全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

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不同产地石斛属种质资源的 ISSR 遗传多样性分析
卢家仕 1, 2, 3，卜朝阳 1*，吕维莉 2，苏建睦 3，黄昌艳 1，李春牛 1
1. 广西农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007
2. 广西农业科学院 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007
3. 广西大学农学院，广西 南宁 530004
摘 要：目的 对 24 份不同产地石斛属样品的遗传多样性和亲缘关系进行分析。方法 采用 ISSR 分子标记技术和非加权
平均距离法（UPGMA）对 24 份石斛属样品进行遗传多样性和聚类分析。结果 从 100 条 ISSR 引物中共筛选出 6 条多态性
稳定、清晰的引物， 24 份石斛样品共扩增出 847 个 DNA 片段，平均每个引物扩增出 141 个 DNA 片段，其多态性为 100%。
结论 24 份不同产地石斛样品被划分为 6 个类群，遗传多样性非常丰富。
关键词：石斛属；种质资源；ISSR 分子标记；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)01 - 0096 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.01.018
ISSR analysis on genetic diversity of germplasms resources in Dendrobium SW.
from different habitats
LU Jia-shi1, 2, 3, BU Zhao-yang1, LV Wei-li2, SU Jian-mu3, HUANG Chang-yan1, LI Chun-niu1
1. Flower Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China
2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning
530007, China
3. College of Agronomy, Guangxi University, Nanning 530004, China
Abstract: Objective To analyze the genetic diversity and genetic relationship of 24 plant samples in Dendrobium SW. from different
habitats. Methods The molecular marker technique of inter-simple sequence repeat (ISSR) and unweighted pair-group method with
arithmetic means (UPGMA) were used to study the genetic diversity and cluster analysis of 24 samples. Results Six primers with
stable and clear diversity were sieved from 100 ISSR primers. DNA fragments (847) were amplified from 24 samples, and 141 DNA
fragments were amplified from each primer in average, with 100% of polymorphic bands. Conclusion The 24 samples in plants of
Dendrobium SW. from different habitats are divided into six groups and the genetic diversity is very abundant.
Key words: Dendrobium SW.; germplasms resources; ISSR molecular marker; genetic diversity; genetic relationship

石 斛 属 Dendrobium SW. 植 物 是 兰 科
（Orchidaceae）多年生草本植物，我国有 76 种 2 变
种，具有药用价值和观赏价值[1-2]。药用石斛有 39
种，有润肺生津、活血化瘀、治疗心血管疾病等功
效[3-4]。药用石斛除来自石斛属植物外，石仙桃属、
金石斛属和石豆兰属的植物也被当作石斛使用[5]。
仅从茎、叶等形态上无法完全区别石斛 [6-9]。随
着分子标记的发展，RFLP、AFLP、RAPD、
AP-PCR、SRAP 和 SSR 标记已用于石斛资源研
究和评价[10-20]，但存在缺点，如 RFLP 需同位素放
射；AFLP 需酶切和连接；RAPD 和 AP-PCR 稳定
性、重复性不够好等。
ISSR 是在 1994 年建立的一种分子标记技术[21]，
具有操作简单、多态性和重复性好等优点，已被广
泛应用于遗传多样性、亲缘关系等研究。而用 ISSR
研究石斛的报道较少，多数是研究少数品种或几个
居群间的鉴别[22-27]。本研究用 ISSR 从品种间的居
群间分析 24 份石斛样品的遗传多样性和亲缘关系，
并结合传统分类分析，从而更好地保护和利用石斛
资源，因此具有重要的研究意义。

收稿日期：2012-07-08
基金项目：农业部热带作物种质资源保护项目（12RZZY-39）；广西科技攻关项目（桂科攻 1222009-4）；广西农科院项目（201014，2011YZ11，
2012GW03）
作者简介：卢家仕（1976—），男，广西灵山人，助理研究员，博士研究生，从事植物生理及分子生物学研究。E-mail: lujiashi@126.com
*通信作者 卜朝阳 Tel: (0771)3276924 E-mail:yangnv@126.com
网络出版时间：2012-12-18 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20121218.1013.002.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 1 期 2013 年 1 月

