全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月
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两种中药组方对 D-半乳糖诱导的衰老模型裸鼠皮肤的影响
倪庆纯,郭健敏,肖百全,张 红,曾琳玲,杨 威*
广州医药研究总院,广东 广州 510240
摘 要:目的 研究杭白菊、珍珠粉、当归、丹参组方增加胶原蛋白后对 D-半乳糖诱导裸鼠皮肤衰老模型的改善作用,筛
选疗效好的中药组方。方法 裸鼠 sc D-半乳糖 1 000 mg/(kg·d) 建立亚急性衰老模型,通过检测机体的抗氧化能力、羟脯氨
酸(Hyp)、透明质酸、皮肤含水量及胶原纤维、弹性纤维、皮肤组织学等指标,考察 2 种复方是否具有抗氧化及延缓皮肤
衰老的功效。结果 杭白菊、珍珠粉、当归、丹参组方增加胶原蛋白后具有改善衰老模型裸鼠皮肤含水量,增加皮肤超氧化
物歧化酶(SOD)、I 型胶原蛋白、Hyp 的量;减少皮肤中丙二醛(MDA)生成的作用,同时能显著改善衰老裸鼠皮肤形态
学改变,增加胶原蛋白后组方作用的综合指标强于原组方。结论 杭白菊、珍珠粉、当归、丹参组方增加胶原蛋白后对 D-半
乳糖诱导衰老模型裸鼠皮肤衰老具有显著改善作用。
关键词:中药组方;抗衰老;抗氧化;胶原蛋白;透明质酸;羟脯氨酸
中图分类号:R285.5;R977.9 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2012)09 - 1808 - 06
Effects of two prescriptions with Chinese herbal medicines on skin of aging nude
mouse model reduced by D-galactose
NI Qing-chun, GUO Jian-min, XIAO Bai-quan, ZHANG Hong, ZENG Lin-ling, YANG Wei
Guangzhou General Pharmaceutical Research Institute, Guangzhou 510240, China
Key words: prescriptions with Chinese herbal medicines (PCHM); anti-aging; anti-oxidation; collagen pretein; hyaluronic acid;
hydroxyproline
皮肤衰老往往伴随着皮肤水分减少、色素增加
以及皮肤的抗氧化、清除自由基的能力下降。寻找
安全、高效的延缓皮肤衰老的中药组方,一直是药
学和化妆品领域的研究热点。在本课题组前期研究
杭白菊、珍珠粉、当归、丹参及胶原蛋白单用对 D-
半乳糖诱导裸鼠皮肤衰老模型影响的基础上[1],为
考察杭白菊、当归、珍珠粉、丹参组方加胶原蛋白
后是否会提高原组方的抗衰老作用,本实验针对由
杭白菊、当归、珍珠粉、丹参及胶原蛋白组成的中
药组方 1 和由杭白菊、当归、珍珠粉、丹参组成的
中药组方 2 对亚急性衰老模型小鼠的抗氧化作用进
行比较,为 2 种组方的进一步研发和临床应用提供
实验依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
中药组方 1,由杭白菊、当归、珍珠粉、丹
参及胶原蛋白组成(生药量质量比为 5.2︰5.2︰
0.77︰7.7︰7.7),批号 090820,制备的样品生药
质量浓度为 1.07 g/mL;中药组方 2,由杭白菊、
当归、珍珠粉、丹参组成(生药量质量比为 5.2︰
5.2︰0.77︰7.7),批号 090820,制备的样品生药
质量浓度为 1.02 g/mL;均由无限极(中国)有限
公司提供。维生素 E 胶丸,50 mg/粒,批号 GE
50003,广州星群药业股份有限公司生产。
羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)、超氧化物
歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂
盒,南京建成生物工程研究所;皮肤 I 和 III 型胶原、
透明质酸 ELISA 测定试剂盒,大连泛邦化工技术开
发有限公司;D-半乳糖生化试剂,国药集团化学试
