全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

·835·
土鳖虫 DNA 的 RAMP-PCR 反应体系的建立及优化
王 慧 1，苏双良 1，任慧君 2，赵志壮 1，白秀娟 1*
1. 东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030
2. 东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030
摘 要：目的 建立并优化土鳖虫基因组 DNA 的 RAMP-PCR 反应体系及扩增程序，为土鳖虫遗传多样性的研究提供依据。方法 以
雌性土鳖虫为材料，常规酚/氯仿提取基因组 DNA。使用 RAMP 引物（ISSR807＋RAPD A5），采用正交优化方法对影响 PCR 反
应的 Mg2+、dNTPs、引物、DNA 聚合酶、模板进行体系优化，同时选择最佳的引物退火温度。结果 最适引物（ISSR807＋RAPD
A5）组合进行土鳖虫的 RAMP-PCR 分析的反应体系为总体积 25 μL，包括 10×缓冲液 2.5 μL、Mg2+ 1.00 mmol/L、dNTPs 2.00
mmol/L、引物 0.50 μmol/L、TaqDNA 聚合酶 1.00 U、DNA 模板 1.50 ng/μL，最佳退火温度为 46.8 ℃。结论 本实验建立的
最佳 RAMP-PCR 反应体系稳定、重复性好，可用于土鳖虫种质资源鉴定和遗传多样性研究。
关键词：土鳖虫；正交试验；体系优化；RAMP-PCR 体系；遗传多样性
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)06 - 0835 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.06.018
Establishment and optimization of RAMP-PCR reaction system for DNA
of Eupolyphaga sinensis
WANG Hui1, SU Shuang-liang1, REN Hui-jun2, ZHAO Zhi-zhuang1, BAI Xiu-juan1
1. College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
2. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Objective To provide the basis for the genetic diversity research of Eupolyphaga sinensis by establishing and optimizing
the random amplified microsatellite polymorphism RAMP-PCR reaction system and amplification procedure for genomic DNA.
Methods Phenol chloroform extraction of genomic DNA was performed on female E. sinensis. Based on RAMP Primer (ISSR807 +
RAPD A5), the orthogonal test was adopted to optimize the RAMP-PCR amplification system on E. sinensis in five factors (Mg2+,
dNTPs, primer, Taq DNA polymerase, and template DNA) at four levels, and the suitable anneal temperature of the primer was
selected. Results The optimal Primer ( ＋ISSR807 RAPD A5) for RAMP-PCR system (25 μL reaction volume) of E. sinensis was:
10 × PCR buffer (2.5 μL), Mg2+ (1.0 mmol/L), dNTPs (2.0 mmol/L), primer (0.5 μmol/L), Taq DNA polymerase (1 U), and template
DNA (1.5 ng/μL); The optimized anneal temperature was 46.8 .℃ Conclusion The established and optimized RAMP-PCR reaction system is
stable and repeatable, which could provide the basis for the analysis of germplasm resources and genetic diversity of E. sinensis.
Key words: Eupolyphaga sinensis Walker; orthogonal test; system optimization; RAMP-PCR system; genetic diversity

土鳖虫Eupolyphaga sinensis Walker，俗名土元、
地鳖虫等，分类学归属节肢动物门昆虫纲蜚蠊目鳖
蠊科，是一味传统的活血化瘀类中药材，以雌虫干
燥体入药[1]，其药用历史悠久，首载于《神农本草
经》，具有破血散瘀、攻坚解凝的功效[2]。据报道土
鳖虫水煎剂对肾病囊肿具有抑制作用[3]，临床上广
泛用于、舌癌、胃癌、肝癌的治疗[4-8]。由于土鳖虫
种质资源丰富，地域分布广，不同地理种群间其体
型、种群颜色和生长发育存在一定差异[9]，但缺乏
分子水平的深入研究。因此，有必要对其种质资源
和遗传多样性进行研究，为土鳖虫的合理开发和利
用提供参考。
随机扩增微卫星多态性（ random amplified
microsatellite polymorphism，RAMP）是建立在聚合
酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基础
上的新的 DNA 分子标记方法，具有操作简便、检

