科，约 300 属，8 000 种以上；除北极及寒冷的
高山带以外，遍布全球；中国有 66 属 864 种[1]，主
要分布在西南、华南；是热带和亚热带植物区系中的
重要组成部分[2]。海南大戟科植物包含了粮食作
物木薯，战略植物橡胶树，能源植物麻风树、油
桐；药用植物巴豆和大戟等约 46 属 139 种（不含栽
培种）[3]。大戟科植物多数种类有毒，许多植物因为

收稿日期：2015-12-29
基金项目：海南省 2013 自然科学基金项目（813190）
作者简介：李 栎（1978—），女，博士，副教授，研究方向为植物 DNA 条形码。Tel: 18689877322 E-mail: liliml@163.com
*通信作者 唐历波 Tel: (0898)66893739 E-mail: 764825978@qq.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 9 期 2016 年 5 月

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其毒性或药用价值被人们所熟知，如巴豆 Croton
tiglium L.、大戟 Euphorbia pekinensis Rupr.、泽漆
Euphorbia helioscopia L.、甘遂Euphorbia kansui T. N.
Liou ex S. B. Ho、续随子Euphorbia lathyris L.、蓖麻
Ricinus communis L. 等[4]。因此对寻求准确快速的鉴定
大戟科植物的方法显得尤为重要。一直以来，对大戟
科的分类处理争议众多，实验研究很不充分。基于形
态学的分类将大戟科分为 4 个亚科叶下珠亚科
（ Phyllanthoideae Ascherson ） 、 铁 苋 菜 亚 科
（Acalyphoideae Ascherson）、巴豆亚科（Crotonoideae
Pax）、大戟亚科（Euphorbioideae）[5]。在传统形态分
类基础上，有人通过花粉亚显微形态特征、核型以及
保守基因序列分析[6-8]等方法对该科植物分类进行了探
索性研究，取得了一定的进展。但是目前对于大戟科
分类研究仍然缺乏一个能被普遍接受的分类系统。
2003年由加拿大动物学家Hebert等[9]首次提出的
DNA 条形码技术，给人们对生物分类的研究提供了
新的方法。这一技术利用基因组中一段公认的标准
短序列来进行物种鉴定的分子诊断；与传统分类学
方法相比 DNA 条形码技术不依赖标本的形态特征
也能对其实现正确鉴定。截止目前，研究者们已经提
出了 10 多条植物候选 DNA 条形码序列[10-16]，并在不
同的类群中对各条形码的鉴定能力进行了考察。其
中，ITS2 被有些研究者提出可作为药用植物鉴定的标
准条形码序列[17-19]，但 ITS2 对植物分类鉴定的效率
仍缺少在更大样本量中的验证。本研究选取采自海南
地区的大戟科植物 25 个种 56 个样品评估 ITS2 序列
作为 DNA 条形码对海南大戟科植物的鉴定能力。
1 材料与方法
1.1 材料
以采自海南地区的大戟科植物 25 个种 56 个样
品为实验材料。由海南医学院唐历波教授鉴定，数
字影像信息及凭证标本保存于海南医学院理学院动
物学与植物学教研室。实验材料来源详见表 1。
表 1 样本来源
Table 1 Sources of samples
序号 中文名 拉丁学名 产地 标本号
1 巴豆 Croton tiglium 乐东尖峰岭 HPS-061-MT02
2 白饭树 Flueggea virosa 乐东尖峰岭 HPS-083-MT01
3 白饭树 儋州研究院 HPS-083-MT02
4 山地五月茶 Antidesma montanum 兴隆热带植物园 HPS-102-MT01
5 山地五月茶 兴隆热带植物园 HPS-102-MT02
6 山地五月茶 儋州研究院 HPS-102-MT03
7 叶象花 Euphorbia heterophylla 儋州研究院 HPS-131-MT01
8 叶象花 兴隆热带植物园 HPS-131-MT02
9 闭花木 Cleistanthus sumatranus 兴隆热带植物园 HPS-187-MT01
10 锡兰叶下珠 Phyllanthus mytifolius 兴隆热带植物园 HPS-197-MT01
11 红桑 Acalypha wikesiana 海口海南医学院校园 HPS-303-MT01
12 红桑 海口海南医学院校园 HPS-303-MT02
13 红桑 海口火山口 HPS-303-MT03
14 变叶木 Codiaeum variegatum 海口海南医学院校园 HPS-304-MT01
15 变叶木 海口海南医学院校园 HPS-304-MT02
16 变叶木 海口火山口 HPS-304-MT03
17 红背桂 Excoecaria cochinchinensis 海口海南医学院校园 HPS-305-MT01
18 红背桂 海口火山口 HPS-305-MT03
19 蓖麻 Ricinus communis 海口海南医学院校园 HPS-306-MT01
20 蓖麻 海口火山口 HPS-306-MT02
21 蓖麻 海口海南医学院校园 HPS-306-MT03
22 木薯 Manihot esculenta 海口红旗镇 HPS-308-MT01
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续表 1
序号 中文名 拉丁学名 产地 标本号
23 木薯 海口火山口 HPS-308-MT02
24 木薯 海口火山口 HPS-308-MT03
25 白背叶 Mallotus apelta 海口火山口 HPS-310-MT01
26 白背叶 海口红旗镇 HPS-310-MT02
27 白背叶 海口海南医学院校园 HPS-310-MT03
28 麻风树 Jatropha carcas 海口火山口 HPS-311-MT01
29 麻风树 海口火山口 HPS-311-MT02
30 麻风树 海口红旗镇 HPS-311-MT03
31 毛果算盘子 Glochidion puberum 海口火山口 HPS-312-MT01
32 毛果算盘子 海口火山口 HPS-312-MT02
33 油桐 Vernicia fordii 海口火山口 HPS-314-MT01
34 油桐 海口火山口 HPS-314-MT02
35 乌桕 Sapium sebiferum 海口火山口 HPS-315-MT01
36 一品红 Euphorbia pulcherrima 海口海南医学院校园 HPS-316-MT01
37 一品红 海口海南医学院校园 HPS-316-MT02
38 一品红 海口火山口 HPS-316-MT03
39 大飞扬草 Euphorbia hirta 海口金牛岭 HPS-317-MT02
40 大飞扬草 海口火山口 HPS-317-MT03
41 绿玉树 Euphorbia tirucalli 海口金牛岭 HPS-318-MT01
42 绿玉树 海口金牛岭 HPS-318-MT02
43 绿玉树 海口金牛岭 HPS-318-MT03
44 龙骨 Euphorbia trigona 海口金牛岭 HPS-319-MT01
45 龙骨 海口金牛岭 HPS-319-MT02
46 春峰 Euphorbia lactea f. cristata 海口金牛岭 HPS-320-MT01
47 春峰 海口金牛岭 HPS-320-MT02
48 虎刺梅 Euphorbia splendens 海口金牛岭 HPS-321-MT01
49 虎刺梅 文昌东郊椰林 HPS-321-MT02
50 虎刺梅 文昌东郊椰林 HPS-321-MT03
51 红雀珊瑚 Pedilanthus tithymaloides 文昌东郊椰林 HPS-322-MT01
52 红雀珊瑚 文昌东郊椰林 HPS-322-MT02
53 红雀珊瑚 文昌东郊椰林 HPS-322-MT03
54 木奶果 Baccaurea ramilflora 兴隆热带植物园 HPS-501-MT01
55 全缘叶珊瑚 Viburnum awabuki 兴隆热带植物园 HPS-502-MT01
56 全缘叶珊瑚 兴隆热带植物园 HPS-502-MT02

