全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

• 2040 •
壮药战骨种质资源遗传多样性 ISSR 分析
熊忠臣，史艳财，漆小雪，邹 蓉，蒋运生，韦记青*
广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541006
摘 要：目的 对壮药战骨种质资源的遗传多样性进行研究。方法 采用 ISSR 分子标记技术分析 9 个战骨种群的遗传多样
性。结果 13 条引物共检测到 73 个位点，其中 65 个位点具有多态性，多态位点百分率（PPL）为 89.04%。战骨总的 Nei’s
基因多样度指数（H）为 0.226 5，Shannon’s 多样性信息指数（I）为 0.357 2，各种群的平均 H、I 为 0.147 6、0.221 9。种群
间基因分化系数（Gst）为 0.348 4，基因流（Nm）为 0.935 1。9 个种群可聚类划分为 2 个大种群组。结论 战骨种群遗传多
样性为中等偏低水平；战骨种群的遗传变异主要存在于种群内；战骨的生物学特性和分布区域的片段化是导致种群间出现一
定的遗传分化和种群遗传多样性较低的主要原因。
关键词：战骨；种质资源；遗传多样性；Nei’s 基因多样度指数；Shannon’s 多样性信息指数；ISSR
中图分类号：R282.7 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)10 - 2040 - 05
ISSR analysis on genetic diversity for germplasm resources of Premna fulva
in Zhuang medicine
XIONG Zhong-chen, SHI Yan-cai, QI Xiao-xue, ZOU Rong, JIANG Yun-sheng, WEI Ji-qing
Guangxi Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Guilin 541006, China
Abstract: Objective To investigate the genetic diversity for germplasm resources of Premna fulva in Zhuang medicine. Methods The
genetic diversity of the nine populations of P. fulva was analyzed by ISSR molecular markers. Results Thirteen primers produced 73
sites, among which 65 were polymorphic sites and Nei’s genetic diversity index (H) and Shannon’s information index (I) were 0.226 5 and
0.357 2, respectively, while average H and I at population level were 0.147 6 and 0.221 9. Genetic differentiation coefficient (Gst) and gene
flow (Nm) were 0.348 4 and 0.935 1 within the population levels. Cluster analysis indicated that the nine populations could be divided into
two groups. Conclusion The genetic diversity among the populations of P. fulva is at lower-middle level. The genetic variance of P.
fulva mainly exists among the populations. The high genetic variance among the populations and the low genetic diversity within
populations could be attributed to the biological characteristics of P. fulva and its region segment.
