全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 6 期 2012 年 6 月

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四倍体平贝母的诱导及鉴定
隋 博 1，许 媛 1，马玉滨 2，韩永忠 2，孙春玉 1，张美萍 1，王 义 1*
1. 吉林农业大学，吉林 长春 130118
2. 吉林省参茸办公室，吉林 长春 130021
摘 要：目的 运用组织培养技术诱导平贝母四倍体。方法 采用不同质量浓度（200、500、1 000、2 000 mg/L）秋水仙素
和不同的诱导时间（12～72 h）处理平贝母愈伤组织。结果 离体培养条件下，平贝母激素自养型培养材料在秋水仙素诱导
下得到四倍体，四倍体染色体 4n＝44，四倍体植株出现明显的多倍体特征。结论 500 mg/L 秋水仙素处理 24 h 为最佳组合，
可以诱导四倍体平贝母以平贝母子球做鉴定材料，获得较好的结果。
关键词：平贝母；四倍体；秋水仙素；组织培养；愈伤组织
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)06 - 1178 - 04
Induction and identification of Fritillaria ussuriensis tetraploid
SUI Bo1, XU Yuan1, MA Yu-bin2, HAN Yong-zhong2, SUN Chun-yu1, ZHANG Mei-ping1, WANG Yi1
1. Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
2. Ginseng and Velvet Office in Jilin Province, Changchun 130021, China
Abstract: Objective To induce the tetraploid of Fritillaria ussuriensis via tissue culture. Methods F. ussuriensis calli were treated
with colchicine at different concentration and time periods. Results Tetraploid was obtained by F. ussuriensis hormone autotrophic
cultural material induced by colchicine in vitro. The chromosome number of tetraploid was 4n = 44. Conclusion The best combination
is 500 mg/L colchicine treated for 24 h and better result is obtained by using the bulb of F. ussuriensis as testing materials.
Key words: Fritillaria ussuriensis Maxim.; tetraploid; colchicine; tissue culture; callus

平贝母 Fritillaria ussuriensis Maxim. 为百合科
植物，以其干燥鳞茎入药，药材名平贝母，又名平
贝，为《中国药典》2010 年版收载品种，具有清热
润肺、化痰止咳的功效。但由于平贝母分布范围较
狭窄、加之不断采挖，野生植株逐渐减少，在栽培
平贝母的过程中种子繁殖育种年限较长，品种退化
严重，染病率高，品质及产量急剧下降。同时贝母
属植物又多生高寒地带，生长期短，产量低，鳞茎
繁殖系数又低，保藏不易，田间管理费时，造成高
成本低效益[1-2]。
近些年有学者对一些植物的组织培养进行了研
究[3-5]，并取得了相应的成果，但针对品种退化、染
病率高等方面研究甚少。据报道多倍体植物由于染
色体加倍，根、茎、叶的产量较高，能较好地满足
药材生产的要求；另一方面，植物染色体倍性的变
化也会导致次生代谢产物量的变化，从而获得有效
成分量高的药用植物[6-7]，形成具有较强生态适应性
和抗逆性品种。因此研究多倍体育种是解决植物育
种和提高抗病率的一种有效手段[8]。本研究旨在寻
找稳定合理诱导多倍体平贝母的方法和条件，为进
一步研究平贝母种质资源和平贝母有效成分提供一
定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试无菌平贝母激素自养型愈伤组织由吉林农
业大学生命科学学院细胞工程实验室培养，材料取
自吉林农业大学生命科学学院标本园，经吉林农业
大学王义教授鉴定为 2～4 年生平贝母 Fritillaria

收稿日期：2012-01-16
基金项目：吉林省财政厅项目；长春净月开发区项目（2009c005）
作者简介：隋 博（1986—），男，在读硕士，研究方向为重要农艺性状基因的分离、功能鉴定及品种改良。
Tel: 13844865413 E-mail: suibo134@126.com
*通讯作者 王 义 Tel: (0431)84533184 E-mail: wanglaoshi2007@tom.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 6 期 2012 年 6 月

