全 文 ：·1874· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
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影响桦褐孔菌培养菌丝体水解鞣质积累的因素
杨士钊，郑维发+
(徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州 221116)
摘要：目的探索影响人工培养条件下桦褐孔菌菌丝体水解鞣质积累的因素。方法 以菌丝体干质量和水解鞣
质的量为指标，对不同碳源、氮源、pH以及不同金属离子作用下的菌丝体干质量和水解鞣质的量进行测定。结果
最适合桦褐孔菌积累水解鞣质的碳、氮源是葡萄糖和蛋白胨，最佳pH是5．5。Cu”在0．8mmol／L，Co”在1．6
mmol／L，Zn2+在1．6mmol／L，Mn抖在1mmol／L，NH4+在4mmol／L时都能明显地促进水解鞣质的合成。结论
以葡萄糖和蛋白胨为碳、氮源，pH为5．5的培养基有利于桦褐孔菌水解鞣质的积累。Cu”，Co”，Zn”，Mn2+添
加到上述培养基中是进一步提高培养产物水解鞣质积累的有效手段。
关键词：桦褐孔菌；水解鞣质；深层发酵
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)12—1874一05
Factorsaffectingaccumulationofhydrolysabletanninsnculturedmycelia
ofInonotusobl幻UU$
YANGShi—zhao．ZHENGWei—fa
(KeyLaboratoryforBiotechnologyonMedicinalPl ntsofJiangsuProvince’
XuzhouN rmalUniversity，Xuzhou221116，China)
Abstract：ObjectiveTos udythefactorsaffectingheaccumulationofhydrolysablet nninsi
culturedmyceliaofInonotusobliquus．MethodsTakingdryweightofmyceliaandhydrolysabletannin
contentasindex，differentca bonandnitrogensources，pH1evels，andmetalionswereevaluatedforthe
accumulationofhydrolysabletanninsthesubmergedcultureofI．obliquus．ResultsTheop imalc rbon
andnitrogensourcesw reglucoseandpeptone．OptimalinitialpHvaluewas5．5．Theaccumulationof
hydrolysabletanninswagreatlyenhancedinthemediumwiththepresenceofCu2+at0．8mmol／L．C02+
andZn2+at1．6mmol／L，Mn2+at1mmol／L，andNH4+at4mmol／Lwhencomparedtothecontr01．
ConclusionTheaccumulationofhydrolysabletanninssmaximizednthemediumcontainingglucoseand
peptonewithpHvalueat5．5．SupplementationofCu2+，C02+，Zn2+，andMn2+intothemediumisan
effectivemethodf rfurtherincreasingtheaccumulationofhydrolysabletanninsnculturedmyceliaofI。
obliquus．
Keywords：Inonotusbliquus(Fr．)Pilat；hydrolysableannins；depthfermentation
桦褐孔菌Inonotusobliquus(Fr．)Pilat为多孔
菌科褐卧孔菌属药用真菌。主要分布于俄罗斯北部、
北欧、中国长白山地区等北纬40。～50。地区‘1。。长期
以来桦褐孔菌在俄罗斯、北欧等国家被广泛用来治
收稿日期：2007—02—10
基金项目：江苏省自然科学基金(BK2006034)；江苏省高校自然科学研究计划重大项目(05KJA36012)
作者筒介：杨士钊(1976一)，男，河南南阳人，徐州师范大学天然产物化学硕士研究生。E—mail：ysz20045@126．corn
*通讯作者 郑维发Tel／Fax：(0516)83403179E—mail：yyzw@xznu．edu．℃n
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1875·
