全 文 :·358· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月
制剂与质量
桦褐孔菌胞外多糖合成的深层发酵条件研究
陈才法1,项小燕2,顾 琪1,郑维发”,魏江春1
(1.徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏徐州 221116}
2.安庆师范学院生物技术系,安徽安庆246000)
摘 要:目的 探索桦褐孔菌深层发酵体系中胞外多糖积累的最佳碳、氮源和pH值。方法采用深层发酵法培养
桦褐孔菌,通过添加不同的碳、氮源和改变pH值观察胞外多糖的积累。发酵液中的总糖用硫酸一蒽酮法测定,还原
糖以DNS法测定,总糖减去还原糖即为胞外多糖的量。结果桦褐孔菌深层发酵体系中有利于胞外多糖合成的最
佳碳源为2%的麦芽糖,氮源为0.4%的蛋白胨,最适pH值为5.5。结论最佳单因子组合对桦褐孔茵胞外多糖积
累有协同效应,组合后的发酵体系中胞外多糖的量达7.8g/L。
关键词:桦褐孔菌;深层发酵;胞外多糖
中图分类号:R282.2;R286.02文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)03—0358—04
Submergedfermentationconditionsforsynthesisofextracellularpolysaccharide
byInonotusobliquus 、 一
CHENCai—fal,XIANGiao—yan2,GUQil,ZHENGWei—fal,WEIJiang—chunl
(1.KeyLaboratoryforBiotechnologyonMedicinalPl ntsofJiangsuProvince,XuzhouNormalUniversity,Xuzhou221116,
China;2.DepartmentofBiotechnology,AnqingNormalCo lege,Anqing246000,China)
Abstract:ObjectiveTooptimizethesourcesofcarbonandnitrogenandpHvaluefavoringthe
accumulationofextracellularpolysaccharidesinthesubmergedfermentationofIn otusobliquus.Methods
Theaccumulationofextracellularp01ysaccharidesw smonitoredinthesubmergedfermentationofI.
obliqUU$bysupplementationofvar uscarbonandnitrogensourcesandalterationof nitialpHlevel.The
totalsugarwasdeterminedbysulfuricacid—anthronemethod;sugarwasreducedbyDNSmethod;the
accumulationofextracellularpolysaccharidesw scalculatedbysubtractingthereductivesugarf omthe
totalsugar.ResultsTheoptimalsurbsergedfermentationfavoringtheaccumulationofextracellular
polysaccharidesconsistedof2% maltoseand0.4%peptoneasthecarbona dnitrogensources,
respectively,andthepHvaluewas5.5.ConclusionThecombinationofoptimalc rbonandnitrogen
sourcesandpHlevelindicatssynergismontheaccumulationofextracellularpolysaccharidesinthe
submergedfermentationofI. bliquus.Theamountofextracellularpolysaccharidesisupto7.8g/Lat he
endoffermentation.
Keywords:InonotusobliqUU$(Pers:Fr.)Aoshima;submergedfermentation;extracellular
polysaccharides
桦褐孔菌Inonotusobliquus(Pers:Fr.)
Aoshima属担子茵亚门层菌纲非褐菌目多孔菌科褐
卧孔菌属的一种药用真菌,分布于俄罗斯北部、北
欧、日本北海道以及我国长白山和大兴安岭等北纬
40。---50。的地区[¨。桦褐孔菌在俄罗斯、北欧、日本、
美国和韩国被广泛用来治疗恶性肿瘤‘副、糖尿病、心
血管疾病、肝病嘲和艾滋病‘引。桦褐孔菌多糖是桦褐
孔菌的重要药理活性成分之一,对S。。。肉瘤有显著
收稿日期:2006—04—13
。
基金项目:江苏省高校自然科学研究计划重大基础研究项目(05KJA36012)I江苏省自然科学基金项目(BK2006034),徐,}l市科技计划
重点项目(06XZA008)
作者简介:陈才法(1963一),男,江苏苏州人,副教授,从事药用植物生物技术研究.