剂有限公司。
1.2 动物
SPF 级 BALB/c-nu/nu 裸鼠,雌性,体质量 20~
收稿日期:2012-04-20
基金项目:广东省粤港招标重大项目“华南创新中药研究开发与技术服务中心(平台)”(2006A35003001)
作者简介:倪庆纯,女,高级工程师,广州医药研究总院副院长。
*通讯作者 杨 威 Tel: (020)84241750 E-mail: yangwei0719@163.com
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22 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,合
格证号 0066091。
1.3 仪器
Emax 酶标仪,美国 Molecular Devices 公司;
Image-Pro Plus 6.0 病理图像分析软件;TU—1221
可见-紫外分光光度计,北京普析通公司;3—18K
型高速冷冻离心机,德国 Sigma 公司;S10 型手提
式高速分散器,宁波新芝公司;数字皮肤水分检测
仪,日本 SCALAR Corp 公司。
2 方法
2.1 模型制备及分组与给药
将裸鼠随机分为 8 组(每组 10 只),分别为对
照组,模型组,维生素 E(0.1 g/kg)阳性对照组,
胶原蛋白组(生药 7.7 g/kg,相当于人临床等效剂
量的 20 倍),组方 1 高、中、低剂量(26.4、13.2、
6.6 g/kg,分别相当于人临床等效剂量的 20、10、5
倍)组,组方 2(18.7 g/kg,相当于人临床等效剂
量的 20 倍)组。除对照组外,其余各组裸鼠每天上
午 sc 经滤过除菌的 D-半乳糖(1 000 mg/kg)1 次,
连续 6 周;在给予 D-半乳糖的同时,各给药组 ig
相应药物,每天 1 次,给药体积 20 mL/kg,连续 6
周,对照组与模型组 ig 等量的蒸馏水。
2.2 样本采集
末次给药后 1 h,各组裸鼠腹主动脉采血制备肝
素抗凝血浆,取肝脏在冰浴中制成 10%匀浆。小鼠
背部皮肤除去皮下脂肪和其他结缔组织,滤纸拭干,
称质量,剪碎,取 9 倍质量的预冷生理盐水,连同
皮肤组织碎块一起转移至 10 mL 塑料离心管中,用
手提式高速分散器以约 20 000 r/min 的转速作用 5~
10 s,反复 2~3 次,于冰浴中制成 10%组织匀浆。
匀浆液在 4 ℃、3 000 r/min 离心 10 min,取上清液,
置−20℃冰箱中保存并尽快检测。另剪取颈部皮肤放
入 4%中性多聚甲醛溶液固定,进行病理组织学观察。
2.3 指标测定
用皮肤水分测定仪每周测定皮肤含水量 1 次。
按试剂盒方法测定血浆、皮肤及肝组织中 SOD、
MDA、T-AOC 水平;用烘干称重法测定皮肤含水
量;用酶联免疫法测定皮肤 Hyp、透明质酸、皮肤
I 和 III 型胶原的量;皮肤组织用 HE 和 Masson 染
色后进行皮肤形态及胶原纤维的组织学观察。
2.4 统计学方法
数据均采用 ±x s 表示,仅对给药第 17 天和第
38 天裸鼠皮肤水分测得的数据进行统计分析。所有
数据采用SPSS 11.0统计软件进行 t-检验及方差分析。
3 结果
3.1 衰老模型裸鼠一般状况观察
与对照组相比,模型组裸鼠随着实验时间的延
长活动减少、食欲下降、皮肤皱褶稍有增加。组方
2 组及组方 1 高、中剂量组裸鼠上述症状有所改善。
3.2 对衰老模型裸鼠皮肤水分的影响
与对照组相比,模型组裸鼠在造模第 17 天至实
验结束,皮肤含水量均明显降低(P<0.05)。与模
型组相比,给药第 38 天,组方 1 高、中剂量组裸鼠
皮肤水分有增加的趋势。在实验结束时,用烘干法
测得模型组皮肤含水量比对照组明显减少(P<
0.05);与模型组相比,组方 1 高剂量组裸鼠皮肤水
分明显增加(P<0.05),而胶原蛋白组及组方 2 组
皮肤水分未见显著增加。结果见表 1。
表 1 组方 1 与组方 2 对 D-半乳糖致衰老模型裸鼠皮肤水分的影响 ( ±x s )
Table 1 Effects of PCHM 1 and 2 on skin moisture of aging nude mouse model induced by D-galactose ( ±x s )
皮肤含水量 / %(皮肤水分测定仪测定) 组 别 剂量 /