疗各种癌症、心脑血管疾病、糖尿病、肝病、艾滋
病[2]，具有显著药理活性，而对人体没有任何不良反
应口]。研究表明，多酚类化合物是桦褐孔菌主要成分
之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、增强机体免
疫Ⅲ、益肝护肾、抑菌、抗艾滋病嘲等作用。其中，没
食子鞣质和二聚鞣花鞣质具有显著的抗病毒活性，
已被广泛用于抗HIV研究[6]。天然的桦褐孔菌主要
生长在活的桦树干上，对环境要求特殊，生长十分缓
慢。由于桦褐孔菌多酚类化合物对多种疾病疗效显
著和市场需求的不断增加，现有资源已无法满足市
场需求。有关桦褐孔菌的人工培养已有多糖、黑色素
类化合物在发酵产物中积累的报道[7’。9]，而多酚类化
合物在桦褐孔菌发酵产物中的积累规律尚不清楚。
本实验J以多酚类化合物水解鞣质和菌丝体生物量为
指标，不同碳、氮源和金属离子为影响因子，开展桦
褐孔菌水解鞣质和生物量积累的研究，为提高桦褐
孔菌深层发酵产物的多酚类化合物积累进而提高人
工培养桦褐孔菌的药理学活性奠定实验基础。
1实验器料
1．1试剂与仪器：没食子酸、鞣花酸购自Sigma公
司，Folin—Ciocalteu显色剂按文献自制[10。，电热恒
温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，722S可见分光
光度计(上海精密科学仪器有限公司)；恒温振荡培
养箱(上海申能博彩生物技术有限公司)；F1exi—
Dry．MP冷冻干燥机(美国专利#4，823，478)，
Waters600高效液相色谱系统，2487紫外检测器，
WatersEmpower色谱工作站。
1．2菌种及培养基：桦褐孔菌采自牡丹江镜泊湖火
山口，标本由俄罗斯真菌专家MargaritaA．
Bondartseva教授鉴定，保存于江苏省药用植物生
物技术重点实验室(编号：LBMPz004005)。菌种经
PDA斜面纯化培养后接入液体培养基。发酵培养基
与种子培养基均采用2％葡萄糖，0．35％蛋白胨，
0．1％酵母膏，0．1％KH：PO。，0．05％MgSO。·
7HzO，0．02％(NH；)2S04、0．01％CaCl2，pH自然
(5．5)。
2方法与结果
2．1菌丝体的发酵与鞣质的检测：将培养7d的液
体菌种按1：20(体积比)无菌接入500mL装有
100mL培养基的三角瓶中，在温度26℃振荡频率
为140r／min的培养箱中培养15d。根据实验方案，
改变培养基中的碳源、氮源与pH值以及添加金属
离子。菌丝体生物量以菌丝体的干质量表示。每个
处理设3个重复。培养结束后，发酵产物以4800×
g离心15min，分离菌丝体。桦褐孔菌菌丝体匀浆
后加入70％丙酮20mL[113超声提取1h，提取3
次，合并提取液，35℃减压回收丙酮，离心除去残
渣后定容至50mL，得胞内水解鞣质}向上清液中加
入3倍的无水乙醇，静置过夜。醇沉液‘4800Xg离
心分离，上清40℃减压回收乙醇，在残液中加人
10mL乙醚‘123萃取3次，合并萃取后的溶液并定容
至50mL，得胞外鞣质。冷冻干燥后分别用FeCl。溶
液检验，盐酸一正丁醇检测鞣质的类别[1¨。结果显
示，加入FeCI。溶液后显蓝色，盐酸一正丁醇处理后无
红色，表明产物中只有水解鞣质而无缩合鞣质。
准确吸取水解鞣质溶液1mL，加入2mL
Folin～Ciocalteu显色剂，按文献处理并分别测定吸
光值[1川。同法以没食子酸为对照品，测定不同质量
浓度的没食子酸的吸光值，绘制标准曲线。本实验条
件下没食子酸的回归方程为Y=0．02155+
0．15322X，r一0．99923，SD一0．01476，，l一8，P<
0．0001。根据回归方程计算出胞内水解鞣质和胞外
水解鞣质的量，二者的和即为总水解鞣质的量。
2．2碳源对水解鞣质和生物量积累的影响：分别以
米粉、蔗糖、半乳糖、D一木糖、麦芽糖代替一级摇瓶
中的葡萄糖，质量分数皆为2％。结果显示，以2％葡
萄糖作为碳源时总水解鞣质的量和菌丝体生物量为
最高，分别达到了8．74g／L和131．28mg／L。而其
他几种碳源无论是茵丝体还是水解鞣质的量都相对
较低(表1)。
裹1碳源对水解鞣质和茸丝体干质量的影响(善土s，詹_-3)
Table1 Effectofcarbonsourcesonhydyolytietannin
+
contentsanddrymyeeliumweight(i土s，一一3)
2．3氮源对水解鞣质的影响：分别以蛋白胨、酵母
膏、黄豆粉、麦皮、蛋白胨和酵母膏混合物、
(NH。)。SO。、KNO。为实验氮源，代替一级摇瓶中的
蛋白胨，质量分数皆为0．6％，其中混合氮源中，蛋
白胨为0．4o,4，酵母膏为0．2％，从表2可见不同氮
源对水解鞣质的积累有很大影响，其中以蛋白胨做
碳源时总水解鞣质的量最高，达到125．38mg／L，
但不利于菌丝体的生长，干质量仅为乐91g／L。无
机氮源不利于菌丝体的生长和水解鞣质的积晨。而
万方数据