*通讯作者 郑维发TelI(0516)83403179E—mail:yyzw@xznu.edu.cn 。
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·359·
的抑制作用口],菌丝体多糖能有效地刺激巨噬细胞
分泌N0、IL一1、IL一6、TNF—a细胞因子,显著提升机
体免疫水平,通过调整机体的免疫状态间接地杀伤
肿瘤细胞[6]。用深层发酵法生产桦褐孔菌多糖研究
始于20世纪末的韩国,我国的相关研究出现在
2004年[7.s]。但以上报道均以菌丝体的生物量为指
标确定发酵条件。本研究以桦褐孔菌多糖积累为指
标,开展了碳、氮源和pH值对桦褐孔菌深层发酵体
系中胞外多糖积累研究,以期为桦褐孔菌多糖的规
模化生产提供参考。
1材料与仪器
3,5一二硝基水杨酸(DNS)(北京韦斯实验用品
有限公司);葡萄糖(glucose)、蛋白胨(peptone)、酵
母膏(yeastextract)、磷酸二氢钾(KH2PO‘)等(中国
医药集团上海化学试剂公司)。
桦褐孔菌采自长白山牡丹江、镜泊湖火山口活
桦树的树干,标本由俄罗斯国家科学院圣彼得堡真
菌研究所MargaritaA.Bondartseva教授鉴定,保
存于江苏省药用植物生物技术重点实验室,编号:
LBMP2004005。经过组织分离,获得PDA试管菌
种,在4℃冰箱中避光保存。将桦褐孔菌PDA种接
入由葡萄糖(2%),蛋白胨(0.3%),KH。PO。
(0.1%),MgS04·7H20(0.05%),CaCl2
(o.01%),pH值自然(pH5.5)的液体培养基,在
26℃、振荡频率为140r/rain的条件下振荡培养
8d,得一级摇瓶种子,作为实验菌种,备用。
Flexi--DryMP冷冻干燥机(USPat#4,823,
478);722光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限
责任公司);BP一211D型电子天平(德国赛多利斯
公司);HHB11电热恒温培养箱(上海跃进医疗器
.械厂);FLUKO匀浆器(上海弗鲁克流体机械制造
有限公司);DHZ--032R型空气浴恒温振荡器(上海
申能博彩生物科技有限公司);PHSJ~3F型pH计
(上海雷磁仪器厂)。
2方法与结果
2.1碳源对胞外多糖积累的影响:以2.5%米粉、
葡萄糖、蔗糖、半乳糖、D-木糖、麦芽糖代替一级摇
瓶中的葡萄糖(同时设空白对照,即不专门加碳源),
其他成分不变,在26℃、振荡频率为140r/rain的
条件下振荡培养,每天测定胞外多糖的积累。以硫
酸一蒽酮法测定发酵液总糖[9],DNS法测定发酵液
中的还原糖口引。总糖减去还原糖即为胞外多糖。8d
后收集菌丝体和提取胞外多糖并称定质量。结果见
表1。可见在相同质量浓度下不同碳源对桦褐孔菌
胞外多糖积累有一定的影响。其中以2.5%的麦芽糖
为碳源时胞外多糖积累量达到最高,为2.75g/L。其
次为米粉、木糖和蔗糖,均在2.4g/L左右。以葡萄
糖为碳源的发酵液中胞外多糖积累量较低,仅为
1。9g/L左右。实验结果还显示,不同碳源对菌丝体
的积累量影响显著,其中以葡萄糖为碳源的培养基
其菌丝体干质量达9.2g/L。而以米粉、木糖和蔗糖
为碳源的发酵液中菌丝体干质量仅有5.7g/L。麦
芽糖为碳源的菌丝体干质量仅有2.1g/L左右。因
此以麦芽糖为碳源的发酵液培养基对胞外多糖的积
累最为有利。 ,
表1不同碳源对胞外多糖积累的影响(i±s,痒一5)
Table1 Effectsofvariouscarbons urcesonaccumulation
ofextracelhlarpo ysaccharides(i士$。n=5)
碳源————————————————————■———————————_
培养液内
胞外多糖/(g·L-1)菌丝体干质量/(g·L-1)
2.2氮源对胞外多糖积累的影响:以酵母膏、黄豆
粉、麦皮、(NH。)。SO。、KNO。为氮源(同时设空白对
照,即不专门加氮源),取代一级摇瓶中的蛋白胨,取
量皆为0.6%,其他发酵条件不变,在26℃、振荡频
率为140r/rain的条件下振荡培养,每天测定胞外
多糖的质量分数。8d后收集菌丝体和提取胞外多
糖并称重。不同氮源对桦褐孔菌胞外多糖的积累也
有明显的影响。结果见表2,可见以蛋白胨和酵母膏
为氮源的发酵液中胞外多糖积累量达到近2g/L,
而以黄豆粉和麦皮为氮源的发酵液中多糖的积累量
仅为1.5g/L左右。以无机氮为氮源的发酵液中胞