(g·kg−1)
动物 / 只
给药前 给药后第 17 天 给药后第 38 天
皮肤含水量 / %
(烘干法测定)
对照 - 9 22.5±4.2 32.5±4.5 30.8±3.0 76.01±4.86
模型 - 8 21.3±5.8 27.1±5.6* 27.3±3.3* 70.27±3.39*
胶原蛋白 7.7 10 25.8±3.4 32.6±5.6 30.7±3.0 72.82±2.15
26.4 10 25.3±3.2 30.9±4.9 31.1±3.8 73.49±2.44▲
13.2 10 25.0±5.2 32.4±7.3 30.8±4.7 71.71±4.88
组方 1
6.6 10 22.3±3.4 30.8±4.3 29.7±3.5 70.94±4.54
组方 2 18.7 10 24.5±5.8 31.7±5.8 29.9±3.3 72.54±4.18
维生素 E 0.1 10 24.0±2.2 32.0±4.8 30.4±2.5* 74.67±2.87▲
与对照组比较:*P<0.05;与模型组比较:▲P<0.05
*P < 0.05 vs control group; ▲P < 0.05 vs model group
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3.3 对衰老模型裸鼠皮肤生化指标的影响
与对照组相比,模型组裸鼠皮肤 T-AOC、SOD、
Hyp、透明质酸、I 型胶原的量均明显减少(P<
0.05、0.01),III 型胶原的量以及 I 型胶原/III 型胶
原的值有减少的趋势,MDA 的量有增加的趋势。
与模型组相比,组方 1 高、中剂量组裸鼠皮肤 MDA
的量均明显减少(P<0.05),Hyp 的量均明显增加
(P<0.05),组方 1 高剂量组和组方 2 组皮肤透明
质酸的量明显增加(P<0.01),高剂量组 I 型胶原/III
型胶原的值均有增加的趋势,I 型胶原、SOD 的量
明显增加(P<0.05)。与胶原蛋白组比较,中药组
方 1 高剂量组皮肤 T-AOC、高、中剂量组 Hyp 水
平均明显增加(P<0.05),III 型胶原的量有增加
的趋势。结果见表 2。
3.4 对衰老模型裸鼠肝脏生化指标的影响
与对照组相比,模型组裸鼠肝脏 SOD 的量明显
减少(P<0.01),MDA 的量明显增加(P<0.05)。
与模型组相比,维生素 E 组、组方 1 高、中剂量组
裸鼠肝脏 MDA 的量均明显减少(P<0.05);维生素
E 组 T-AOC 的量明显增加(P<0.05)。与胶原蛋白
组相比,组方 2 组和组方 1 高剂量组裸鼠肝脏 SOD
的量明显增加(P<0.05)结果见表 3。
3.5 对 D-半乳糖致衰老小鼠血浆生化指标的影响
与对照组相比,模型组裸鼠血浆 MDA 水平明
显升高(P<0.05),T-AOC 水平明显降低(P<0.01)。
与模型组相比,维生素 E 组、组方 2 组、组方 1 高
剂量组裸鼠血浆 SOD 水平均明显升高(P<0.05);
维生素 E 组、组方 2 组、组方 1 中剂量组裸鼠血浆
MDA 水平明显下降(P<0.05);维生素 E 组、组
方 1 高、中剂量组 T-AOC 水平明显上升(P<0.05)。
结果见表 4。
3.6 对 D-半乳糖衰老模型裸鼠皮肤胶原纤维的影响
裸鼠皮肤经 Masson 染色后胶原纤维呈蓝色,
胞质、肌纤维、红细胞呈红色,胞核显蓝褐色。对
照组裸鼠皮肤结构正常,胶原纤维致密,弹性纤维
轮廓清晰,交织成网,弹性纤维细长规则。模型组
裸鼠可见表皮层厚薄不均,胶原纤维排列较为稀疏、
纤细;弹性纤维粗短,部分断裂,轮廓模糊不清、
扭曲与浓染。组方 2 和胶原蛋白组裸鼠皮肤可见弹
性纤维略显粗短,有少量断裂,轮廓欠清晰,胶原
纤维较稀。组方 1 高剂量组裸鼠皮肤接近正常,胶
原纤维较为致密。结果见图 1。
表 2 组方 1 与组方 2 对 D-半乳糖致衰老模型裸鼠皮肤生化指标的影响 ( ±x s )
Table 2 Effects of PCHM 1 and 2 on skin biochemistry indexes of aging nude mouse model induced by D-galactose ( ±x s )