1.2 方法
取变色硅胶（青岛海洋化工有限公司）干燥的
叶片，利用 DNA 球磨仪（Retsch MM300，德国）
研磨 30 s（2 000 r/min）。采用植物基因组 DNA 提
取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）提取总
DNA。PCR 扩增测序引物一致，正向为 5’-GCGAT-
ACTTGGTGTGAAT-3’，反向为 5’-GACGCTTCTC-
CAGACTACAAT-3’（引物的合成由上海生工生物工
程股份有限公司完成）。PCR 反应体系为 25 μL，
体系包括 MgCl2 2 μL（25 mmol/L），dNTP 2 μL
（2.5 mmol/L），PCR 缓冲液 2.5 μL，引物各 1.0 μL
（2.5 μmol/L）（生工生物工程股份有限公司，中
国），聚合酶 1.0 U（博彩生物科技有限公司，中
国），总 DNA 1 μL（约 30 ng）。扩增程序：94 ℃，
变性 5 min；94 ℃变性 30 s；56 ℃退火 30 s；72
℃延伸 45 s（进行 40个循环）；72 ℃延伸 10 min[7]。
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使用的 PCR 仪为 promega M7501 PCR Master Mix
10 reactions TAQ。PCR 扩增产物的测序工作由深圳
华大基因生物医学工程有限公司完成。测序峰图经
Codon Code Aligner 拼接后，利用 MEGA 6.0 进行相
关数据分析，并构建邻接（NJ）树。利用 TAXON
DNA 软件分析序列种内、种间变异并作 bar coding
gap分析。从 http://its2.bioapps.biozentrum. uniwu
erzburg.de/获得供试样本的预测 ITS2 二级结构。具
体方法参考文献方法[20]。
2 结果与分析
2.1 DNA 模板及 PCR 扩增效率、测序成功率
本实验 56 份样本中提取的 DNA，获得较高质
量 DNA 序列占 42.4%。56 份 DNA 样品进行扩增，
扩增成功率为 95.2%；扩增产物测序成功率为
93.3%，即序列获得率 88.8%。
2.2 序列长度和变异系数分析
用 MEGA 6.0 软件对所得序列进行比对分析，
比较不同序列变异位点数与信息位点数。结果表明，
ITS2 序列长度 199～229 bp，全序列排序比对长度
为 300 个位点，其中有 252 个变异位点，209 个简
约信息位点，分别占总序列长度的 84%和 69.67%。
2.3 种内、种间变异距离值及 barcoding gap 分析
应用MEGA 6.0软件基于K2P距离模型计算供试
样本种内、种间变异距离值，结果表明供试样本最大
种内变异距离值为 0.067 3；最小种间变异距离值为
0.119 1。再通过 TAXON DNA 软件做 barcoding gap
图（图 1）。从图 1 中可以看出 ITS2 序列种内、种间
变异的分布情况，种内变异和种间变异分布呈两边开
的趋势，存在明显的 barcoding gap。此结果表明，ITS2
序列对供试样本在种水平的鉴定能力较强。另外从图
1 中可以发现种间变异距离值在 0.15～0.35、0.90～
1.28 出现 2 个密集区间，进一步分析这 2 个区间发现：
0.15～0.35 这一区间主要是由巴豆亚科与大戟亚科、