·1876· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月
0．4％蛋白胨和0．2％酵母膏为混合氮源时水解鞣
质的量和菌丝体的产量都较高，分别达到96．25
mg／L和6．53g／L(表2)。
2．4 pH对水解鞣质的影响：用1mol／L的HCI或
1mol／L的NaoH将培养起始pH分别调至4．5、
5．5、6．5、7．5、8．5。结果显示，pH为5．5时即自然
条件下菌丝体和总水解鞣质的量最高，分别达到
7．84g／L和131．48mg／L(表3)。
表2氮源对水解鞣质和菌丝体干质量的影响。士s，n一3)
Table2 Effectofnitrogensourcesonhydyolytictannin
contentsandrymyceliumweightG士s，捍一3)
表3 pH对水解鞣质和菌丝体干质■的影响(；±s，n一3)
Table3 EffectofinitialpHvalueOnhydyolytictannin
contentsandrymyceliumweight(_±s，疗一3)
2．5金属离子对水解鞣质的影响：根据碳、氮源和
pH单因子实验的结果，以最适合水解鞣质积累的
培养基(葡萄糖Z0A；蛋白胨0．035％；酵母膏
0．I％；KH2P040．05％，MgS04·7H200．02％，
(NH。)2SO。0．01％，CaCl20．02％，pH5．5)开展金
属离子对水解鞣质量的影响。金属离子溶液滤膜除
菌后与菌种一同接入事先灭菌的培养基中，以不加
金属离子的培养基为对照。结果表明，几种金属离子
对桦褐孔菌水解鞣质的积累有显著的促进作用。但
随着金属离子浓度的增加菌丝体的生长受到抑制。
铜离子在0．4mmol／L时对水解鞣质的积累有促进
作用，对菌丝体的生长没有抑制作用。0．8mmol／L
时水解鞣质的积累达到极显著，总水解鞣质几乎是
对照的2倍。但此时菌丝体的生长受到抑制，胞外水
解鞣质达150mg／L(表4)。钴离子和锌离子在
0．8、1．6mmol／L时对桦褐孔菌水解鞣质的积累有
显著的促进作用。钴离子对菌丝体生长没有显著抑
制作用(表5)，在1．6mmol／L时，锌离子对菌丝体
的生长有一定的抑制作用(表6)。锰离子在0．05～
1mmol／L时对桦褐孔菌水解鞣质的积累都有显著
的促进作用，其中1mmol／L锰离子使总水解鞣质
积累达到最大值，但此时菌丝体生物量积累减少几
乎一半(表7)。
2．6桦褐孔菌培养菌丝体中水解鞣质的成分分析：
表4 CuSO．·5H：O对水解鞣质和莴丝体千质量的影响
(；土s，n一3)
Table4 EffectofCuS04·5H20onhydyolytictannin
contentsandrymyceliumweight(；±s，弹一3)
表5 CoC!：·4H：O对水解鞣质和菌丝体干质量的影响
(；±s，矗一3)
Table5 EffectofCoCl2·4H20onhydyolytictannin
contentsandrymyceliumweight(；士s，露一3)
表6 ZnCi：对水解鞣质和菌丝体干质量的影响(i±s，露一3)
Table6 EffectofZnCl2Ollhydyolytictanninontents
andrymyceliumweight(；±s，露=3)
表7 MnCl2‘4H,O水解鞣质和菌丝体干质量的影响
(；±s，席一3)’，7
Table7 EffectofMnCl2·4H,Oonhydyolytictannin
contentsandrymyceliumweight(_is，n一3)
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第12期2007年12月·1877·
取最佳碳、氮源和pH的培养基发酵生产的水解鞣
质10mg用2mL2mol／L的盐酸80℃水解7h，
再加入2mL2mol／L的NaOH中和，0．45肛m滤
膜过滤后，进样量20肛L用于RP—HPLC分析，以
没食子酸和鞣花酸为对照品。RP—HPLC条件为色
鞣花酸
A
谱柱：HypersilODS(250mm×4．6mm，大连
依利特公司)；柱温：30℃；流动相：0．1mol／L的
H3PO。等度；体积流量：1mL／min；UV检测波长：
280nm(没食子酸)和254am(鞣花酸)。色谱图
见图1。
l
没食子酸
B
4 8 12 10 20 24 zs 4 8 12 16 20 24 28 4 8 i2 16 20 24 28
t／min
一
图1 鞣花酸对照品(A)、没食子酸对照品(B)和样品(c)的RP·HPLC图
Fig．1HPLCChromatogramsfellagicacid(A)，gallicacidreferencesubstance(B)，andsample(C)
结果表明，桦褐孔菌发酵产物水解后的产物有 属离子显著地提高了人工培养环境下桦褐孔菌的药
