全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月

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碎米桠及其近缘种的分子鉴定和亲缘关系研究
夏 至，张红瑞，李贺敏，高致明*
河南农业大学农学院 中药材工程技术研究中心，河南 郑州 450002
摘 要：目的 构建碎米桠 Isodon rubescens 及其与近缘种之间系统发育关系，准确鉴别碎米桠及其近缘种。方法 提取碎米
桠及其近缘种 DNA，对核基因 ITS 片段和叶绿体基因 psbA-trnH 序列扩增和测序，计算物种种内、种间 Kimura 2-parameter（K2P）
遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建 Neighbor-joining（NJ）系统聚类树 3 种方法进行鉴定分析。结果 ITS 和 psbA-trnH
分子系统树支持碎米桠 5 个居群样本聚为一单系分支，支持率为 94%和 68%；其中，碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香
茶菜聚在一支，支持率为 70%和 51%；溪黄草和显脉香茶菜构成姐妹群分支，支持率为 81%和 63%。碎米桠及其近缘种种间
ITS和 psbA-trnH序列的K2P遗传距离为 0.007 08～0.072 61 和 0.008 06～0.024 76，均远大于碎米桠种内的遗传距离 0～0.001 76
和 0～0.002 68。结论 碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜亲缘关系较近，溪黄草和显脉香茶菜亲缘关系最近。ITS
和 psbA-trnH 序列可以准确鉴别碎米桠及其近缘种。
关键词：ITS；psbA-trnH；碎米桠；鉴定；亲缘关系
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)20 - 2904 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.20.021
Molecular authentication and phylogenetic relationship of Isodon rubescens
and its relatives
XIA Zhi, ZHANG Hong-rui, LI He-min , GAO Zhi-ming
Research Center of Engineering Technology for Traditional Chinese Medicinal Materials, College of Agronomy, Henan
Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Objective To construct the phylogenetic relationships of Isodon rubescens and its relative species, and accurately identify
I. rubescens and its relative species. Methods Total genomic DNA was isolated from I. rubescens and its relative species. Nuclear
DNA internally transcibed spacer (ITS) and chloroplast gene psbA-trnH sequences were amplified and sequenced. The Kimura
2-parameter (K2P) distances were calculated. Identification analyses were performed using Nearest Distance, BLAST1, and
Neighbor-joining (NJ) methods. Results The NJ trees (ITS and psbA-trnH data) indicated that the five populations of I. rubescens
formed a monophyletic clade [Bootstrap (BS) = 94% and 68%]. I. rubescens and I. japonicus, I. amethystoides, I. inflexus formed one
monophyletic clade (BS = 70% and 51%), and I. serra was sister to I. nervosus (BS = 81% and 63%). The K2P genetic distances of ITS
and psbA-trnH data between I. rubescens and its relative species were (0.007 08—0.072 61) and (0.008 06—0.024 76) which were far
higher than intra-specific genetic distances of I. rubescens (0—0.001 76) and (0—0.002 68). Conclusion I. rubescens is closely
relative to I. japonicus, I. amethystoides, and I. inflexus. The closest relative of I. serra is I. nervosus. ITS and psbA-trnH are two
efficient barcodes for the identification of I. rubescens and its relative species.
Key words: internally transcibed spacer; psbA-trnH; Isodon rubescens (Hemsl.) Hara; authentication; phylogenetic relationship


唇形科（Lamiaceae）香茶菜属 Isodon (Schrader
ex Bentham) Spach 植物在我国有 90 种，21 个变种，
全国各地均有分布[1]，中药材冬凌草的来源为该属
植物碎米桠 Isodon rubescens (Hemsl.) Hara[2]，主要
分布于河南太行山区和伏牛山区，广为栽培。该植
物以全草入药，具有清热解毒，活血止痛等功效，