图 1 56 个供试样本基于 ITS2 序列的 barcoding gap
Fig. 1 Bar coding gap of ITS2 sequence for 56 samples
巴豆亚科与铁苋菜亚科的种间变异距离值组成，而
0.90～1.28 主要由叶下珠亚科与大戟科另外 3 个亚科
之间的种间变异距离值组成。
用 MEGA 6.0 软件对 ITS2 基因进行序列比对和
系统发育分析，结果见图 2，供试的 25 个种 56 个样
本被分为 2 分支（I 和 II）。分支 I 中包括 17 个种 41
个样本，分支 II 包括 8 个种 15 个样本，从图 2 中可
以看出 ITS2 序列对供试的 25 个种 56 个样本在种的
水平上能很好地分开，鉴定成功率达 100%。
2.4 ITS2 的二级结构分析
根据 ITS2 数据库（http://its2.bioapps.biozentrum.
uni-wuerzburg.de/）所预测的供试样本 ITS2 二级结
构结果可以看出所有物种的二级结构均由 1 个中心
环及 4 个螺旋区构成，每个螺旋上又有或多或少的
大小不一的茎、环结构（图 3）。在比较样本中各

图 2 基于 ITS2 序列构建的 56 个样本的 NJ 树
Fig. 2 NJ Dendrogram of 56 species based on ITS2 sequences
0.0
0～
0.0
1
0.0
5～
0.0
7
0.1
0～
0.1
5
0.2
0～
0.2
5
0.3
0～
0.3
5
0.4
0～
0.4
5
0.5
0～
0.5
5
0.6
0～
0.6
5
0.7
0～
0.7
5
0.8
0～
0.8
5
0.9
0～
0.9
5
1.0
0～
1.0
5
1.1
0～
1.1
5
1.2
0～
1.2
5
1.3
0～
1.3
5

