全 文 ：易混伪品刺果甘草与甘草、苦参和黄芪原植物的ＩＴＳ２序列鉴定
　收稿日期：２０１３－０２－２８
赵月梅１，侯香莲２
（１．商洛学院生物医药工程系，陕西 商洛　７２６０００；２．国家林业局昆明勘察设计院，云南 昆明　６５０２１６）
摘　要：刺果甘草属于甘草属，根在市场上常作为甘草、苦参和黄芪的伪品。笔者用ＩＴＳ２序列来区分它们的
基源植物，根据其药材的来源笔者研究选用了１２条（３属６种）ＩＴＳ２序列，用 ＭＥＧＡ４．０计算种间的Ｋ２Ｐ距
离并基于该距离建立了ＮＪ系统树，结果表明种间最小的 Ｋ２Ｐ距离（０．０２８８８０）大于种内最大的 ＫＳＰ距离
（０．００８０８１），构建的系统发育ＮＪ树显示刺果甘草与苦参、黄芪和甘草可明显分开，其中甘草的不同来源的三
种植物也聚为了一支。表明基于ＤＮＡ条形码的ＩＴＳ２序列可区分甘草、苦参、黄芪和其常见伪品刺果甘草。
关键词：ＩＴＳ２；刺果甘草；甘草；苦参；黄芪；ＤＮＡ条形码
　　刺果甘草来源于豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）植物刺果
甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｐａｌｌｉｄｉｆｌｏｒａ　Ｍａｘｉｍ）的干燥根
及根茎，主要用作清热燥湿、杀虫药［１］。分布于我
国东北、华北、陕西、山东、江苏等地，由于形态相
似，市场上常与甘草、苦参、黄芪等药材相混淆。目
前已有不少基于各种不同的方法对作为伪品的刺
果甘草和与其相混淆的药材进行了相关研究：曹海
和曹谷珍等在原植物形态，药材性状，粉末特征和
理化鉴定等几方面的特征区分了刺果甘草和苦参，
虞文妹［２］在此基础上用薄层色谱法进一步对二者
予以鉴别，王智勇和陈伟［３］对刺果甘草和黄芪在生
药上的性状，显微和理化方面鉴别，黄冬兰等［４］用
红外光谱的三级鉴定法快速鉴定了刺果甘草和黄
芪，阿依古丽·塔西［５］用傅里叶变换红外（ＦＴＩＲ）
光谱法并结合二维相关（Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｏｒｒｅ－
ｌａｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）分析技术分别对甘草和伪品刺
果甘草进行了无损快速鉴别。
植物ＤＮＡ条形码就是利用一个或少数几个
标准的 ＤＮＡ 片段快速、准确识别和鉴定植物
种［６］，其通用性强，稳定性和重复性高，有统一的
操作标准和鉴定流程，不受被检测对象形态特征
及发育阶段所限。已成为近年来生物分类学研究
的热点之一和物种鉴定的一种有力工具。植物条
形码片段的筛选受到各种因素的制约，例如引物
通用性，扩增和测序的难易以及某片段在特定植
物中可能存在缺失等，因此，不同的学者提出了不
同的片段组合［７－９］，陈士林等提出提出ＩＴＳ２序列
可以作为药用植物的候选条形码并在多种药材及
其伪品中得到了很好的验证［１０－２１］。ＩＴＳ２序列
短，一般为２００ｂｐ左右，容易被成功扩增和测序，
甚至对一些降解的药材及粉末也能进行分析［２２］。
本研究利用ＩＴＳ２条形码对常见伪品刺果甘草基
源植物及易与其混淆的正品甘草，苦参，黄芪等进
行了比较研究，旨为该药材的质量控制及临床安
全用药提供分子鉴定依据。
１　材料和方法
１．１　材料来源
所用ＩＴＳ２序列均从Ｇｅｎｂａｎｋ下载，下载序
列的信息见表１。
表１　ＧｅｎＢａｎｋ下载序列信息
序号特征 物种中文名 物种拉丁学名 ＧｅｎＢａｎｋ登录号
１ 甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　 ＪＦ７７８８６９．１
２ 甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　 ＪＦ４２１５０３．１
３ 甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｕｒａｌｅｎｓｉｓ　 ＪＦ４２１５０４．１
４ 胀果甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｉｎｆｌａｔａ　 ＪＦ７７８８６８．１
５ 光果甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｇｌａｂｒａ　 ＪＦ７７８８６７．１
６ 刺果甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｐａｌｌｉｄｉｆｌｏｒａ　 ＥＵ５９１９９８．１
７ 刺果甘草 Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｐａｌｌｉｄｉｆｌｏｒａ　 ＧＱ２４６１３０．１
８ 苦参 Ｓｏｐｈｏｒａ　ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ　 ＪＦ２７９４４９．１