组别 剂量 / (g·kg−1) 动物 / 只 MDA / (nmol·mg−1) T-AOC / (U·mg−1) SOD / (U·mg−1) Hyp / (μg·g−1)
对照 - 9 3.503±1.073 2.596±0.840 112.3±9.0 111.3±18.4
模型 - 8 4.679±1.890 1.625±0.893* 96.0±9.2** 85.1±25.2*
胶原蛋白 7.7 10 2.767±0.606 2.240±0.597 107.0±8.2* 113.8±19.8*
26.4 10 2.572±0.973▲ 3.084±1.973▲▲# 107.6±8.5▲ 122.3±44.9▲#
13.2 10 2.653±1.048▲ 2.111±0.702 104.5±10.8 127.5±43.0▲#
组方 1
6.6 10 2.850±2.692 2.277±0.185 105.7±13.2 98.2±30.5
组方 2 18.7 10 4.563±2.988 2.082±1.071 97.7±14.5 111.4±32.9
维生素 E 0.1 10 2.910±1.358▲ 2.580±0.639▲ 108.1±13.5▲ 108.3±59.0
组别 剂量 / (g·kg−1) 动物 / 只 III 型胶原 / (μg·L−1) I 型胶原 / (μg·L−1) I 型胶原/III 型胶原 透明质酸 / (nmol·L−1)
对照 - 9 3.671±1.682 6.854±1.075 2.104±0.621 68.50±27.69
模型 - 8 2.718±0.719 4.734±1.871* 1.968±1.064 39.35±24.22*
胶原蛋白 7.7 10 2.981±0.894 6.711±1.933 2.572±1.551 52.63±26.14
26.4 10 3.748±1.694 6.752±0.923▲ 2.287±1.264 83.06±31.57▲▲#
13.2 10 3.206±1.196 5.448±1.501 1.922±0.953 70.03±36.88
组方 1
6.6 10 3.389±1.527 5.294±2.564 1.990±1.930 63.71±33.85
组方 2 18.7 10 2.993±1.019 4.647±2.149 1.446±0.432 83.10±18.01▲▲
维生素 E 0.1 10 3.112±1.069 7.185±2.562▲ 2.552±1.279 70.01±38.01
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01;与模型组比较:▲P<0.05 ▲▲P<0.01;与胶原蛋白组比较:#P<0.05
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; ▲P < 0.05 ▲▲P < 0.01 vs model group; #P<0.05 vs collagen group
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表 3 组方 1 与组方 2 对 D-半乳糖致衰老模型裸鼠肝脏生化指标的影响 ( ±x s )
Table 3 Effects of PCHM 1 and 2 on liver biochemistry indexes of aging nude mouse model induced by D-galactose ( ±x s )
组 别 剂量 / (g·kg−1) 动物 / 只 MDA / (nmol·mg−1) T-AOC / (U·mg−1) SOD / (U·mg−1)
对照 - 9 1.233±1.046 3.653±0.829 744.446±112.124
模型 - 8 2.674±1.390* 3.128±0.944 571.169±108.243**
胶原蛋白 7.7 10 1.428±1.133 3.010±0.984 571.743± 67.197
26.4 10 1.109±0.761▲ 3.597±0.643 698.099± 59.888▲#
13.2 10 1.151±0.640▲ 3.107±1.189 563.711± 80.685
组方 1
6.6 10 2.054±1.233 3.597±0.935 532.362±118.192