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1 材料与仪器
1.1 材料
石斛样品主要从云南的文山、河口、西双版纳，
海南三亚及广西的玉林、桂平、乐业等地方采集，统
一种植于广西农业科学院花卉研究所玻璃温室资源
圃里。材料的品种及来源详见表 1。供试材料由广西
农业科学院花卉研究所卜朝阳研究员和广西中医药
研究院黄云峰副研究员共同鉴定。
1.2 仪器
Grant GR150 水浴锅；Eppendorf Bio Photometer
RNA/DNA 浓度电度测定仪；Biometra TProfessional
PCR 仪；Eppendorf MixMate PBC—11 5353 混匀仪；
MIKRO 220R 2205 冷冻离心机；BIO—RAD EN
61010—1 电泳仪；北京市六一仪器厂生产的
DYCP—31DN 型电泳槽；Firereader XS D—56—
26.M 凝胶成像系统。
表 1 材料来源
Table 1 Sources of materials
编号 种名 来源 编号 种名 来源
1 铁皮石斛 Dendrobium officinale 广西玉林 13 短棒石斛 D. capillipes 云南西双版纳
2 铁皮石斛 广西桂平 14 鼓槌石斛 云南文山
3 铁皮石斛 云南河口 15 钩状石斛 D. aduncum 云南河口
4 铁皮石斛 云南文山 16 细叶石斛 D. hancockii 云南文山
5 铁皮石斛 云南河口 17 球花石斛 D. thyrsiflorum 云南文山
6 广东石斛 D. wilsonii 广西乐业 18 滇桂石斛 D. guangxiense 云南西双版纳
7 铜皮石斛 D. moniliforme 云南文山 19 蝴蝶石斛 D. phalaenopsis 海南三亚
8 金钗石斛 D. nobile 云南河口 20 细茎石斛 D. moniliforme 云南文山
9 金钗石斛 云南文山 21 流苏石斛 D. fimbriatum 云南文山
10 金钗石斛 云南文山 22 美花石斛 D. loddigesii 云南文山
11 金钗石斛 云南文山 23 束花石斛 D. chrysanthum 云南文山
12 鼓槌石斛 D. chrysotoxum 云南西双版纳 24 铁皮石斛 云南河口

2 方法
2.1 总 DNA 的提取
取新鲜叶片参考 CTAB 法[28]并加以改进提取植
物总 DNA。方法改进如下：在研钵中加少量的 PVP，
剪取约 0.5 g 叶片加适量液氮迅速研磨成粉末；将粉
末转入2.0 mL离心管中，加入经65 ℃预热的800 μL
2% CTAB 提取缓冲液混匀；在 65 ℃下温育 40 min，
期间每隔 10 min 摇动 1 次；取出离心管冷却到室温，
10 000 r/min 离心 5 min，取上清液到新离心管中，
加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1），翻转混匀；10 000
r/min 离心 10 min，取上清液到新离心管中；再加入
等体积的酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）混匀；10 000
r/min 离心 10 min，取上清液于新离心管；加 2/3 体
积经−20 ℃预冷的异丙醇沉淀 DNA；10 000 r/min
离心 5 min，弃上清，沉淀用 70%乙醇分别洗涤 2
次。室温风干后 DNA 溶于 100 μL 1 倍的 TE 中，加
入 1 μL 10 mg/mL RNase 溶液，37 ℃处理 1 h 后，用
1%琼脂糖电泳检测 DNA 的质量，用紫外分光光度
法检测 DNA 的纯度和质量浓度，质量浓度调整为
30 ng/μL 用于 ISSR 分子标记技术分析，−20 ℃贮存
备用。
2.2 引物的合成与筛选
ISSR 引物的合成根据加拿大哥伦比亚大学
（University of British Columbia，UBC）公布的引物序
列（http://www.biotech.ubc.ca/ser vices/naps/primers.
html），由上海杰瑞生物工程有限公司合成，共 100
条，从中筛选出 6 条扩增产物条带清晰、多态性较好
的引物用于 24 份石斛种质资源遗传多样性分析。
2.3 ISSR 反应体系及程序
参考 ISSR 反应体系[29]稍加改进：采用 20 μL
PCR 反应体系，包含 2.0 μL 10×缓冲液，0.4 μL
dNTPs（10 mmol/L），0.4 μL Taq DNA Polymerase
（2.5 U/μL），1 μL 引物，1 μL（30 ng/μL）DNA 模
板，其余用超纯水补足至 20 μL。扩增程序：94 ℃
预变性 7 min；接下来 40 个循环（94 ℃、45 s，53 ℃
退火 45 s，72 ℃延伸 2 min）；72 ℃延伸 10 min；
最 终 贮 存 于 4 ℃ 。 PCR 扩 增 在 Biometra
TProfessional PCR仪上完成。ISSR扩增产物以2 000
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bp Ladder Plus Marker 为相对分子质量标记，每个产
物加入 3.3 μL 的有核酸染料的 6×缓冲液充分混
匀，取 8 μL 在 2.0%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲
液为 1×TAE，电压为 120 V，电泳 45 min 后在凝
胶成像系统上观察、拍照，检测 ISSR-PCR 条带。
2.4 数据处理
ISSR-PCR 扩增产物用 Word 2003 按条带的有
无分别统计条带。有条带记为“1”，无条带记为“0”。
把得到的“0，1”分布矩阵导入软件 NTsys 2.10 e，
用 DICE 法计算遗传相似系数，用 UPGMA 法进行
聚类分析，构建树状聚类图。
3 结果与分析
3.1 DNA 提取结果
基因组 DNA 经 1%的琼脂糖电泳检测，结果显
示，各个泳道均出现一条清晰的 DNA 条带，无蛋
白质和 RNA 污染，无拖尾现象（图 1）。紫外分光
光度法检测所有 DNA 的 A260/A280均在 1.78～1.83，
质量浓度在 280～340 ng/μL，说明改良的 CTAB 法
提取的 DNA 纯度较高，质量浓度较均匀，符合实
验的要求。
3.2 引物筛选扩增结果
本实验用 100 条 ISSR 引物对 3 份石斛属植物