变异距离值
80
60
40
20
10
0
百
分
比
/%


种内变异
种间变异
28
30
29
55
56
16
14
15
24
22
23
19
21
20
26
25
27
41
42
43
7
8
44
45
51
52
53
1
17
18
5
4
6
33
34
39
40
35
2
3
31
32
10
11
12
13
9
54
46
47
48
49
37
36
38
I
II
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种种内 ITS2 二级结构时发现，红背桂、白背叶、大
飞扬草、蓖麻、一品红、绿玉树、春峰、红雀珊瑚、
麻风树的种内 ITS2 二级结构在各螺旋区长度、茎环
数目、大小、位置以及各螺旋之间的夹角等方面基本
相同；红桑种内 2 样本 ITS2 二级结构差异主要表现
在螺旋 I 区和螺旋 III 区，螺旋 II 区和螺旋 IV 区较保
守；变叶木 2 样本 ITS2 二级结构在螺旋 IV区较保守，
在螺旋 I 区、螺旋 II 区和螺旋 III 区均存在差异；龙
骨 2 样本 ITS2 二级结构在螺旋 I 区、螺旋 II 区和螺
旋 III 区较为保守，在螺旋 IV 区有较小差异。
在比较样本种间 ITS2 二级结构时发现，种间
ITS2二级结构在中心环大小及 4个螺旋区结构上均
存在明显差异。因此，通过 ITS2 二级结构，可以将
供试样本中的各个种直观地鉴别出来。
1 2
E. cochinchinensis Lour
3 4
M. apelta (Lour.)
5 6
E. hirta L.

7 8 9
R. communis L. E. pulcherrima Willd
10 11 12
E. tirucalli
13 14
E. lactea f.cristata
15 16
P. tithymaloides
17 18
19 20 21
J. carcas L.

22 23
A. wikesiana C. variegatum
24 25
E. trigona
26 27
1、2-红背桂 3、4-白背叶 5、6-大飞扬草 7～9-蓖麻 10～12-一品红 13、14-绿玉树 15、16-春峰 17、18-红雀珊瑚
19～21-麻风树 22、23-红桑 24、25-变叶木 26、27-龙骨
1, 2-Excoecaria cochinchinensis 3, 4-Mallotus apelta 5, 6-Euphorbia hirta 7—9-Ricinus communis 10—12-Euphorbia pulcherrima
13, 14-Euphorbia tirucalli 15, 16-Euphorbia lactea f.cristata 17, 18-Pedilanthus tithymaloides 19—21-Jatropha carcas
22, 23-Acalypha wikesiana 24, 25-Codiaeum variegatum 26, 27-Euphorbia trigona
图 3 ITS2 序列预测二级结构图
Fig. 3 Comparison on ITS2 secondary structure
3 讨论
DNA 条形码技术旨在建立一种准确、方便、快
捷且对形态学分类技术要求不高的一种生物分类鉴
定方法。这一技术方法的建立必须基于大量样本对
DNA 条形码鉴定能力的测定与评估。虽然近年来国
内外学者在这方面做了不少的工作，但样本的数量
还远远不够。本研究通过海南地区基于形态学上的
大戟科植物 25 个种 56 个样本评估 ITS2 序列作为
DNA 条形码对海南大戟科植物的鉴定能力。
本研究的结果显示变异位点与简约信息位点在
.

9 0 11 12
1 14 1 16 1
.
2
2 4 5
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ITS2 序列中均占较高的比例，说明 ITS2 序列中存
在大量的物种分类进化信息，因此，ITS2 序列适于
对大戟科植物在种的水平上进行鉴定。在对种间的
遗传距离进行分析时发现，较大种间变异距离值主
要由叶下珠亚科与大戟科另外 3 个亚科之间产生，
此结果揭示了叶下珠亚科与其他 3 个亚科之间在亲
源关系上距离较远。
综合种内、种间的变异距离值、barcoding gap
分析、NJ 树构建及 ITS2 序列预测二级结构图分析
等方法从多方面对 ITS2 条形码序列对海南大戟科
植物鉴定能力进行了分析鉴定，结果均显示 ITS2
条形码序列对海南大戟科植物在种的水平上鉴定能
力强，可作为 DNA 条形码序列对海南大戟科植物
进行快速鉴定。另外，在 DNA 提取量少与完整性
不好的情况下，ITS2 序列也能获得并扩增，且不影
响鉴定效果。因此在利用 ITS2 条形码序列鉴定植物
时，对实验室的条件及操作者要求均不高，从而有
利于该技术的广泛推广与应用。
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