全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月

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桦褐孔菌醇诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的分子机制研究
王李俊 1，杨 琴 1，王 飞 2，朱 盼 1
1. 江西中医药高等专科学校，江西 抚州 344000
2. 南昌大学抚州医学院，江西 抚州 344000
摘 要：目的 研究真菌桦褐孔菌中的代表化合物桦褐孔菌醇对人乳腺癌 MCF-7 细胞的作用，为桦褐孔菌及桦褐孔菌醇在
抗肿瘤方面的临床应用提供新的依据。方法 桦褐孔菌醇由传统植物化学方法从桦褐孔菌中提取分离得到。乳腺癌细胞系
MCF-7与不同浓度的桦褐孔菌醇共孵育，采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率；流式细胞术 Annexin V/PI双染色检测细
胞凋亡；Western blotting法检测半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）和多聚 ADP-核糖聚合酶（Poly ADP ribose polymerase，PARP）
蛋白表达情况。结果 桦褐孔菌醇能够抑制MCF-7细胞的生长，并可诱导MCF-7细胞产生凋亡。浓度为 25、50、100 μmol/L
的桦褐孔菌醇作用MCF-7细胞 48 h后，细胞凋亡率显著增加至 28.62%、39.45%、53.18%，明显高于对照组凋亡率（3.21%）；
经过 50 μmol/L桦褐孔菌醇分别处理 12、24、48 h后，MCF-7细胞 Caspase-3的活性形式 cleaved Caspase-3表达量显著增加；
凋亡蛋白标志物 PARP 裂解量升高，且呈时间依赖性。结论 桦褐孔菌醇能抑制 MCF-7细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用
机制推测与激活细胞 Casepase-3和 PARP有关。
关键词：桦褐孔菌醇；桦褐孔菌；乳腺癌；凋亡；半胱氨酸蛋白酶 3
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)06 - 0970 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.019
Induction of human MCF-7 breast cancer cell apoptosis by Inonotus obliquus and
study on its mechanism
WANG Li-jun1, YANG Qin1, WANG Fei2, ZHU Pan1
1. JiangXi College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 344000, China
2. Fuzhou Medical College of Nanchang University, Fuzhou 344000, China
Abstract: Objective To study the induction of human MCF-7 breast cancer cell apoptosis by inotodiol isolated from Inonotus
obliquus, a traditional Chinese medicinal fungi. Methods Inotodiol was isolated from the crude ethanol extract of I. obliquus and
purified. Inotodiol at different concentration and human breast cancer MCF-7 cell line were co-incubated. Relative cell viabilities were
determined by MTT method; apoptosis was analyzed by Annexin V/PI dual staining with flow cytometry; The protein expression levels
of Caspase-3 and Poly ADP ribose polymerase (PARP) were detected by Western blotting. Results Inotodiol reduced the viability of
MCF-7 cells dose- and time-dependently. Moreover, inotodiol induced the apoptosis in MCF-7 cells. The data of Western blotting
showed that inotodiol up-regulated the expression levels of cleaved Caspase-3 and PARP, in a time-dependent manner. Conclusion
Inotodiol could induce apoptosis in human breast cancer cells, which provides novel information for clinical application of inotodiol
and its preparations for the breast cancer patients.
Key words: inotodiol; Inonotus obliquus (Fr.) Pila; breast cancer; apoptosis; Caspase-3

乳腺癌是女性最常见的癌症之一。虽然临床上
有多种化学合成药物如他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞
米芬等已被广泛用于乳腺癌患者的治疗[1]，但是由
于这些药物具有毒性大、容易耐药等问题，临床效
果不理想，目前临床上仍然亟需高效、低毒、特异
性的乳腺癌治疗药物。
桦褐孔菌 Inonotus obliquus (Fr.) Pila 又名白桦
茸，生于白桦、银桦、榆树、赤杨等的树皮下或活
立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上。现代植物化学
研究发现，桦褐孔菌中的主要化学成分为三萜类、甾

收稿日期：2015-12-15
作者简介：王李俊（1981—），男，江西东乡人，硕士，讲师，主管中药师，主要从事药用植物分子生物学研究。
Tel: (0794)8228608 E-mail: wwww736@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月