收稿日期：2013-10-18
作者简介：王 慧（1989—），女，在读硕士，主要研究方向为经济动物饲养与遗传育种。Tel: 18304620468 E-mail: wanghui063@163.com
*通信作者 白秀娟 Tel: (0451)55191636 E-mail: bxj630306@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

·836·
测快速、稳定性强、多态性及共显性高的特点[10-11]。
它将 RAPD 和 SSR 相结合，所得谱带可以显示
RAPD 的多态性，又隐含或长或短的核心重复序列，
且能增加小相对分子质量区域清晰可辨的带纹数
目，可用于区分亲缘关系较近的物种[12]。另有研究
报道指出，与 RAPD 相比，RAMP 更适合研究遗传
背景不太清楚的物种的遗传多样性 [13-15]。但
RAMP 引物组合不同获得的带型不同，且锚定引物
的退火温度比随机引物的退火温度高 10～15 ℃，
解链温度（Tm）值会影响引物的特异性和扩增条带
多态性[16]。因此，为了获得最丰富的遗传信息和确
保 RAMP 标记结果的可靠性，有必要对 RAMP-PCR
反应体系进行优化。本研究选用 RAMP 方法，以土
鳖虫 DNA 为模板，通过多对引物组合筛选出最适
RAMP 引物组合（ISSR807＋RAPD A5），利用正交
试验设计，对 RAMP 反应体系进行了优化，并对
PCR 反应程序中的退火温度进行筛选，以期获得适
合土鳖虫的 RAMP 反应体系，最后用 10 份土鳖虫
材料对优化后的体系进行验证，为土鳖虫遗传多样
性的研究奠定基础。
1 材料与试剂
1.1 材料
土鳖虫活体购于山东省临沂市中药材市场，经
东 北 农 业 大 学 白 秀 娟 教 授 鉴 定 为 土 鳖 虫
Eupolyphaga sinensis Walker 的雌性活体。−20 ℃猝
死冻存，用于基因组的提取及 RAMP-PCR 研究。
1.2 仪器与试剂
所需仪器包括 PCR 仪、琼脂糖凝胶电泳仪、凝
胶成像仪。所使用的引物 ISSR806～815 和 RAPD
A1～A20、B1～B20 是根据哥伦比亚大学发布的 ISSR
引物序列和RAPD引物序列，由北京华大基因合成，
通过预试验，筛选出 PCR 目的条带整齐清晰且多态
性高的 RAMP 引物组合为 ISSR807＋RAPD A5。
dNTPs 购于哈尔滨海基生物科技有限公司，
TaqDNA 聚合酶、Mg2+购自北京金式全生物科技有
限公司。
2 方法
2.1 DNA 的提取及检测
按照常规酚/氯仿抽提法进行总 DNA 的提取[17]，
使用分光光度计，检测 DNA 浓度。根据测定的
A260/A280 值，估测 DNA 质量，一般 A260/A280 在 1.6～
1.8，可以满足实验要求。根据记录的 A260 值及稀释
倍数，换算出待测 DNA 的浓度，并进行相应的稀
释，以 50 ng/μL 分装，工作液 4 ℃保存，DNA 原
液于−20 ℃保存。
2.2 RAMP-PCR 正交试验设计
针对影响 RAMP-PCR 的 5 个主要因素（Mg2+、
dNTP、引物、TaqDNA 聚合酶、模板 DNA）在 4
个水平上进行正交设计，采用 L16(45) 正交表进行
试验，设计方案见表 1，除反应体系表中的因素外，
还有 10×缓冲液（Mg2+）2.5 μL，加灭菌去离子水
至 25 μL 体系。
表 1 RAMP-PCR 反应体系的正交试验
Table 1 Orthogonal test of RAMP-PCR reaction system
编号 模板 DNA / (ng·μL−1) Mg2+ / (mmol·L−1) dNTPs / (mmol·L−1) 引物 / (μmol·L−1) TaqDNA 酶 / U
1 0.75 1.00 1.00 0.25 0.25
2 0.75 1.50 1.50 0.50 0.50
3 0.75 2.00 2.00 0.75 0.75
4 0.75 2.50 2.50 1.00 1.00
5 1.00 2.00 1.50 0.25 1.00
6 1.00 2.50 1.00 0.50 0.75
7 1.00 1.00 2.50 0.75 0.50
8 1.00 1.50 2.00 1.00 0.25
9 1.25 2.50 2.00 0.25 0.50
10 1.25 2.00 2.50 0.50 0.25
11 1.25 1.50 1.00 0.75 1.00
12 1.25 1.00 1.50 1.00 0.75
13 1.50 1.50 2.50 0.25 0.75
14 1.50 1.00 2.00 0.50 1.00
15 1.50 2.50 1.50 0.75 0.25
16 1.50 2.00 1.00 1.00 0.50