Key words: Premna fulva Craib.; germplasm resources; genetic diversity; Nei’s genetic diversity index (H); Shannon’s information
index (I); ISSR

“战骨”为广西壮族常用药材[1]，来源于马鞭草
科豆腐柴属植物黄毛豆腐柴 Premna fulva Craib，根、
茎、叶均可入药，具有活血散瘀、强筋壮骨、祛风
止痛等功效，该种主要分布于我国的广西西南部、
云南南部及贵州南部[2]。目前，对战骨的研究主要集
中在生药学、化学成分、药理作用等方面[3-4]，尚未
见有关战骨遗传多样性方面的研究报道。ISSR 是
Zietkiewicz等[5]于1994年提出的一种分子标记技术。
ISSR 集 RAPD、SSR 技术的优点于一身，实验操作
简单、快速、耗资少，遗传多态性高，已广泛应用
于作物遗传多样性、种群亲缘关系分析等方面[6-8]。
本研究采用 ISSR分析技术从DNA水平分析了战骨
的遗传多样性，为合理地保护、利用与开发战骨资
源提供科学依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
样品于 2008 年 9 月采集，采集数量及其分布地
情况见表 1。选取生长健壮、无病虫害的植株，采

收稿日期：2012-04-15
基金项目：广西科技攻关项目（桂科重 1298001-1-5）；广西自然科学基金项目（0991227）；广西科技创新能力建设项目（0992028-10）；广西
植物研究所基本业务费项目（桂植业 12011）
作者简介：熊忠臣（1967—），男，汉族，广西桂林阳朔人，硕士，副研究员，主要从事园林绿化和药用植物引种驯化研究。
Tel: 13907738213 E-mail: xzc@gxib.cn
*通讯作者 韦记青 Tel: 13978353916 E-mail: weijq@gxib.cn
网络出版时间：2012-09-06 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120906.1612.001.html
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表 1 材料信息
Table 1 Information of samples
编号 采集地 样本数 海拔 / m 土壤类型 生 境 植被类型
LZ 广西龙州县 18 295 棕色石灰土 疏林边缘 稀树灌丛
NM 广西宁明县 18 170 棕色石灰土 石山山脚 稀树灌丛
FS 广西扶绥县 18 193 黑色石灰土 石山山脚 藤刺灌丛
TY 广西田阳县 18 430 棕色石灰土 山谷中部 灌丛
PG 广西平果县 18 224 黑色石灰土 石山中下部 稀树灌丛
LL 广西隆林县 18 864 棕色石灰土 坡中下部 灌草丛
TE 广西天峨县 18 321 黑色石灰土 石山中下部 稀树灌丛
YN 云南西双版纳 18 1 152 红壤 土山中下部 常绿阔叶林
GZ 贵州罗甸县 18 370 红壤 土山中下部 次生林

集当年萌发的幼嫩叶片，硅胶干燥后置于低温干燥
处保存。样品经广西植物研究所韦霄研究员鉴定为
黄毛豆腐柴 Premna fulva Craib.。
引物、Mg2+、dNTP、10×PCR 缓冲液、Taq DNA
聚合酶购于上海生工生物工程技术服务有限公
司；λ-EcoT14 I Digest DNA Marker 购于华美生物工
程公司；三氯甲烷、异丙醇、乙醇、三水合乙酸钠
购于西陇化工股份有限公司。
1.2 仪器
TU—1901 型双光束紫外可见分光光度计（北
京普析通用仪器有限责任公司）；PCR 仪（美国
BIO-RAD 伯乐公司）；DYCP—34 型电泳槽（北京
市六一仪器厂）；离心机（珠海黑马医学仪器有限公
司）；CDYY—6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；
UVP 凝胶成像系统。
2 方法
2.1 基因组 DNA 提取
采用 CTAB 法[9]提取战骨总 DNA。用 1%琼脂
糖凝胶电泳法检验 DNA 质量，紫外分光光度计检
测 DNA 质量浓度，稀释至 30 ng/μL。
2.2 PCR 反应体系与扩增程序
反应体系： 25 μL 的体系中含 Mg2+ 2.0
mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1.0 U，
引物 0.8 µmol/L，模板 DNA 50 ng，10×Buffer 2.5