９ 苦参 Ｓｏｐｈｏｒａ　ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ　 ＧＵ２１７６０１．１
１０ 黄芪 Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ　 ＪＸ０１７３３２．１
１１ 黄芪 Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ　 ＪＸ０１７３３０．１
１２ 黄芪 Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ　 ＪＸ０１７３２８．１
·８３· 陕　西　农　业　科　学 ２０１３（５）
１．２　序列分析
所有数据使用基于隐马尔可夫模型的 ＨＭ－
Ｍｅｒ注释方法进行分析，去除两端５．８Ｓ和２６Ｓ
区段，获 得 ＩＴＳ２ 间 隔 区 序 列［２３］，用 Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ２．０［２４］进行序列比对分析，用ＭＥＧＡ４．０［２５］计算
种内、种间的遗传距离，基于Ｋ２Ｐ双参数模型，用
ＮＪ法（１　０００次重复ｂｏｏｔｓｔｒａｐ检验各分支的支持
率）将比对过的序列构建系统发育树以便直观鉴
定各物种［１０］。
２　结果
２．１　种内、种间序列比对分析
比对后ＩＴＳ２序列矩阵的长度为２３２ｂｐ，有
７４ｂｐ的变异，另有２５ｂｐ插入缺失。其中三条甘
草序列和一条胀果甘草和一条光果甘草序列均为
２２５ｂｐ，两条苦参序列为２２４ｂｐ，三条黄芪序列和
一 条 刺 果 甘 草 （Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｐａｌｉｄｉｆｌｏｒａ
ＧＱ２４６１３．１）序列为２１８ｂｐ，另一条刺果甘草
（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ　ｐａｌｉｄｉｆｌｏｒａ　ＥＵ５９１９９．１）序列为２２１
ｂｐ，变异多发生在种间，但种内也出现一些变异：
苦参样品在１９１位点、黄芪在９４位、２１４位各有
一个碱基变异。如图１所示。
２．２　刺果甘草与甘草、苦参和黄芪的 Ｋ２Ｐ遗传
距离分析
　　由于聚类分析时甘草的三个基源即甘草、胀
果甘草和光果甘草聚为一支且三者均作为甘草的
基源植物，所以将三者作为一个整体甘草，与刺果
甘草，苦参和黄芪的序列进行比对，来计算种间的
Ｋ２Ｐ距离。种间最小Ｋ２Ｐ距离（０．０２８８８０）大于
种内最大Ｋ２Ｐ距离（０．００８０８１），因此ＩＴＳ２序列
能够识别刺果甘草原植物和苦参，甘草黄芪等药
材。如表２所示。
图１　甘草 苦参 黄芪和刺果甘草种内种间ＩＴＳ２序列比对
表２　甘草 苦参 黄芪和刺果甘草种内种间Ｋ２Ｐ距离统计（括号内为种内距离）
１　 ２　 ３　 ４
１．刺果甘草（０．００００００）
２．甘草（０．００８０８１） ０．０２８８８０
３．苦参（０．００４４７９） ０．３５３５０５　 ０．３７２６６２
４．黄芪（０．００６１５９） ０．２５５７７９　 ０．２７８８２４　 ０．３３８６２４
·９３·赵月梅等：易混伪品刺果甘草与甘草、苦参和黄芪原植物的ＩＴＳ２序列鉴定
２．３　聚类分析
从系统聚类树中，可以看出中药甘草的三个
基原植物聚为一支，支持率为９８，刺果甘草与甘
草本为同属植物，亲缘关系最近，苦参与黄芪区分
也很明显，因此基于ＩＴＳ２序列的 Ｋ２Ｐ模型系统
聚类树能够将刺果甘草与甘草、苦参和黄芪成功
地区分开。见图２。
图２　基于Ｋ２Ｐ模型的ＩＴＳ２序列的ＮＪ系统发生树
（ｂｏｏｔＳｔｒａｐ　１　０００次重复，枝上数值仅显示自展支持率＞５０％）
３　讨论
笔者分析了刺果甘草与甘草，苦参，黄芪基原
植物编码核糖体ＲＮＡ的核基因的ＩＴＳ２序列的
Ｋ２Ｐ距离，并基于 Ｋ２Ｐ距离建立了系统进化树，
均证明ＩＴＳ２序列可以准确鉴定这几种药材及不
同基原植物，为甘草等药材及其混伪品的鉴别提
供了新的分子水平的研究方法。从系统进化树可
以看出：作为不同属的植物，刺果甘草与苦参和黄
芪分支很明显，分别都有１００的支持率，作为同属
植物，刺果甘草与甘草也可很好的区分开，甘草药
材的三个基源植物完整的聚在一起，支持率为
９８，Ｋ２Ｐ距离也与系统进化树结果吻合。上述结
果均符合植物系统分类顺序，也可以证明ＩＴＳ２
序列可以作为甘草，苦参，黄芪等药材与易混伪品
刺果甘草药的一种分子鉴定方法，具有一定应用
价值，同时也为ＤＮＡ条形码技术在中药鉴定提
供了有力的依据。
参 考 文 献：
［１］　曹海，曹谷珍．苦参及其混淆品刺果甘草的生药学
初步研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００４，１５（５）：２７９－２８０．
［２］　虞文妹．苦参与伪品刺果甘草的鉴别［Ｊ］．内蒙古中
医药，２００９，２８（１４）：４４．
［３］　王智勇，陈伟，黄芪与其伪品－刺果甘草根的鉴别
［Ｊ］．黑龙江医药科学，１９９９，２２（４）：８７．
［４］　黄冬兰，孙素琴，徐永群等二维相关红外光谱法与