外多糖只有很少的积累。不同氮源也影响菌丝体干
质量的积累。以酵母膏为氮源的发酵液中菌丝体的
干质量达6.5g/L,而以蛋白胨为氮源的发酵液中
菌丝体干质量积累不超过3g/L。以黄豆粉为氮源
的发酵液中菌丝体干质量仅为2.2g/L左右,以麦
皮为氮源的发酵液中菌丝体的积累进一步减少。以
无机氮为氮源的发酵液中菌丝体生长十分缓慢(表
2)。因此,以酵母膏为氮源的深层发酵培养基有利于
桦褐孔菌胞外多糖的积累。
2.3 pH值对胞外多糖积累的影响:培养基的组成
与一级种子培养基一致,设定起始pH值为4.5、5.5、
6.5、7.5和8.5,在26℃、振荡频率为140r/rain的
万方数据
·360· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月
表2不同氮源对胞外多糖积累的影响G+s,n----S)
Table2 Effectsofvariousnitrogensources
onaccumulationofextracellular
polysaccharides(iq-s,一一5)
培养液内
氮源1西否丽/i(gTL百1画丽丽i/而(gL胞外多糖 ·q)菌丝体干质量 ·。)
条件下振荡培养,每天测定胞外多糖的质量分数。8
d后收集菌丝体和提取胞外多糖并称定质量。不同
pH值对桦褐孔菌胞外多糖的积累有显著的影响,
见表3。pH4.5时胞外多糖积累仅为0.5g/L。pH
5.5时,胞外多糖积累上升到1.4g/L左右。pH6.5
时,胞外多糖积累量达到2.42g/L的最高水平。pH
进一步上升到7.5和8.5时,胞外多糖积累又分别
下降为0.16、0.18g/L。不同起始pH值对菌丝体
干质量也有显著影响。pH4.5以下菌丝体生长十分
缓慢,pH5.5~6.5时达到最大值6.9~7.4g/L,
pH值进一步上升为7.5和8.5时,菌丝体干质量分
别下降到0.39、0.29g/L。
表3不同pH值对胞外多糖积累的影响(i士g,靠一5)
Table3 EffectsofvariouspHvaluesonaccumulation
ofextracellularpolysaccharides(i士S,矗一5)
培养液内
pH值一胞外多糖/(g·L一1)菌丝体干质量/(g·L-1)2.4最佳碳、氮源起始比例对胞外多糖积累的影
响:将最佳碳、氮源按大中小3个比例替代原有培养
基中的碳、氮源,其他成分不变,灭菌接种后在
26℃、振荡频率为140r/min的条件下振荡培养,
每天测定胞外多糖的积累和还原糖的消耗。发酵终
止后测定菌丝体和胞外多糖的干质量。结果见图1。
实验结果显示最有利于桦褐孔菌多糖积累的碳、氮
源为麦芽糖和蛋白胨。从设定的麦芽糖3个起始比
例来看,麦芽糖在桦褐孔菌发酵培养体系中消耗的
速率基本一致,在发酵终止时,比例为2%的麦芽糖
残留最小(o.2%左右),而起始比侧为3%和4%的
麦芽糖分别还有0.95%和1.9Z的残留。不同起始
比例的麦芽糖对桦褐孔菌胞外多糖的积累没有显著
影响,对菌丝体干质量积累也没有显著影响。因此采
用2%比例的麦芽糖可以最大限度地利用碳源。
图1起始麦芽糖比例对单糖利用速率的影响
(i士S,n=5) ,
Fig·1Effectsofinitialm ltoseproporationonassimi—
lationofmonosaccharide(i士S,一=5)
起始蛋白胨比例对麦芽糖利用率有一定的影
响。实验结果显示,蛋白胨比例为0.2%和0.40A时
在发酵的前6d麦芽糖消耗的速率基本一致,从第7
天开始,蛋白胨比例为0.4Z的发酵液中麦芽糖消
耗速率显著增加,直到发酵终止。起始蛋白胨比例为
0.6Z的发酵液中麦芽糖消耗速率在第2天就显著
高于前两个比例,但在第6天时与起始蛋白胨比例
为0.4Z的一致,第8天到第12天却低于起始蛋白
胨比例为0.4%的发酵液对麦芽糖的消耗速率(图
2)。不同起始蛋白胨比例对胞外多糖积累没有显著
的影响。对菌丝体干质量却有一定影响。其中以起
始比例为0.4%蛋白胨为氮源时有利于菌丝体干质
量积累(表4)。·
圈2蛋白胨比例对葡萄糖消耗的影响(膏士S,n一5)
Fig.2Effectsofpeptoneproporationonconsumption
ofglucose(i士s,露=5)
2.5单因子优化组合试验:将最佳碳源、氮源和最
适pH值进行组合,在26℃、振荡频率为140r/rain
的条件下振荡培养14d,每天测定胞外多糖和还原
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第3期2007年3月·361·