7种，其中以1(鞣花酸)、3、4、7(没食子酸)为主要成用 分一一水解鞣质的积累。对进一步开展桦褐孔
分。说明桦褐孔菌发酵产物中多酚类物质以鞣花酸 菌在人工培养条件下多酚类化合物的积累研究奠定
鞣质和没食子酸鞣质为主。 了一定的基础。
3讨论 References：
本研究结果显示，葡萄糖和蛋白胨是桦褐孔菌 ‘13船，蔷．絮篆甓篡翟ic(a中l舔嘉攀；1‰盔焉；
水解鞣质积累的最佳碳、氮源，Cu2+，Mn2+、Zn2+、7—8．
C02+等金属离子对水解鞣质的积累有显著的促进 一lnonotusobli口“mI；anewtrit唧ene，1，24-cyclopenShin
YTamaiYTerazawaM Chemical
constituentstoa—f
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作用。有研究表明，真菌中水解鞣质的生物合成途径骱lano甜staR-。3,篓：淼?04}7-8：-3enle3l嚣5d啪帅“u上√4户露”
来自于莽草酸途径，其合成前体是没食子酸，3一脱氢 ‘3|t，Lin(海B峡X舞e2aoolf4un，91i6-I：n07n40．t”捌咖耶‘13·s加缸P^“’”
莽草酸脱氢酶是合成没食子酸的关键酶u3‘。Cu2+、 [4]CuiaY，KimDS，ParkKC．AntioxidanteffecofInonotus
Mnz+．Znz+对3一脱氢莽草酸脱氢酶的活性有显著的[5]ocbhl。iq。ugu涩蠹紫等甓翟篡毪2G00．5A,re96。：。7n9。-i。85。‘。d。。bl。一
促进作用[143。Mn2+．C02+、M92+还能刺激莽草酸途Medged，；w9908rd，9in：1b6i08l-1709y5．8”he81‘h2啊·Tren出，”d＆‘
径中的第1个酶3一脱氧一D一阿拉伯一庚糖一7磷酸合 ‘63。Y。u。。Dral,Mp，oodrructis-Nba。t。s。cdh。k。e崇盎托K。。H。．rchNe[Jw]．d2嚣芝
成酶的活性u“。Zn2+、C02+也可被莽草酸途径的第22007，27：108—132．
个酶脱氢奎尼酸合成酶利用m，，有利于提高脱氢奎 ‘73裟_品,。heHan。ndS。B一。,蛊蠹：刍品：‘pa∞1．d等苫一：尝：
尼酸合成酶的活性。野生环境中，桦褐孔菌可能通过 c⋯ultu，reo¨删“sobl／quu5[J]·L以Sci，2005，77：2438一
寄主的木质部获得无机离子包括金属离子。研究表 [8]Kukulyansk世aTA，KurchenkoNV，KurchenkoV．P，．et
明，重金属离子是潜在的氧化剂，它们的存在对菌丝 a。。l。．，2譬警1芝三27麟：。of(m“eclhan。ig．ns。)prio。du。c。e。d。，：翥
体生长还有氧化胁迫作用‘17I。多酚类化合物具有显 c。u。lt，iv。a‘。8‘吼g“3[J]·P一‘2
B触^i”膨‘”灏以’200238：
著的抗氧化和清除自由基活性[18]。因此，Cu2+、[91Babits．kais，VG，S⋯hche．rbaV，V，1攀nnikoV8，N-V’婴18nin
Mn2+、Zn2+、C02+等金属离子对水解鞣质积累的促Fr．)Pildt(Chaga)(Aphyllophoromycrtideae)[J]．Primcomplexirommcolelnal
tqmU5IlrUUIⅡ』刀∞20‘“5o口 Mj、rcl5·：
进作用还可能是由于氧化胁迫诱导了水解鞣质生物 [10]鬈竺急≮糕。。2i00J0,A3．6：col0439rim-44。4t．，yoftotalph。。oli。。
合成的增加，一部分保留在细胞内清除胞内自由基， Aw。ith‘，留裂ylb9d6ie5-，phl06s：plh404t翟1c”16”ag“协u小
另一部分分泌到胞外，平衡细胞外部的氧化胁迫。野 [11]MoralsS，．Nas?i．m．emoE．，QueirOZC，e．ta1．Stu⋯dies，on
，生环境的温差起伏、紫外辐射以及病原微生物的感 嬲等未刊紫：：篙”“删“”woodu上。
染都是氧化胁迫因子，这些因子的长期存在可能是 [12|sB。iiS。。h。i。,。JiPnreg。D。．，P20laon4t．P。枷枷以5‘植物多酚’[M]·Belji“8：
野生桦褐孔菌积累水解鞣质主要原因。本研究通过 [131 O．ss，ipo．vY：salmi鼍enJP，O，ssipo．V：s：．eta．1·．Gallic，acidand
探索鞣质积累的碳、氮源和pH以及添加适当的金 intermediatecompoundof theshikimatepathwayn
arolysaDIetanninsareiormeQinDIrcnleaes
iroIl[J]ln．
V v 日
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细辛挥发油对植物病原真菌的抑制作用研究