组方 2 18.7 10 1.500±0.767 4.000±1.270 705.514±131.384#
维生素 E 0.1 10 1.203±0.711▲ 5.017±2.395▲ 671.407±112.103
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01;与模型组比较:▲P<0.05;与胶原蛋白组比较:#P<0.05
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; ▲P < 0.05 vs model group; #P<0.05 vs collagen group
表 4 组方 1 与组方 2 对 D-半乳糖致衰老模型裸鼠血浆生化指标的影响 ( ±x s )
Table 4 Effects of PCHM 1 and 2 on plasma biochemistry indexes of aging nude mouse model
induced by D-galactose ( ±x s )
组 别 剂量 / (g·kg−1) 动物 / 只 MDA / (nmol·mL−1) T-AOC / (U·mL−1) SOD / (U·mL−1)
对照 - 9 1.497±0.387 13.567±3.691 134.783±25.102
模型 - 8 2.717±1.417* 9.168±3.678** 93.547±26.549
胶原蛋白 7.7 10 2.035±1.152 11.703±3.058 130.751±37.299
26.4 10 1.306±1.803 13.073±3.682▲ 137.080±35.886▲
13.2 10 1.063±0.589▲ 12.679±2.136▲ 132.309±35.639
组方 1
6.6 10 1.520±0.706 9.830±2.644 121.354±33.951
组方 2 18.7 10 1.235±1.130▲ 8.772±2.658 140.649±34.785▲
维生素 E 0.1 10 1.375±0.963▲ 15.152±5.222▲ 133.868±27.179▲
与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01;与模型组比较:▲P<0.05
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; ▲P < 0.05 vs model group
图 1 组方 1 与组方 2 对 D-半乳糖致衰老裸鼠皮肤胶原纤维的影响 (Masson 染色)
Fig.1 Effects of PCHM 1 and 2 on collagen fibers of aging nude mouse model induced by D-galactose (Masson staining)
对照 模型 维生素 E 胶原蛋白
组方 1 ( 26.4 g·kg−1 ) 组方 1 ( 13.2 g·kg−1 ) 组方 1 ( 6.6 g·kg−1 ) 组方 2 ( 18.7 g·kg−1 )
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3.7 对 D-半乳糖致衰老小鼠皮肤组织结构的影响
HE 染色显示,对照组各裸鼠的皮肤结构正常,
表皮层未见增厚或变薄,与真皮界线清晰;真皮层
可见波浪状纤维组织,排列有序,分布均匀,与
皮下组织分界清楚;毛囊、皮脂腺结构完整,未
见炎细胞浸润。模型组裸鼠表皮层厚薄不均,与
真皮层界线尚清晰;真皮层不甚规则,其内纤维
组织局部轮廓模糊,与皮下组织分界欠清;毛囊、
皮脂腺结构正常,可见少量炎细胞浸润。维生素 E
组裸鼠表皮层厚薄未见明显变化,与真皮组织界
线可分;真皮内纤维组织排列尚规则、局部轮廓
模糊,与皮下结缔组织界线尚清晰;毛囊、皮脂
腺结构完整,未见炎细胞浸润。组方 2 组裸鼠表
皮尚规则,与真皮界线可分;真皮层变薄,其内
纤维组织稀疏、淡染,与皮下结缔组织界线略模
糊;毛囊、皮脂腺结构完整,未见炎细胞浸润。组
方 1 高剂量组动物皮肤结构接近正常,表皮层排
列尚规则,与真皮界线清楚;真皮层内纤维组织
排列较整齐、局部轮廓模糊,与皮下结缔组织界