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

·837·
2.3 RAMP-PCR 扩增
使用引物 ISSR807＋RAPD A5 进行 PCR 扩增，
反应体系为 25 μL。扩增程序为 94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 45 s，48 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 30 s，
循环 40 次；72 ℃再延伸 8 min，4 ℃保存。用 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2.4 RAMP-PCR 优化体系稳定性的验证
用 10 份土鳖虫基因组 DNA 对所建立的反应体
系的可靠性和稳定性进行检测，反应程序同
RAMP-PCR 扩增反应程序。
3 结果与分析
3.1 土鳖虫基因组 DNA 的提取与检测
本实验提取的基因组 DNA 经紫外分光光度计
检测，A260/A280 值均在 1.6～1.8，1%琼脂糖凝胶电
泳结果见图 1，可见整齐的基因组 DNA 条带。DNA
可用于后续实验。

1～10-10 份样品 M-Marker
1—10-ten samples of E. sinensis M-Marker
图 1 土鳖虫总 DNA 1%琼脂糖凝胶电泳分析
Fig. 1 1% Agarose gel electrophoretogram of total DNA
from E. sinensis
3.2 PCR 正交试验的直观分析
RAMP-PCR 正交试验结果见图 2，由于 5 种影
响因素按不同的添加量进行组合，因此这 16 个体系
的扩增效果存在明显差异。体系 13 扩增效果差，无
条带；体系 1～6、9、15、16 虽有条带，但过于模
糊且多态性低，扩增效果较差；综合比较，体系 7、
8、10、11、12、14 的条带清晰，特异性好，其中
体系 14 的扩增效果最好，条带多，特异性高。因此
确定土鳖虫 RAMP-PCR 的最佳体系为 DNA 模板
1.50 ng/μL，Mg2+ 1.00 mmol/L，dNTPs 2.00 mmol/L，
引物 0.5 μmol/L，10×（Mg2+）缓冲液 2.5 μL，Taq
DNA 聚合酶 1.00 U，并加去离子水至 25 μL。
3.3 体系中不同因素的影响
对影响RAMP-PCR扩增的 5个因素模板DNA、

1～16-体系号 M-Marker
1—16-system number M-Marker
图 2 RAMP-PCR 正交试验电泳结果
Fig. 2 Electrophoretogram of RAMP-PCR orthogonal test
Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA 聚合酶设置不
同的添加量组合。结果表明，模板 DNA 在一
定 的 用 量 范 围 内 均 能 扩 增 出 条 带 ， 对
RAMP-PCR 的扩增无显著影响。引物浓度严重
影响扩增产物的质量，浓度过低时，与模板的
结合位点结合不充分，降低扩增的效果；浓度
过高会增加引物二聚体的形成 [18]，由图 2 可知，
引物浓度为 0.50 μmol/L 扩增条带清晰且多态
性增强，为最适宜引物浓度。Mg2+浓度是制约
PCR 扩增效果的重要因素。Taq DNA 聚合酶需
要 Mg2+的激活，引物与模板双链杂合体的解链
及退火温度均受二价阳离子的影响 [19-21]。当
Mg2+浓度≥2.0 mmol/L，扩增的条带增多，但
带弱且不清晰，浓度为 1.00、1.50 mmol/L 时，
扩增条带清晰明亮，尤其以 1.00 mmol/L 效果
最佳。TaqDNA 聚合酶的添加量直接关系实验
的结果，随着浓度的逐渐增加，条带逐渐变得
清晰，当酶量为 1.00 U 时，条带最整齐明亮。
dNTPs 作为 PCR 反应的原料，其浓度直接关系
扩增产物的量和特异性，同时过量 dNTPs 会对
Mg2+造成拮抗作用，综合考虑，选择 dNTPs 浓
度为 2.00 mmol/L 最适宜。
3.4 退火温度的确定
根据正交试验结果，选择合适的反应体系，设
定退火温度（45±10）℃，PCR 仪自动生成 12 个
温度梯度 40.0、40.2、40.9、42.0、43.2、44.4、45.6、
46.8、48.0、49.1、49.8、50.0 ℃。通过 1%琼脂糖
凝胶电泳结果对比（图 3），当退火温度较低时，扩
增的条带弱且弥散，随着退火温度的升高，扩增条
带逐渐清晰且多态性增多，但超过 47 ℃后条带虽
然清晰可多态性减少。因此确定 RAMP 引物组合的
适宜退火温度为 46.8 ℃。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