黄芪及其伪品刺果甘草的分析与鉴定［Ｊ］．光谱学与
光谱分析，２００９，２９（９）：２　３９６－２　４００．
［５］　阿依古丽．塔西，周群，董晓鸥等，甘草真伪品的ＦＴ－
ＩＲ光谱法鉴别研究［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００６，
２６（７）：１　２３８－１　２４１．
［６］　Ｋｒｅｓｓ　ＷＪ，Ｗｕｒｄａｃｋ　ＫＪ，Ｚｉｍｍｅｒ　ＥＡ，ｅｔ　ａｌ．ｕｓｅ　ｏｆ
ＤＮＡ　ｂａｒｃｏｄｅｓ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｒｏ－
ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ，
２００５，１０２（２３）：８　３６９－８　３７４．
［７］　Ｃｈａｓｅ　ＭＷ，Ｓａｌａｍｉｎ　Ｎ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｄ
ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｂａｒｃｏｄｅｓ：ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ　ａｎｄ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ
ｇｏａｌｓ［Ｊ］．Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ
Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，３６０（１４６２）：１
８８９－１　８９５．
［８］　Ｋｒｅｓｓ　ＷＪ，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　ＤＬ，Ａ　ｔｗｏ－ｌｏｃｕｓ　ｇｌｏｂａｌ　ＤＮＡ
ｂａｒｃｏｄｅ　ｆｏｒ　ｌａｎｄ　ｐｌａｎｔｓ：ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｂｃＬ　ｇｅｎｅ　ｃｏｍ－
ｐｌｅｍｅｎｔｓ　ｔｈｅ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ｔｒｎＨ－ｐｓｂＡ　ｓｐａｃｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ
［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２００７，２（６）：ｅ５０８
［９］　Ｌａｈａｙｅ　Ｒ，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂａｎｋ　Ｍ，Ｂｏｇａｒｉｎ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．，ＤＮＡ
ｂａｒｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｌｏｒａｓ　ｏｆ　ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｈｏｔｓｐｏｔｓ［Ｊ］．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
２００８，１０５（８）：２　９２３－２　９２８）
［１０］　Ｓｈｉｌｉｎ　ｃｈｅｎ，Ｈｕｉ　Ｙａｏ，Ｊｉａｎｐｉｎｇ　Ｈａｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｖａｌｉｄａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＴＳ２Ｒｅｇｉｏｎ　ａｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ＤＮＡ　ｂａｒｃｏｄｅ
ｆｏｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＰＬＯＳ
ＯＮＥ，２０１０，５（１）：ｅ８６１３．
［１１］　刘义梅，陈倩，陈科力等，ＩＴＳ２序列鉴定青葙子及
其混淆品［Ｊ］．湖北大学学报（自然科学版），２０１１，
３３（３）：３０９－３１２
［１２］　刘义梅，罗焜，陈科力等，ＩＴＳ２序列鉴定小茴香及
其常见混伪品［Ｊ］．环球中医药，２０１１，４（４）：２６０－
２６３．
（下转第４９页）
·０４· 陕　西　农　业　科　学 ２０１３（５）
表３　春梢方差分析
变异来源 平方和 自由度 均 方 Ｆ值 显著水平
区组间 ５３．４８７７　 ３　 １７．８２９２　 １．０６８　 ０．３９２０
处理间 ２３９．２１７１　 ５　 ４７．８４３４　 ２．８６７　 ０．０５１９
误 差 ２５０．３１４９　 １５　 １６．６８７７
总变异 ５４３．０１９６　 ２３