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体、多酚、多糖等[2-3]。近年国内外学者研究发现桦
褐孔菌提取物具有多种生物学活性，包括抗衰老、降
血糖、降血压、抗肿瘤等，特别是其抗肿瘤活性受到
很大的关注[4]，且并未表现出明显的生理毒性[5]。但
是具体作用机制尚不清楚。本研究以人乳腺癌细胞
系为研究对象，研究桦褐孔菌中量最多的三萜类化
合物桦褐孔菌醇对乳腺癌MCF-7细胞增殖与凋亡的
影响，拟揭示其抗乳腺癌的作用机制。
1 材料
1.1 真菌原料
桦褐孔菌采自黑龙江省牡丹江市镜泊湖火山口
桦树的树干，由江西省科学院生物资源研究所金志
农研究员鉴定为 Inonotus obliquus (Fr.) Pila 子实体
1.2 细胞与试剂
人乳腺癌细胞系 MCF-7 细胞购于中国科学院
典型培养物保藏委员会细胞库；RPMI 1640培养液
购自北京四季青生物材料研究所；噻唑蓝（MTT）
试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血
清购自 Invitrogen公司；AnnexinV/PI细胞凋亡检测
试剂盒购于 Bender公司；细胞浆蛋白抽提试剂盒购
于上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂（分析
纯）购于北京试剂厂。
1.3 实验仪器
UV-3600Plus 分光光度计（岛津企业管理有限
公司）；DYY-6D三恒电泳仪（北京市六一仪器厂）；
YQX-II厌氧培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；
BD FACSCanto II流式细胞仪（上海碧迪医疗器械
有限公司）；DW-86L30超低温冰箱（杭州艾普仪器
设备有限公司）；METTLER XS205 微量分析天平
（南京皓海科学仪器仪表有限公司）；HNY-200B 台
式全温度恒温高速培养摇床（北京傲松欣实验室设
备有限公司）；Eppendorf-5424小型高速离心机（北
京东南仪诚实验室设备有限公司）；MLS-3751L 高
压蒸汽灭菌锅（松下健康医疗器械株式会社）；
Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
2 方法
2.1 桦褐孔菌醇的制备
桦褐孔菌子实体经加热回流提取法制备桦褐
孔菌醇。取 40 g桦褐孔菌子实体，加 95%乙醇 3.0 L
加热回流提取 3次，每次 30 min，合并提取液后滤
过除渣，制成桦褐孔菌粗提物溶液，减压浓缩至干。
再通过硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗
脱，分段收集，再经过重结晶，得到纯品桦褐孔菌
醇（质量分数 99%，HPLC），以二甲基亚砜（DMSO）
溶解，用 RPMI 1640培养液稀释至所需浓度。
2.2 细胞培养
将MCF-7细胞培养于 RPMI 1640培养液（含
10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉
素）中，置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培
养箱内，取对数生长期细胞用于实验。
2.3 细胞增殖抑制实验
取 1×105/mL 对数生长期的 MCF-7 细胞，分
别接种于 96孔板（200 μL/孔），细胞贴壁后每孔加
入终浓度为 0、25、50、100 μmol/L 的桦褐孔菌醇。
各浓度均设 5个复孔，分别继续培养 24、48、72 h，
以同体积 RPMI 1640培养液为空白对照。于各组实
验结束前 4 h加入MTT试剂 20 μL/孔，继续孵育 4
h，吸弃上清，加入 DMSO 150 μL/孔，摇床上振荡
10 min，待结晶完全溶解后酶标仪上检测 570 nm处
的吸光度（A）值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝实验组平均 A值/对照组平均 A值
2.4 流式细胞术检测细胞凋亡
将对数生长期的 MCF-7 细胞，以 1×106/mL
浓度接种于 6孔培养板内，待细胞贴壁后分别加入
终浓度为 0、25、50、100 μmol/L的桦褐孔菌醇培
养液，培养 48 h 后，收集细胞，离心固定后加入
Annexin V-FITC和 PI，室温避光染色。筛网滤过后
送流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。
2.5 Western blotting法检测蛋白表达量的变化
细胞分别以 50 μmol/L的桦褐孔菌醇处理 12、
24、48 h后收集细胞，参照试剂盒说明书进行细胞
浆蛋白抽提操作，提取细胞总蛋白并测定浓度，蛋
白样品加入 1/5体积的 5×上样缓冲液，沸水煮沸 5
min，根据蛋白浓度以 20 μg/孔上样，进行 SDS-聚
丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转至 PVDF膜上，室温
封闭 1 h，分别加入 1∶1 000稀释的半胱氨酸蛋白
酶 3（Caspase-3）和 ADP-核糖聚合酶（PARP）蛋
白，4 ℃过夜。β-actin作为内参，TBST洗膜 3次，
加入 1∶1 000稀释的辣根酶标记的兔抗山羊 IgG，
室温孵育 2 h，同样洗膜 3次，ECL发光液显色，
观察各条带深浅变化。
2.6 统计学方法
应用 SPSS 19.0统计软件进行处理。计量资料
用 ±x s表示，两组间比较采用 t 检验；多组间比
较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t
检验。
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3 结果
3.1 对乳腺癌细胞活力的影响
如图 1所示，桦褐孔菌醇分别处理 24、48、72 h，
在 25～100 μmol/L均可不同程度抑制MCF-7细胞
活力，且随着桦褐孔菌醇浓度的升高和处理时间的
延长，抑制细胞活力的作用也逐渐增强，呈浓度和
时间依赖效应。
3.2 对MCF-7细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示，桦褐孔菌醇能诱导
MCF-7细胞凋亡。如图 2所示，桦褐孔菌醇（终浓
度分别为 25、50、100 μmol/L）处理 MCF-7 细胞
48 h后，细胞凋亡（早期凋亡＋晚期凋亡）率分别
为 28.62%、39.45%、53.18%，明显高于对照组凋
亡率（3.21%），且其作用具有明显剂量依赖性。