·838·

1～12-对应的退火温度 40.0、40.2、40.9、42.0、43.2、44.4、45.6、
46.8、48.0、49.1、49.8、50.0 ℃ M-Marker
1—12-the corresponding temperatures are 40.0, 40.2, 40.9, 42.0,
43.2, 44.4, 45.6, 46.8, 48.0, 49.1, 49.8, and 50.0 ℃ M-Marker
图 3 RAMP-PCR 退火温度的筛选
Fig. 3 Optimized anneal temperature of RAMP-PCR
3.5 RAMP-PCR 优化体系的检测
采用引物组合 ISSR807＋RAPD A5 在体系 14
的基础上进行 10 份土鳖虫个体的 RAMP-PCR 扩
增，扩增结果用 1%琼脂糖凝胶电泳，检测体系的
稳定性（图 4）。如图所示，不同模板 DNA 的扩增
条带存在遗传多样性差异，但均能获得清晰明亮、
重复性好、多态性高的条带，说明经过优化的
RAMP-PCR 体系 14 稳定性好，可用于后续实验。

图 4 10 份土鳖虫个体最优体系扩增的结果
Fig. 4 Amplification of ten samples of E. sinensis
with optimal RAMP-PCR reaction system
4 讨论
RAMP 标记是一种建立在 PCR 基础上将 SSR
标记和RAPD标记的优点结合在一起的新型分子标
记技术[22-23]，具有较高的稳定性和可重复性，更能
揭示物种间和物种内的多态性，适合于遗传背景尚
不太清楚的物种的研究[14]。但对于不同的物种，需
选用不同的微卫星引物和 RAPD 引物组合[12]，且
RAMP 易受反应体系中各因素的配比和 PCR 反应
程序的影响。因此，在运用 RAMP 标记进行某物种
研究时，先筛选出适合该物种的 ISSR 引物和 RAPD
引物组合，再根据引物选取适宜的退火温度，确立
和优化适用于该物种的 RAMP-PCR 体系是获取丰
富、科学、稳定和准确的 RAMP 标记遗传信息，并
为其种质资源和遗传多样性研究提供可靠依据的必
不可少的前期工作。
本实验选用 20 对 RAPD 引物和 10 对 ISSR 引
物，进行引物组合的筛选，确定最佳引物组合为
ISSR807＋RAPD A5。同时采用 5 因素 4 水平正交
设计对反应体系中相互影响的模板用量、Mg2+浓
度、引物浓度、dNTPs 浓度、TaqDNA 聚合酶进行
了梯度设置。其中，模板 DNA 的用量对扩增结果
的影响较小，而 Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs 浓
度、TaqDNA 聚合酶的用量对 RAMP-PCR 的影响
较大。经过正交体系表的重复试验，确定适合引物
组 合 （ ISSSR807 ＋ RAPD A5 ） 进 行 土 鳖 虫
RAMP-PCR分析的最佳反应体系为：DNA模板1.50
ng/μL，10×（Mg2+）缓冲液 2.5 μL，Mg2+ 1.00
mmol/L，dNTPs 2.00 mmol/L，引物 0.5 μmol/L，Taq
DNA 聚合酶 1.00 U，并加去离子水至反应总体积
25 μL。最佳退火温度为 46.8 ℃。同时经过 10 份土
鳖虫个体的验证，建立了反应稳定、重复性好的
RAMP-PCR 反应体系。该体系为 RAMP 分子标记
技术的发展和下一步土鳖虫遗传多样性分析和构建
遗传图谱提供技术铺垫。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 周瑞玲, 陈玉兴, 曾晓会, 等. 土鳖虫多肽对家兔血瘀
模型的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2005, 11(6):
51-53.
[3] 徐成刚, 梅长林, 赵海丹. 土鳖虫水煎剂对人多囊肾病
囊肿衬里上皮细胞增殖的影响 [J]. 第二军医大学学
报, 2002, 23(2): 200-202.
[4] 葛钢锋, 余陈欢, 吴巧凤. 土鳖虫醇提物对体外肿瘤细
胞增殖的抑制 [J]. 中华中医药杂志 , 2013, 28(3):
826-828.
[5] 林静华, 吴映娥, 蔡应木, 等. 地鳖虫纤溶活性蛋白组
分的提取及对肿瘤细胞的抑制作用 [J]. 国际检验医学
杂志, 2007, 28(12): 1088-1090.
[6] 张冬梅, 李穗晶, 黄雅莉. 地鳖虫活性蛋白对人舌癌细
胞 Tea-8113 的抑制作用 [J]. 中药新药与临床应用,
2007, 18(4): 257-259.
[7] 邹 玺, 刘宝瑞, 钱晓萍, 等. 土鳖虫提取液对人胃低
分化腺癌细胞 BGC-823 的抑制作用 [J]. 时珍国医国
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