表４　秋梢方差分析
变异来源 平方和 自由度 均 方 Ｆ值 显著水平
区组间 ８０．８１１　４　 ３　 ２６．９３７１　 １．８０３　 ０．１８９９
处理间 １３２．６５２　２　 ５　 ２６．５３０４　 １．７７６　 ０．１７８５
误 差 ２２４．１０６　３　 １５　 １４．９４０４
总变异 ４３７．５６９　９　 ２３
５．２　药剂评价
试验药剂５５％丙森·醚菌酯 ＷＧ对苹果斑
点落叶病有优良的防治效果。供试药剂５５％丙
森·醚菌酯 ＷＧ１　５００倍处理优于７０％丙森锌
６００倍（ＣＫ）、１０％ 苯醚甲环唑 ＥＷ　１　５００ 倍
（ＣＫ）、３０％醚菌酯 ＷＰ２　０００倍（ＣＫ）防效优，用
量经济，对作物安全，在生产中有一定的推广应用
前景，推荐使用剂量为３６６．７ｍｇ／ｋｇ。
秋梢、全生育期防治效果相对较差，主要由于
气候因素影响所致，７月、９月降水量明显高于同
比，温度偏低，对防治效果产生一定的不利影响。
注意事项：
①发病初期及时喷药，预防是重点；②多雨年
份用药次数保证６次以上，间隔期１０－１５ｄ，以保
证防效
櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨
。
（上接第４０页）
［１３］　孙稚颖，陈士林，姚辉等，基于ＩＴＳ２序列的羌活及
其混伪品的 ＤＮＡ条形码鉴定［Ｊ］．中草药，２０１２，
４３（３）：５６８－５７１．
［１４］　孙稚颖，罗红梅，陈士林等，大青叶及其混伪品的
ＩＴＳ２序列鉴定研究［Ｊ］．世界科学技术－中医药现
代化，２０１１，１３（２）：３９５－３９９．
［１５］　孙稚颖，宋经元，姚辉等，基于ＩＴＳ２条形码的中药
材赤芍及其易混伪品的ＤＮＡ分子鉴定［Ｊ］．世界
科学技术－中医药现代化，２０１１，１３（２）：４０７－４１１．
［１６］　陈倩，刘义梅，刘震等，ＩＴＳ２和ｐｓｂＡ－ｔｒｎＨ 序列
鉴别马鞭草科药用植物，中国中药杂志［Ｊ］．２０１２，
３７（８）：１　１０７－１　１１３
．［１７］　韩建萍，石林春，陈士林等，ＩＴＳ２序列鉴定筋骨草
及其近缘种［Ｊ］．世界科学技术－中医药现代化，
２００８，１０（６）：８６－８９．
［１８］　曾旭，李秋实，王钤，基于ＩＴＳ２条形码的五加皮基
原植物及其易混品的鉴定［Ｊ］．中国现代中药，
２０１２，１４（２）：１５－－１８．
［１９］　石林春，宋经元，李莉，基于ＩＴＳ２条形码序列的京
大戟及其易混品的ＤＮＡ分子鉴定［Ｊ］．环球中医
药，２０１１，４（２）：１０３－１０８．
［２０］　徐晓兰，石林春，宋经元等，基于ＩＴＳ２条形码序列
的山豆根基原植物及其混伪品的ＤＮＡ分子鉴定
［Ｊ］．世界科学技术－中医药现代化，２０１２，１４（１）：
１　１４７－１　１５２．
［２１］　高婷，姚辉，陈士林等，基于ＩＴＳ２序列的藁本与常
见混伪品的分子鉴定［Ｊ］．世界科学技术－中医药
现代化，２０１１，１３（２）：４１８－４２３．
［２２］　李美妮，韩蕊莲，韩建萍等，大黄与易混伪品土大
黄、虎杖原植物的ＩＴＳ２鉴定［Ｊ］．环球中医药，
２０１２，０５（３）：１８５－１８９．
［２３］　Ｋｅｌｅｒ　Ａ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　Ｔ，Ｓｃｈｕｌｔｚ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．５．８Ｓ－２８Ｓ
ｒＲＮＡ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＨＭＭ－ｂａｓｅｄ　ＩＴＳ２ａｎｎｏｔａ－
ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００９，４３０：５０－５７．
［２４］　Ｌａｒｋｉｎ　ＭＡ，Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ　Ｇ，Ｂｒｏｗｎ　ＮＰ　ｅｔ　ａｌ．，
２００７．Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ　ａｎｄ　ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０ ［Ｊ］．
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３（２１）：２　９４７－２　９４８．
［２５］　Ｔａｍｕｒａ　Ｋ，Ｄｕｄｌｅｙ　Ｊ，Ｎｅｉ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＥＧＡ４：Ｍｏ－
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）
ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅ－
ｖｏｌｕｔｉｏｎ．，２００７，２４：１　５９６－１　５９９．
·９４·王永林等：５５％丙森·醚菌酯 ＷＧ防治苹果斑点落叶病田间药效试验报告