图 1 CTAB 法提取的 24 份石斛样品的 DNA 电泳图
Fig. 1 DNA electrophoresis of 24 germplasms resources
in Dendrobium SW. by CTAB method
材料基因组 DNA 进行预扩增来筛选引物，获得 6
条扩增效果较理想的引物（表 2）。用这 6 条引物对
所有 24 份材料进行扩增检测。结果显示，扩增出稳
定的多态性条带共 847 条，每个引物在石斛的基因
组 DNA 中扩增出 103～186 个 DNA 片段，平均每
个引物扩增出 141.17 条 DNA 片段。其多态性为
100%，说明石斛属植物间的异质性较高，遗传基础
差异较大，石斛的遗传多样性非常丰富。其中引物
UBC900 扩增的条带最多（186 条），图 2、3 分别
是引物 UBC840 和 UBC899 的扩增结果。
3.3 遗传相似系数与聚类结果分析
用 6 对引物组合扩增的 847 个 ISSR 标记数据，
表 2 6 个 ISSR 引物的扩增结果
Table 2 Amplification of six ISSR primers
引物编号 引物序列 总扩增位点 / 个 多态性扩增位点 / 个 多态性比率 / %
UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 103 103 100
UBC827 ACACACACACACACACG 108 108 100
UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 170 170 100
UBC864 ATGATGATGATGATGATG 104 104 100
UBC899 CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA 176 176 100
UBC900 ACTTCCCCACAGGTTAACACA 186 186 100
共计 847 847
平均 141.17 141.17 100

M-Marker
图 2 UBC840 引物对 24 份石斛样品的 ISSR 扩增结果
Fig. 2 ISSR amplification of Primer UBC840 on 24
plant samples from Dendrobium SW.

M-Marker
图 3 UBC899 引物对 24 份石斛样品的 ISSR 扩增结果
Fig. 3 ISSR amplification of Primer UBC899 on 24 plant
samples from Dendrobium SW.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
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用Ntsys 2.10e软件计算各个品种资源的遗传相似系
数，利用 UPGMA 聚类分析方法构建 24 份石斛属
植物的亲缘关系系统树，见图 4。由图可见，6 对
ISSR 引物遗传在相似系数 0.119～0.545 能将 24 份
石斛属材料完全分开。在相似系数 0.196 处，24 份
石斛属品种资源被分为 6 个类群。每个类群又分为
不同的小组。云南文山的流苏石斛单独成为一类群，
与其他 5 个类群的相似系数最远，为 0.119；云南文
山铁皮石斛（4 号）与云南河口铁皮石斛（5 号）相
似系数最近，为 0.545。
第 I 类群包括 7 个种，由 6 种铁皮石斛和 1 种
铜皮石斛组成。第 II 类群包括 4 个种，都由金钗石
斛组成。第 III 类群包括 3 个种，由 2 个鼓槌石斛和
1 个细茎石斛组成。第 IV 类群包括 4 个种，由广东
石斛、钩状石斛、滇桂石斛和蝴蝶石斛组成。第Ⅴ
类群包括 5 个种，由球花石斛、美花石斛、细叶石
斛、短棒石斛和束花石斛组成。第 VI 类群单独由
云南文山的流苏石斛组成。