·839·
药, 2006, 17(9): 1695-1696.
[8] 胡文静, 钱晓萍, 邹 玺, 等. 重楼、土鳖虫对人肝癌
SMMC-7721 细胞增殖抑制的协同作用 [J]. 南京中医
药大学学报, 2007, 23(4): 234-237.
[9] 胡玉伟. 中华真地鳖体型大小地理变异及相关免疫反
应研究 [D]. 武汉: 华中农业大学植物科技学院, 2011.
[10] Matsumoto C, Nabika T, Mashimo T, et al. Construction
of a rat genetic map by using randomLy amplified
microsatellite polymorphism markers [J]. Mamm
Genome, 1998, 9(7): 531-535.
[11] Labra M, Vannini C, Grassi F, et al. Genomic stability in
Arabidopsis thaliana transgenic plants obtained by floral
dip [J]. Theor Appl Genet, 2004, 109(7): 1512-1518.
[12] 王明霞, 柳李旺, 龚义勤, 等. RAMP 与 REMAP 分子
标记技术及其应用 [J]. 分子植物育种 , 2006, 4(6):
859-865.
[13] 罗文永, 胡 俊, 李晓方. 微卫星序列及其应用 [J].
遗传, 2003, 25(5): 615-619.
[14] 王红梅, 白秀娟. 应用 RAMP 标记分析水貂与彩貂种
属间的遗传多样性 [J]. 中国畜牧兽医, 2007, 34(8):
41-44.
[15] 侯万伟, 樊军锋, 张小娟, 等. 杨树 RAMP 体系的建立
与优化 [J]. 华北农学报, 2008, 23(10): 217-219.
[16] Becker J, Henu M. Mapping of digested and undigested
random amplified microsatellite polymorphisms in barley
[J]. Genome, 1995, 38(5): 991-998.
[17] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术 [M]. 第2版. 北京:
中国协和医科大学出版社, 1999.
[18] 马 巍 , 王春强 , 马 宁 . 山羊基因组 DNA
RAMP-PCR 反应体系的建立 [J]. 畜牧兽医杂志, 2008,
27(1): 6-8.
[19] 童阿玛, 王柳英. 草地早熟禾 ISSR-PCR 反应体系优化
[J]. 青海大学学报, 2009, 27(3): 55-58.
[20] 唐 辉, 陈宗游, 史艳财, 等. 正交设计优化地枫皮
ISSR-PCR 反应体系 [J]. 中草药, 2013, 44(5): 610-615.
[21] 张香东, 刘 庚, 常素慧, 等. 水蛭 ISSR-PCR 反应体
系的建立及优化 [J]. 中草药, 2013, 44(2): 215-218.
[22] Wu K S, Jones R, Danneberger L, et al. Detection of
microsatellite polymorphisms without cloning [J]. Nucl
Acids Res, 1994, 22(15): 3257-3258.
[23] Davila J A, Loarce Y, Ferrer E. Molecular
characterization and genetic mapping of random
amplified microsatellite polymorphism in barley [J].
Theor Appl Genet, 1999, 98(2): 265-273.