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ussuriensis Maxim. 的顶芽、茎和叶。
1.2 方法
1.2.1 多倍体诱导 采用浸泡法将秋水仙素配成
200、500、1 000、2 000 mg/L 的溶液，将激素自养
型愈伤组织切成小块，在上述溶液中浸泡 12、24、
36、48、60、72 h 后取出，无菌水冲洗 3 次，转入
不含秋水仙碱的 MS 培养基进行培养，3 次平行试
验，统计存活率、诱导率及变异率，取平均值。
1.2.2 染色体观察 染色体观察参照陈瑞阳等[9]的
方法，将材料放置在饱和对二氯苯水溶液中，常温
避光浸泡 5～7 h 预处理；把处理过的平贝母类子球
转入 0.075 mol/L KCl 中，前低渗 1～1.5 h；再将平
贝母类子球用蒸馏水经卡诺固定液（乙醇-冰醋酸
3∶1）固定 4～24 h，再依次用 95%、85%乙醇固定
10～30 min 后转入 70%乙醇备用；取平贝母类子球
放在 0.25%纤维素酶＋0.25%果胶酶中，25～28 ℃
酶解 12～15 h；吸去酶液，用双蒸水低渗 0.5～1 h；
吸去双蒸水，注入卡诺固定液再固定 0.5～1 h，取
平贝母类子球均匀涂布在载玻片上，然后在酒精灯
火焰上烘干加 Giemsa 染液染色 1～2 h；用蒸馏水
把染液反复冲洗干净，室温晾干后进行镜检。利用
Nikon Eclipse TS100 倒置显微镜镜检、拍照。采用
Photoshop 7.0 进行照片处理，随机统计 200 个以上
分裂相细胞，统计其中的二倍体与四倍体细胞染色
体数目。
1.2.3 叶片气孔特征观察 将出芽的平贝母对照二
倍体与四倍体，培养 20 d，选取茎长 1.5 cm 的再生
植株叶片尖部 0.5 cm，各 5～10 片。清洗后撕取表
皮置于载玻片上，加盖玻片，随机选取 20 个视野，
进行气孔的密度、大小，细胞长度和宽度的测定。
1.2.4 形态学鉴定 取平贝母对照二倍体和四倍体
再生植株出芽 20 d，叶长 1.5 cm 的对照和诱变处理
材料进行形态学鉴定，考察鳞茎大小、茎粗、根粗。
2 结果与分析
2.1 多倍体诱导
不同质量浓度激素和不同浸泡时间处理后平贝
母进行系统统计，500 mg/L 秋水仙素浸泡 24 h 对四
倍体平贝母的诱导率最高，达到 18.18%，各处理结
果见表 1。
秋水仙素溶液浸泡处理法得到一定比率的平贝
母多倍体和四倍体，多倍体出现的频率随处理浓度的
升高和处理时间的延长先增加后降低。经 SPSS17.0
表 1 不同质量浓度秋水仙素浸泡法处理结果
Table 1 Results of samples soaked by colchicine at different concentration
秋水仙素 / (mg·L−1) 时间 / h 处理愈伤组织 / 个 存活数 / 个 存活率 / % 变异数 / 个 变异率 / % 4n / 个 4n诱导率 / %
200 12 43 19 44.18 11 25.58 4 9.30
24 42 26 61.90 12 28.57 3 7.14
36 46 19 41.30 10 21.73 2 4.34
48 46 25 54.34 15 32.60 1 2.17
60 43 34 79.07 17 39.53 2 4.65
72 46 39 84.78 15 32.60 3 6.52
500 12 44 36 81.81 20 45.45 2 4.54
24 44 29 65.91 13 29.54 8 18.18
36 46 34 73.91 17 36.95 5 10.86
48 45 38 84.44 11 24.44 3 6.67
60 41 28 68.29 11 26.82 5 12.19
72 39 34 87.18 13 33.33 1 2.56
1 000 12 46 38 82.60 10 21.73 1 2.17
24 42 31 73.80 8 19.04 2 4.76
36 46 33 71.74 13 28.26 4 8.69
48 40 30 75.00 9 22.50 3 7.50
60 41 32 78.04 7 17.07 1 2.43
72 47 31 65.95 9 19.14 0 0.00
2 000 12 46 28 60.86 7 15.21 1 2.17
24 47 26 55.31 5 10.63 1 2.12
36 50 43 86.00 9 18.00 2 0.00
48 38 19 50.00 3 7.90 1 2.63
60 42 28 66.66 2 4.76 0 0.00
72 41 26 63.41 2 4.80 0 0.00
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分析数据得出，质量浓度与存活率、变异率和诱导
率均有极显著的相关性，浓度对诱导率有极显著作
用，当达到 500 mg/L 时诱导率表现为极显著。但时
间的显著性不是很明显，根据结果，确定 24 h 为最
适诱导时间。
2.2 染色体鉴定
经染色体鉴定结果表明，用秋水仙素处理后的平
贝母愈伤组织均能得到一定量的多倍体。统计了 300
个可准确计数二倍体染色体的有丝分裂中期细胞，染
色体数目为22的细胞为265个，占观察细胞的88.3%。
平贝母二倍体细胞的染色体数为 2n＝2x＝22（图 1），
平贝母四倍体细胞染色体数为 2n＝4x＝44。经加倍
诱导后形成的变异植株染色体数目为原二倍体的 2
倍，即为同源四倍体。
2.3 叶片气孔特征
取平贝母对照二倍体和四倍体再生植株出芽
20 d，叶长 1.5 cm 的叶片尖部 0.5 cm 观察叶片中的
气孔保卫细胞发现，四倍体的气孔密度明显小于二
倍体，但是保卫细胞的面积有显著的增加（图 2、3），
四倍体的叶绿素明显增多。
分析显示，经过秋水仙素诱导的四倍体材料，
气孔保卫细胞的面积有显著增加（图 3），二倍体平
均为 1 036.8 μm2，四倍体平均 1 670.4 μm2，四倍体
保卫细胞的面积是1.61倍。气孔密度也有显著不同，
二倍体每个视野中平均有 8 个气孔，但是四倍体平