与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
图 1 桦褐孔菌醇对MCF-7细胞活力的影响 ( x±s, n = 5)
Fig. 1 Effect of inotodiol on cell viability of MCF-7 cells ( x±s, n = 5)



图 2 桦褐孔菌醇对MCF-7细胞凋亡的影响
Fig. 2 Effect of inotodiol on cell apoptosis of MCF-7 cells
3.3 对MCF-7细胞内的蛋白表达量的影响
通过 Western blotting测定，发现未用桦褐孔
菌醇处理的 MCF-7 细胞中 cleaved Caspase-3 和
cleaved PARP 几乎没有表达。桦褐孔菌醇（50
μmol/L）处理 MCF-7细胞 12、24、48 h后，MCF-7
细胞 cleaved Caspase-3、cleaved PARP表达量浓
度依赖地增加（图 3）。
4 讨论
全球乳腺癌患者发病率一直呈上升趋势。中国
虽不是乳腺癌的高发国家，但近年乳腺癌发病率的
增长速度很快。全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率已


图 3 桦褐孔菌醇对 MCF-7 细胞中 cleaved Caspase-3 和
cleaved PARP蛋白表达的影响
Fig. 3 Effects of inotodiol on protein expression of cleaved
Caspase-3 and PARP in MCF-7 cells
100
80
60
40
20
0




100
80
60
40
20
0




100
80
60
40
20
0




对照 25 50 100
桦褐孔菌醇/(μmol·L−1)
**
**
*
**
*
* *
*
细
胞
存
活
率
/%

凋亡率: 3.21% 凋亡率: 28.62% 凋亡率: 39.45% 凋亡率: 53.18%
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
Annexin V

桦褐孔菌醇 25 μmol·L−1
PI

cleaved Caspase 3

PARP
cleaved PARP

β-actin
对照 12 h 24 h 48 h
桦褐孔菌醇 50 μmol·L−1
24 h
104
103
102
101
100



104
103
102
101
100



104
103
102
101
100



104
103
102
101
100



对照 25 50 100
桦褐孔菌醇/(μmol·L−1)
对照 25 50 100
桦褐孔菌醇/(μmol·L−1)
48 h 72 h
细
胞
存
活
率
/%

细
胞
存
活
率
/%

对照 桦褐孔菌醇 50 μmol·L−1 桦褐孔菌醇 100 μmol·L−1
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经位居女性恶性肿瘤的第 1位。乳腺癌患者最佳治
疗手段的选择依然面临很大的挑战[6]。天然药物（包
括中医药和民族医药）是用来防治疾病的有力武
器，与化学药品相比，天然药物除了有着来源广泛、
价格低廉和毒副作用低等优点外，在减轻癌症患者
临床症状，提高生存质量，提高免疫力，增强放、
化疗敏感性，减轻放、化疗不良反应等很多方面都
具有优势。近年来中药及其有效部位或成分抗癌研
究工作取得了一系列的成果，已成为肿瘤医学的研
究热点之一[7]。
近年来，从真菌的药用植物次生代谢产物中已
分离出许多活性较高的生物活性物质，这表明药用
植物内生真菌已成为药物开发的重要资源。目前，
从植物内生菌尤其是药用植物细菌中发现了很多
具有开发前景的抗肿瘤活性成分，这为寻找高活性
的抗肿瘤化合物具有重要意义。
桦褐孔菌主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日
本北海道等地区和我国黑龙江与吉林一带。在民
间，桦褐孔菌应用于防止癌细胞转移、复发，增强
免疫能力，配合恶性肿瘤患者的放疗、化疗，增强
病人的耐受性，减轻毒副作用[4,8-9]，但是具体的作
用机制尚不明确。本研究选择人乳腺癌细胞为研究
对象，检测桦褐孔菌中的代表性化合物桦褐孔菌醇
的抗肿瘤作用，旨在揭示桦褐孔菌在乳腺癌治疗中
的作用机制。通过 MTT 实验，发现桦褐孔菌醇可
显著降低MCF-7细胞活力（呈时间及剂量依赖性）。
进而通过流式细胞术发现桦褐孔菌醇可以诱导
MCF-7细胞凋亡。
Caspase 家族蛋白的激活在细胞凋亡过程中起
关键性作用，被认为是诱发凋亡的直接效应物[10]。
已发现的 Caspase 家族有 10 余种，其中 Caspase-3
是该家族的重要成员，是细胞凋亡过程中的关键
酶。PARP是 Caspase的切割底物，在 DNA损伤修
复与细胞凋亡中发挥着重要作用[11]。本研究通过
Western blotting实验发现，桦褐孔菌醇呈时间依赖
性地增加 MCF-7 细胞中 Caspase-3 的活性形式
cleaved Caspase 3和 cleaved PARP的表达量。提示
桦褐孔菌醇可能是通过增强细胞 Caspase 活性从而
促进细胞凋亡。
综上所述，桦褐孔菌醇具有抗肿瘤作用。本研
究为临床应用药用真菌制品治疗乳腺癌患者提供
了一定的参考，也为更合理使用桦褐孔菌及其制剂
提供了新的依据。
参考文献
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