线尚清晰;毛囊、皮脂腺结构完整,未见炎细胞
浸润。组方 1 中剂量组裸鼠皮肤结构接近正常,表
皮层尚规则,与真皮界线可分;真皮层内纤维组
织局部稀疏,与皮下组织分界尚清晰;毛囊、皮
脂腺结构完整,未见炎细胞浸润。组方 1 低剂量
组裸鼠表皮组织尚规则,与真皮界线可分;真皮
层内纤维组织不甚规则、局部轮廓模糊,与皮下
组织分界尚可分清;毛囊、皮脂腺结构完整,未
见炎细胞浸润。结果见图 2。
图 2 组方 1 与组方 2 对 D-半乳糖致衰老裸鼠皮肤结构的影响 (HE 染色)
Fig.2 Effects of PCHM 1 and 2 on skin structure of aging nude mouse model induced by D-galactose (HE staining)
4 讨论
引起皮肤衰老的原因可能有多种,本实验从影
响衰老最主要的 4 个方面,即机体的抗氧化、清除
自由基的能力;皮肤保持水分的能力;皮肤胶原纤
维的量;皮肤的形态结构,来比较组方 2、组方 1
和胶原蛋白对 D-半乳糖致亚急性皮肤衰老裸鼠模
型的影响。
机体的衰老与自由基有密切的关系,随着年龄
的增长,机体抗氧化酶活性下降,使自由基不能完
全清除,自由基对机体的损伤不断积累,进而引起
衰老[2]。SOD、MDA、T-AOC 与机体的抗氧化能力
及自由基的清除密切相关[3]。本实验结果表明,组
方 2、组方 1 和胶原蛋白均表现出较好的抗氧化、
清除自由基的作用,且从血浆、皮肤及肝脏生化指
标检测结果总体分析推测组方 1 的抗氧化能力优于
组方 2 和胶原蛋白。
表皮、真皮水分大量丢失,导致皮肤干燥,萎
瘪,缺乏弹性,出现皱纹,皮肤老化[4],因此皮肤
含水量与皮肤衰老密切相关[5]。本实验采用数字皮
肤水分检测仪法和皮肤称重法 2 种方法测定皮肤含
水量,结果表明,D-半乳糖导致裸鼠皮肤水分减少,
而组方 1 高剂量对提高皮肤含水量有较好的作用,
胶原蛋白及组方 2 对皮肤含水量未见明显影响。透
明质酸广泛存在于哺乳动物的结缔组织中,属细胞
对照 模型 维生素 E 胶原蛋白
组方 1 ( 26.4 g·kg−1 ) 组方 1 ( 13.2 g·kg−1 ) 组方 1 ( 6.6 g·kg−1 ) 组方 2 ( 18.7 g·kg−1 )
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外基质,由于其含多个羟基、羧基,能与水分子形
成氢键,有很强的保水、润肤作用,是理想的保湿
剂[6]。本实验结果表明,模型组裸鼠透明质酸明显
减少;组方 2 有促进皮肤透明质酸增加作用,而组
方 1 和胶原蛋白组也有明显的改善趋势。
随着年龄增长,皮肤胶原产物减少,因此检测
胶原蛋白的变化可反映皮肤衰老的状况[7]。Hyp 是
胶原纤维和胶原蛋白中一种主要且相对恒定的非必
需氨基酸,其量已成为检测机体胶原代谢的重要指
标,也是衡量皮肤衰老的指标之一[8]。本实验结果
表明,裸鼠用 D-半乳糖造模后可导致皮肤中胶原蛋
白和 Hyp 的量减少;Masson 染色也发现模型组裸
鼠表皮层厚薄不均,胶原纤维排列较为稀疏、纤细。
组方 1 高剂量能提高皮肤中 I 型胶原蛋白、Hyp 的
量,使胶原纤维较为致密,接近正常裸鼠,I 型胶
原/III 型胶原比值有一定程度的提高。提示组方 1
效果优于组方 2 和胶原蛋白。
本实验观察受试药物对衰老裸鼠皮肤结构的影
响,可见模型组裸鼠皮肤结构发生异常改变[9]。组
方 1 高剂量组裸鼠皮肤仅见纤维组织局部轮廓模
糊,皮肤结构接近正常,表明组方 1 具有一定的延
缓皮肤衰老的作用。
综上所述,组方 1 和组方 2 对 D-半乳糖致衰老
裸鼠的抗氧化能力下降,皮肤水分、弹力纤维和胶
原纤维的减少,皮肤结构的改变有不同程度的改善
作用,其中组方 1 高剂量、组方 2 的抗氧化作用较
强,组方 1 高、中剂量对保持皮肤水分、提高皮肤
胶原蛋白的量有较好作用,组方 1 高剂量还能改善
衰老导致的皮肤结构改变,使其接近正常。胶原蛋
白对 D-半乳糖所致衰老动物皮肤有较好的修复和
补充功能,因而组方 1 延缓 D-半乳糖致裸鼠皮肤衰
老及保持皮肤水分的作用优于组方 2。然而组方 1
和组方 2 对皮肤衰老的影响及其机制尚需进一步深
入研究和探讨。
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