µL，超纯水补至 25 μL。扩增程序：94 ℃预变性 5
min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1.5
min，45 个循环；72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存[10]。
2.3 电泳检测
取 5 μL PCR 扩增产物，加 2 μL 溴酚蓝混匀，
1.5%琼脂糖凝胶电泳 1.5 h 左右，当溴酚蓝指示剂
距离琼脂糖凝胶前沿约 2～3 cm 时停止电泳。EB
液（0.5 μL/mL）中染色 20 min，然后置于 UVP 凝
胶成像系统中拍照、记录。
2.4 数据统计与分析
用扩增产物的统计结果建立 ISSR 数据库[11]，
电泳图中有带的记为“1”，无带的记为“0”，形成
0/1 矩阵。用 Popgene 1.31 软件计算多态位点百分
率、基因流、遗传距离等。采用 NTSYS 2.1 软件对
战骨种群进行聚类分析。
3 结果
3.1 扩增产物的多态性
用筛选出的 13 个能扩增出清晰、重复性好的条
带的引物对 9 个战骨种群进行 ISSR-PCR 扩增，计
算多态位点百分率（PPL）结果见表 2。13 个引物
表 2 战骨 ISSR 扩增结果
Table 2 ISSR amplification of P. fulva
引物 核苷酸序列 (5’～3’) 总带 多态性带数 PPL / %
807 Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag AgT 5 4 80
826 AC AC AC AC AC AC AC ACC 6 6 100
827 AC AC AC AC AC AC AC ACg 6 6 100
834 Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag AgYT 5 5 100
836 Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag AgYA 5 4 80
840 gA gA gA gA gA gA gA gAYT 6 4 66.67
843 CT CT CT CT CT CT CT CTRA 7 6 85.71
845 CT CT CT CT CT CT CT CTRg 5 5 100
846 CA CA CA CA CA CA CA CART 5 5 100
848 CA CA CA CA CA CA CA CARg 6 5 83.33
855 AC AC AC AC AC AC AC ACYT 7 7 100
856 AC AC AC AC AC AC AC ACYA 5 4 80
868 gAA gAA gAA gAA gAA gAA 5 4 80
总计 73 65 89.04
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共扩增出 73 条带，65 条为多态性带，多态性条
带占总数的 89.04%。每个引物可扩增出 4～7 条
带，平均每个引物 5.6 条带，5 条多态带。13 个
引物中，6 个引物的多态性条带为 100%，占引物
总数的 46.15%。
3.2 种群的遗传多样性
9 个种群中，TY 多态位点数最多，为 36 个，种
群 PPL 为 49.32%；GZ 多态位点最少，为 25 个，种
群 PPL 为 34.25%。各种群的平均多态位点数和 PPL
分别为 32、44.45%。在物种水平上，等位基因数（Na）
为 1.890 4，有效等位基因数（Ne）为 1.361 3，Nei’s
基因多样度指数（H）为 0.226 5，Shannon’s 多样
性信息指数（I）为 0.357 2。在种群水平上，各个
种群的 I 平均为 0.221 9，H 为 0.147 6。H 的范围为
0.005 7～0.180 5，NM 种群的 H 最高，为 0.180 5，
其次是 PG，为 0.168 4，最低的是 LZ，为 0.115 7；
I 的范围是 0.176 6～0.267 1，NM、PG 种群的 I 较
大，分别是 0.267 1、0.252 0，其余种群的 I 大小顺
序是 TY＞TE＞FS＞LL＞YN＞LZ＞GZ。H 和 I 所
表现出的规律基本一致：NM、PG、TY、TE 4 个种
群的遗传多样性较高，LZ、GZ 等 5 个种群遗传多
样性较低，见表 3。
表 3 战骨种群的遗传变异
Table 3 Genetic variance of P. fulva populations