图 1 平贝母二倍体 (A) 和四倍体 (B) 染色体
Fig. 1 Chromosome in diploid (A) and tetraploid (B)
of F. ussuriensis

图 2 二倍体 (A) 与四倍体 (B) 气孔密度比较
Fig. 2 Comparison on stomatal density of diploid (A)
and tetraploid (B)

图 3 二倍体 (A) 与四倍体 (B) 气孔大小比较
Fig. 3 Comparison on stomatal size of diploid (A)
and tetraploid (B)
均仅仅有 4.3 个气孔，显示多倍体特性。
2.4 形态学比较
选取继代两年以上，出芽 20 d，茎长 1.5 cm 的
经诱导的平贝母二倍体与四倍体再生植株进行形态
学比较。平贝母四倍体出现明显的多倍体特征，见
图 4，较二倍体对照，叶片变大变厚、茎粗加粗、
根系加粗。

图 4 二倍体 (A) 与四倍体 (B) 植株比较
Fig. 4 Comparison on plantlets of diploid (A) and tetraploid (B)
3 讨论
随着多倍体的发展，近年来在许多药用植物的
诱导获得多倍体的研究中，多采用种子[10-12]、丛生
芽[13]、不定芽[14]、试管苗[15]或者其部分组织[16]作为
处理材料，诱导率普遍为 30%左右，且死亡率较大。
本实验使用激素自养型培养材料通过不同质量浓度
秋水仙素和处理时间诱导得到了一定数量多倍体材
料，存活率和诱导率较高，经过离体培养诱导的多
倍体，能大规模快速地培养出多倍体培养材料和植
株，可用于生药材使用或者直接栽培的研究。同时
植物在多倍化后一般都会呈现出植株的巨大型，其
内在的有效成分可能会跟着染色体的增加产生变
化，为研究多倍体平贝母的内在有效成分提供了一
定的基础。分化出来的鳞茎通过染色体筛选、鉴定，
得到了四倍体植株。这在平贝母研究中为首次报道，
具有一定的理论和现实意义。
在本实验中，用浸泡法处理平贝母的同时也并
A B
A B
A B
A B
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行的进行了混培法诱导四倍体。但混培法诱导的
四倍体嵌合体较多，诱导效果不是很理想，分析
可能与接触和吸收秋水仙素的部位和时间有关。
多倍体出现的频率随处理质量浓度的升高和处理
时间的延长先增加后降低。以质量浓度 200 mg/L、
处理 60 h 组合诱导产生的多倍体效果最好，但是
嵌合体较多，四倍体诱导率较低；500 mg/L、处
理时间 24 h 的效果最好，存活率、变异率较高，
而且四倍体诱导率达到最高 18.18%。继续升高质
量浓度和延长时间，加倍效果呈下降趋势，畸形
材料增多。综上所述，除外植体生理状态等内在
因素外，秋水仙素等外在因素作用更加显著，这
与郑永强等[17]报道相一致。秋水仙素的质量浓度
和处理时间是影响染色体加倍的最重要的外在条
件。培养基中添加不同质量浓度的秋水仙素和处
理不同的时间对平贝母四倍体的诱导均有一定的
效果，但其效果不如浸泡法处理的效果好。一般
只有生长点的细胞受到秋水仙素的作用之后才能
导致器官或植株加倍。浸泡过程中对于在不同处
理条件下，多倍体的存活率、变异率均有不同程
度的改变。过量的秋水仙素对平贝母有很强的毒
害作用，在使用过程中要注意使用质量浓度和时
间，才能较好地使秋水仙素作用于愈伤组织的胚
性细胞分化出四倍体植株。
同时为准确鉴定平贝母的多倍体诱导率和四倍
体材料，本实验对平贝母的细胞学技术进行了探讨
与改进。相关报道中，染色体的观察一般使用根尖
作为材料，本实验多倍体的诱导使用激素自养型培
养材料，此材料根尖甚少，把培养材料表面的类子
球作为压片材料，获得了分散度与染色较好的染色
体图片。分析可能是因为平贝母子球为白色，没有
多余的色素干扰，且生长旺盛，具有和根尖相似的
性质，可作为供试材料，为以后培养材料的细胞学
鉴定选材提供了一定参考。
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