图 4 24 份石斛样品的 UPGMA 聚类树状图
Fig. 4 UPGMA dendrogram of 24 samples in Dendrobium SW.
4 讨论
在传统分类中，吉占和[30]曾把我国石斛属的 57
个种划分为 9 个组，分别是剑叶组、圆柱叶组、禾
叶组、心叶组、基肿石斛组、草叶组、黑毛组、顶
叶组和大花石斛组。《中国植物志》[31]把我国石斛
属的 74 个种划分为 12 个组，分别是禾叶组、顶叶
组、石斛组、心叶组、瘦轴组、叉唇组、距囊组、
黑毛组、草叶组、基肿组、剑叶组和圆柱叶组。
如图 4 所示，第 I 类群中，6 个铁皮石斛都聚
合为一类，且亲缘关系较近，尤其是云南文山、
河口的两个铁皮石斛亲缘关系最近；第 II 类群 4
个种都是云南河口、文山的金钗石斛，两两聚合
后合为一类群；第 I、II 类群聚为一组，都属于石
斛组，这与传统的分类一致。第 III 类群 3 个种中，
2 个是鼓槌石斛，属于顶叶组，1 个是细茎石斛，
属于石斛组，这组聚合与传统的分类不一致。I、
II、III 类群聚为一大组。
第 IV 类群 4 个种中，滇桂石斛、蝴蝶石斛、
钩状石斛与广东石斛，石斛组与瘦轴组的钩状石斛
聚为一类，这与传统的分类不一致，有待进一步的
研究。第 V 类群 5 个种中，4 个属于石斛组，两两
聚合后再与属于顶叶组的球花石斛聚在一起，这点
与传统分类不一致。第 IV、V 类群聚合到一起，然
后与 I、II、III 类群聚到一起，成为一大类群。最后
与第 VI 类群组成总的聚类树状图。结果说明，亲
缘关系的远近与石斛的来源相关性不大，但与品种
相关性较大。如第 I 类群 6 个铁皮石斛中，3 个来
自云南河口、1 个来自云南文山 1 个、2 个来自广西，
它们并没有单独按来源地聚类分组，而有一定的交
叉。第 II 类群 4 个金钗石斛较好地聚为一类，但并
不是完全按来源地分类，先是两个文山的先聚合，
再是文山的和河口的聚合，最后 4 个再聚合到一起。
ISSR 分子标记的聚类分析结果与传统的分类
方法基本一致，但有少数几个存在一定的差异，这
可能跟石斛属长期异花授粉和自然选择及遗传背景
有关。本研究用 ISSR 分子标记分析 24 份石斛属品
种资源的遗传多样性，有较多的引物扩增不出条带，
如 UBC862、UBC886；有些引物扩增条带不多不清
晰，如 UBC812、UBC825；有的引物部分扩增出条
带，但少数几个没有出条带，如 UBC836、UBC899；
精选 6 条引物（表 2）扩增出 847 条 DNA 片段，其
多态性为 100%。原因是筛选的引物多态性好，品
种间的基因组位点多，遗传差异较大，具有很高的
遗传多样性，说明我国的石斛属品种资源非常丰富。
有研究认为，SSR 序列的进化率比大多数其他类型
的 DNA 都高，容易出现高度变异，因此 ISSR 标记
可检测出基因组许多位点的差异而表现出较高的多
态性[32]。
我国的石斛种质资源非常丰富，但因其药用价
值较高、观赏性强、社会需求量大，加上石斛的繁
殖力底且要求的生态环境较高，人类过度的采挖，
导致很多名贵的石斛资源濒临灭绝，如野生铁皮石

1
24
3
2
4
5
7
8
10
9
11
12
14
20
6
15
18
19
22
16
13
23
17
21
0.545 0.474 0.403 0.332 0.261 0.190 0.119
I
II
III
IV
V
VI
相似系数
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斛。现在很多的石斛种质资源得到收集，通过传统
的形态标记，细胞学研究结合现在的 ISSR 等分子
标记，把同名异种、同种异名或不同地方来源的品
种资源进行客观的种质鉴定、弄清它们之间的遗传
变化及亲缘关系，构建相应遗传图谱并进行相应的
分子辅助育种，从而更好地指导科研和实践生产工
作，更好地开发、利用和保护我国石斛属植物种质
资源。
致谢：广西中医药研究院黄云峰老师鉴定部分
样本。
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