种群 多态位点数 PPL / % Na Ne H I
FS 34 46.58 1.465 8 1.256 9 0.150 4 0.227 1
NM 36 49.32 1.493 2 1.316 9 0.180 5 0.267 1
PG 35 47.95 1.479 5 1.286 2 0.168 4 0.252 0
TE 35 47.95 1.479 5 1.252 3 0.151 1 0.230 3
LL 30 41.10 1.411 0 1.249 6 0.141 1 0.209 6
GZ 25 34.25 1.342 5 1.215 6 0.119 6 0.176 6
LZ 31 42.47 1.424 7 1.186 3 0.115 7 0.181 3
TY 36 49.32 1.493 2 1.289 3 0.168 0 0.251 6
YN 30 41.10 1.411 0 1.224 7 0.133 4 0.201 8
平均 32 44.45 1.444 5 1.253 1 0.147 6 0.221 9
物种水平 65 89.04 1.890 4 1.361 3 0.226 5 0.357 2

3.3 种群的遗传分化
Wright 等[12]认为，种群的基因多样性可分解
为种群内基因多样性（Hs）和种群间基因多样性
（Dst）。战骨总的基因多样性（Ht）为 0.226 5，Hs
和 Dst 分别为 0.078 9、0.147 6，种群间基因分化
系数（Gst）为 0.348 4，Hs 和 Dst 分别占 Ht 的
65.17%、34.84%，战骨种群内遗传变异大于种群
间遗传变异；战骨种群的平均基因流（Nm）为
0.935 1，表明各种群之间的基因流动水平较低。
3.4 种群遗传距离和遗传一致度
从遗传距离来看，TE 与 GZ 种群间的遗传距离最
小，为 0.039 7，遗传距离较小的还有 GZ 和 LL、TE
和 LL，遗传距离最大的是 PG 和 LL。种群在遗传一
致度方面的表现为 GZ 与 TE 间的遗传一致度最高，
为 0.961 1，其次是 LL 和 TE、GZ 和 LL、LL 和 PG
间的遗传一致度最低，见表 4。基于 Nei’s 遗传距离利
用 UPGMA 法构建各种群遗传关系聚类图（图 1）。
结果显示，9 个种群明显可分为两组，FS、NM、PG、
表 4 战骨种群遗传距离 (对角线以下) 和遗传一致度 (对角线以上)
Table 4 Genetic distance (below diagonal) and genetic identity (above diagonal) of P. fulva populations
种群 FS NM PG TE LL GZ LZ TY YN
FS 0.930 7 0.916 2 0.917 1 0.841 2 0.882 7 0.919 7 0.902 0 0.899 4
NM 0.071 8 0.923 0 0.912 5 0.848 0 0.889 1 0.919 2 0.883 3 0.854 4
PG 0.087 5 0.080 1 0.915 5 0.832 2 0.890 7 0.895 2 0.888 3 0.874 3
TE 0.086 6 0.091 5 0.088 2 0.937 3 0.961 1 0.909 5 0.912 5 0.923 7
LL 0.172 9 0.164 9 0.183 7 0.064 7 0.934 1 0.855 0 0.896 6 0.878 7
GZ 0.124 7 0.117 6 0.115 8 0.039 7 0.068 1 0.900 9 0.918 1 0.889 4
LZ 0.083 7 0.084 3 0.110 7 0.094 9 0.156 6 0.104 4 0.873 4 0.835 2
TY 0.103 1 0.124 1 0.118 5 0.091 6 0.109 2 0.085 5 0.135 4 0.897 3
YN 0.106 0 0.157 4 0.134 4 0.079 4 0.129 4 0.117 3 0.180 0 0.108 4
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图 1 战骨遗传距离树状图
Fig. 1 Dendrogram of P. fulva genetic distance
LZ 为一组；TE、GZ、LL、TY、YN 为一组。
4 讨论
Nybom[13]对 307 个物种的遗传多样性研究结果