衰4起始蛋白胨比例对菌丝体干质量和胞外多糖积累的
影响(i士s,万一5)
Table4 Effectsofinitialpeptoneproporationonaccumu-
lationofmycellalbiomassndextracellular
polysaccharides(i士$,一=5)
蛋白胨比例—丽5西孬i瓦iI了i—看歪石j焉西i瓦面培养液内
糖质量分数以及pH值的变化。还原糖测定参照文
献Elo]所述的方法进行。结果显示,最适碳源是比例
为2%的麦芽糖,最适氮源是比例为0.4%的蛋白
胨,最适pH值为5.5。将最适碳、氮源和最适pH组
合,开展单糖消耗速率、pH值变化以及胞外多糖积
累实验。结果表明,麦芽糖在培养的第1天就下降了
8g左右,第2天到第4天下降速率有所减弱,但第
4天后麦芽糖消耗速率增加,在第10天完全耗尽。
pH值也从5.5下降到4.2左右,而胞外多糖积累则
在第9天达到7.8g/L。最适单因子组合后胞外多
糖积累大大超过单因子水平(图3)。
0 2 4 6 8 lO
培养时间/d
6.O
50
4.O
3.O
图3碳、氮源及pH值最优组合后麦芽糖消耗及胞外多
糖积累曲线(i士$,露一5)
Fig·3Curveofmaltoseconsumptioninmediumwith
optimalcombinationofcarbonandnitrogen
andpHvalueandaccumulationofextrace—
llularpolysaccharides(i士J,矗=5)
3讨论
碳是构成菌丝体细胞骨架、合成多糖和蛋白质
等代谢产物的重要原料,并为菌丝体的生长提供能
量。在桦褐孔菌发酵培养基碳源筛选选用的6种碳
源中,有机碳对胞外多糖的积累作用远远高于无机
碳。有机碳中,以麦芽糖的效果最好。以麦芽糖为碳
源,除了胞外多糖积累量显著提高外,对菌丝体生物
量的积累也有促进作用。
氮源是菌丝体合成蛋白和其他含氮代谢物的重
要原料。本研究选用了4种有机氮源和两种无机氮
源。结果表明有机氮源对桦褐孔菌胞外多糖的积累
远远高于无机氮。这可能是因为有机氮源含有丰富
的蛋白质、多肽、游离的氨基酸以及少量的脂肪、微
量元素和生长素等,因而有利于菌体的生长和各种
代谢产物的合成。有机氮源中,蛋白胨对胞外多糖的
积累明显高于其他有机氮。
pH对微生物的影响是由于氢离子与细胞质膜
上的酶相互作用的结果,细胞内pH值合适与否,会
影响细胞内酶的活性。另外,pH对金属离子形成复
合物的溶解度有很大影响,从而影响微生物对基质
的利用速度,它可以通过引起膜的通透性发生变化
而影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的积
累。本研究结果表明pH值5.5~6.5最有利于桦褐
孔菌菌丝体生长和胞外多糖积累。在此pH范围内,
麦芽糖利用率最高。
单因子最佳组合的发酵体系中,桦褐孔菌对碳、
源的利用率达到最高水平,胞外多糖积累在第9天
即达到最大值,说明最佳碳源、氮源和pH之间的组
合对胞外多糖的积累有协同作用。桦褐孔菌是一类
药理活性显著但生长速度十分缓慢的大型真菌,桦
褐孔菌多糖是该菌重要的药理活性成分之一。因此
探索桦褐孑L菌深层发酵的最适碳氮、源和pH与胞
外多糖积累的关系,对桦褐孔菌胞外多糖的规模化
‘ 生产有着重要的指导意义。
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”甜甜体”抡9
6
3
O—I.1.s一\磐盥镣犀删零州母剁纽
万方数据
桦褐孔菌胞外多糖合成的深层发酵条件研究
作者: 陈才法, 项小燕, 顾琪, 郑维发, 魏江春, CHEN Cai-fa, XIANG Xiao-yan, GU Qi
, ZHENG Wei-fa, WEI Jiang-chun
作者单位: 陈才法,顾琪,郑维发,魏江春,CHEN Cai-fa,GU Qi,ZHENG Wei-fa,WEI Jiang-chun(徐州师范
大学,江苏省药用植物生物技术重点实验室,江苏,徐州,221116), 项小燕,XIANG Xiao-
yan(安庆师范学院,生物技术系,安徽,安庆,246000)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(3)
被引用次数: 6次
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