刘海燕1，范 婧1，高微微r，国 辉1，李荣英2，李学兰2
(1．中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094f2．年国医学科学院
中国协和医科大学药用植物研究所云南分所，云南景洪666100)
摘 要；目的测定细辛挥发油抗药用植物病原真菌的活性，探讨其抗菌作用机制。方法 以“甲霜灵”和“农抗
120”为对照农药，采用菌丝生长速率法测定细辛挥发油对5种植物病原真菌的毒力作用，求得毒力方程和ECso，比
较细辛挥发油与两种常用农药的作用；以枸杞炭疽病菌为作用对象，采用电导率法测定细辛挥发油对菌丝细胞膜
的损伤作用。结果在5种供试菌中，细辛挥发油对西洋参疫病菌的抑制作用最强，ECso值为59．70pg／mL，与“甲
霜灵”相近；对枸杞炭疽病菌抑制作用最弱，EC；。值为410．20gglmL，介于“甲霜灵”和“农抗120”之问，对砂仁叶枯
病菌、烟草赤星病菌、土生链格孢菌的EC；。在296．48～334．13ttg／mL，高于“甲霜灵”，与“农抗120“相近。供试菌在
细辛挥发油作用5．0、10．0h后，菌丝细胞外渗液电导率值随着作用时间延长丽增加。分别为7．9001、9．4760gS／
cm，明显高于空白对照组1．8677、1．7956pS／cm(P组。结论 细辛挥发油对5种植物病原真菌的抑制作用居于“甲霜灵”和“农抗120”之间，细辛挥发油可以造成枸杞
炭疽病菌菌丝细胞膜损伤，引起内容物外渗．细胞膜是细辛挥发油对植物病原真菌的作用靶点之一。
关键词：细辛；挥发油；植物病原真菌；抗菌活性
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)12—1878一04
Inhibitionofessentialo lfromAsarumheterotropoidesvat．mandshuricum
againstplantpathogenicfungi
LIUHai-yanl，FANJin91，GAOWei—weil，GUOHuil，LIRong—yin92，LIXue—lan2
(1．InstituteofMedicinalPl ntDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences’andPekingUnionMedicalCollege，
Beijing100094，ChinaI 2．I stituteofMedicinalPl ntDevelopment，YunnanBranch，ChineseAcad my
ofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCo lege，Jinghong666100，China)
Keywords：AsarumheterotropoidesFr．Schmidtvar．mandshuricum(Maxim．)Kitag；essentialoil；
plantpathogenicfungi；antifungalactivity
细辛AsarumheterotropoidesFr．Schmidtvar．
mandshuricum(Maxim．)Kitag．为马兜铃科草本
植物，细辛全草干燥后，在我国作为重要中药，主要
用于治疗感冒、鼻炎、喉炎、哮喘、胃炎、口腔糜烂、风
湿性关节痛等症。有文献报道细辛提取物对人类致
病菌白色念珠菌、伤寒杆菌以及引起食物腐败的黄
曲霉、黑曲霉有抑菌作用[1’23；另外对人参黑斑病菌
Alternariapan x、西洋参根疫病菌Phytophthora
cactorum、腐皮镰孢Fusariumsol n 、番茄灰霉病菌
Botrytisc nerea等植物病原菌也具有较好的抗菌效
果[3“]。上述研究结果提示，细辛对环境中气生和士
生的有害微生物均有一定的作用，具有开发成为植
物杀菌剂的潜力。在前期的研究中，笔者通过对不同
溶剂提取的细辛提取物的抑菌作用比较，发现细辛
收稿日期；2007—03—15
基金项目：国家“十五”科技专项创新药物与中药现代化项目资助(2001BA701A58)
作者简介：刘海燕(1979一)，女，内蒙古人，北京协和医科大学在读研究生，主要从事药用植物抗菌活性研究。
*通讯作者高微微Tel8LFax：(010)62899737E—mail：gaovvll8@sina．com
万方数据
影响桦褐孔菌培养菌丝体水解鞣质积累的因素
作者： 杨士钊， 郑维发， YANG Shi-zhao， ZHENG Wei-fa
作者单位： 徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(12)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
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