表明，所调查的多年生植物、广布种、异交种种群
水平的 I 的平均值分别为 0.25、0.22 和 0.27。根据统
计，双子叶植物、多年生短寿植物、狭域分布种、
异交植物和重力散播种子的物种种群水平的平均 H
为 0.191、0.20、0.28、0.27、0.19[14]。战骨 I、H 平
均为 0.221 9 和 0.147 6，低于以上植物遗传多样性的
平均值，表明战骨种群遗传多样性为中等偏低水平。
Hamrick 等[15]认为地理分布在一定程度上决定
着植物遗传多样性的高低，繁育系统是在种群水平
上影响遗传多样性的主要因素。一般来说，分布区
较广的物种常具有更高的遗传多样性水平[16]，稀有
的或分布区狭窄的物种遗传多样性水平偏低[17]。在
我国，战骨分布于广西西南部、云南南部及贵州南
部的部分地区。目前所知，战骨在广西分布于西南
的崇左（包括宁明县、扶绥县、龙州县、大新县）、
西部的百色（包括平果县、田阳县、隆林县、田东
县）、西北的河池（包括天峨县）3 个市中的 9 个县，
其他市尚未发现[18]。战骨多分布于石山山脚或石山
的中下部，石山间常间隔有土山、道路或田地，难
以形成连续的分布区域。生境片段化是一个面积大
而连续的生境缩小并分割成两个或更多小块的过
程，最终形成生物地理学中的“岛屿”。岛屿化常发
生在生境面积急骤减少的情况下。但是，如果原有
生境被公路、铁路、篱笆或限制生物自由活动的其
他障碍物分开，即使生境面积减少程度很小，也会
发生生境岛屿化[19]。片段化的生境使战骨扩散以及
群落的建立受到限制，对战骨的正常散布产生直接
障碍。生境的片段化还加速了战骨种群数量的下降
和灭绝。种群被分成几个小种群后，由于交配困难，
遗传漂变和其他问题变得更加脆弱。
战骨为灌木，需较多年限才可开花结果，野外
调查中见到的可结实的成年植株较少。成年战骨结
实量大，一株可达数万粒，但叶片的光合产物供应
有限，致使果实细小、大小不一、品质差。果实有
坚硬的内果皮且含有的种子数较多，种子贮藏的营
养物质少、体积小，发育不充实，生活力较低。果
实成熟后落于母株附近的岩石或土层的表面，此时
其分布地温度高、光照强、较干旱，自然条件下战
骨种子发芽率很低[20]。故战骨繁殖率低，遗传物质
交换和重组的机会较少，致使产生变异的概率减小。
野外调查中发现，战骨分布最多的区域是温度
较高的 LZ、NM 一带，随着分布区的纬度增高，温
度逐渐降低，战骨的丰富程度逐渐减少[18]。9 个种
群的遗传多样性大小表现为 NM＞TY＞TE＞PG＞
FS＞LZ＞LL＞YN＞GZ。湿热地区的遗传多样性水
平稍微偏高，这可能主要和战骨偏好相对湿热气候
的生活习性相关。
战骨种群的总基因多样性 Ht 为 0.226 5，种群
内基因多样性占种群基因多样性的 65.17%，34.84%
变异存在于种群间，种群间基因分化系数 Gst 为
0.348 4，种群的平均 Nm（0.935 1）远低于一般广布
种植物的 Nm（1.881）[21]，表明战骨种群内遗传变
异大于种群间遗传变异，种群间的 Nm基本正常，但
Nm 不是很高，种群间出现了一定程度的遗传分化。
种群间遗传分化的产生与种群间的基因交流受到限
制有关。在植物中，花粉、种子的扩散和传播是基因
流的两种主要形式[22]，战骨种群间相距较远，花粉
和种子难以在种群间有效的传播，战骨远距离基因
交流的可能性较小。
战骨种群间遗传距离聚类结果显示，9 个种群
明显可分为两组：FS、NM、PG、LZ 为一组；TE、
GZ、LL、TY、YN 为一组。地理上较近的种群聚
在一起，这与其地理分布格局大致吻合。战骨种群
间的基因流受到一定程度的限制，但地理位置相近
的种群间基因交流的可能性较大，因而能保持较小
的遗传距离。
综上所述，战骨生境的片段化以及战骨自身的
生物学特性是战骨种群遗传多样性较低的主要原
因。物种的遗传多样性水平在一定程度上可以体现
该物种适应环境的能力，制约物种适应性进化的水
平，同时物种的遗传多样性水平也可为其现状和保
护价值的评估及迁地保护等措施的提出提供重要的

FS
NM
PG
LZ
TE
GZ
LL
TY
YN
0.13 0.11 0.08 0.06 0.04
相似系数
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信息[23]。宁明、田阳和天峨种群具有较高的遗传
多样性，建议将其作为优先保护和利用的种群。
同时，注意其他地区战骨的保护与利用，加强战
骨良种选育、引种驯化和种群内优良单株的选择
等方面的研究。
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