收稿日期：2013-05-30
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31070171，31270236）；科技部国家星火计划项目（2012GA750004）
作者简介：夏 至（1974—），男，河南固始人，讲师，博士，研究方向为中药资源的分子鉴定。
Tel/Fax: (0371) 63554995 E-mail: xiazhiemail@126.com
*通信作者 高致明，教授，主要从事中药资源的规范化种植研究。E-mail: gaozhiming672@shou.com
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用于咽喉肿痛，蛇虫咬伤[2]。植物化学和药理学研
究表明香茶菜属植物活性成分主要是二萜类[3]，具
有抗炎、抗癌、抗菌、降血压、保护缺血性心功能
损伤等多种药理作用[4]，在临床上应用十分广泛。
由于香茶菜属植物在我国南北均有分布，生态适应
幅度大，形态上产生很多变异。作为河南分布的主
要药材品种之一，野生和栽培的碎米桠种内的遗传
变异十分显著，形态上有较大差异[5]，与同属近缘
种类很难区分，且这些形态特征易受地理环境、生
长发育时期的影响，从而影响鉴定结果的准确性，
造成传统鉴定困难。此外，除碎米桠外，在河南地
区，同属的一些植物（如毛叶香茶菜、香茶菜等）
也作为冬凌草入药[5-7]，常有混淆现象发生，直接影
响临床用药的安全。目前，有关碎米桠及其近缘种
的鉴定和亲缘关系研究主要集中在形态性状和
RAPD（random amplified phlymorphic DNA）分析
等[8]，碎米桠与其近缘种类的 DNA 条形码分子鉴定
研究未见报道。为确保碎米桠正确和安全用药，构
建碎米桠及其与近缘种类的亲缘关系，对碎米桠及
其近缘种类进行 DNA 条形码分子鉴定研究，找到
快速准确鉴定碎米桠的方法是非常必要的。
近年来，随着分子生物学的快速发展，DNA
条形码技术（DNA barcoding）为中药材物种鉴定
研究提供了方便快捷的方法。DNA 条形码技术是
利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的
DNA 片段对物种进行快速、准确的自动鉴定[9]。
目前，药用植物的 DNA 条形码鉴定研究得到快速
发展，广泛应用于多个科属的药用植物及中药材鉴
定 [10-11]。植物核糖体 DNA 中的内转录间隔区
（internal transcribed spacer，ITS）和叶绿体基因
psbA-trnH 片段作为国际通用条形码序列，在种间及
种下居群间具有进化速率快、变异程度高、区分物
种能力强的特点适用于药用植物与其近缘种类等较
低分类阶元的分子鉴定[12-15]。本研究选用核基因
ITS 片段和叶绿体基因 psbA-trnH 片段，通过对香茶
菜属 7 种植物，包括碎米桠及其近缘种类（近缘种
主要指这些种类形态特征相似和地理分布区域相近
和重叠）23 个样本进行基因片段扩增、测序、并应
用 DNA 条形码技术进行分析，探讨碎米桠及其与
近缘种的亲缘关系，为碎米桠的准确鉴定提供科学
依据。
1 材料
收集香茶菜属 7 个种共 23 个样本，实验材料由
河南农业大学农学院中药材系高致明教授和中国科
学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室
王印政研究员鉴定，凭证标本保存于河南农业大学。
实验材料来源于植物新鲜叶片，经硅胶快速干燥后
保存于−80 ℃冰箱中，实验材料详细信息、GenBank
登录号见表 1。
2 方法
2.1 样品 DNA 的提取、扩增和测序
采用北京天根生化植物 DNA 提取试剂盒
（Tiangen Biotech Co.，中国）提取样品 DNA，ITS
序列扩增使用 Wendel 等 [16]设计的引物 ITS1
（ 5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3’ ） 和
ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；psbA-
trnH 序列扩增使用 DNA 条形码通用引物[17]，引物
由上海生工生物技术服务有限公司合成。PCR 反应
条件及扩增程序参考 Chen 等[17]和 Xia 等[18]的研究
结果。PCR 产物纯化后，用 ABI 3730X 测序仪
（Applied Biosystems Co.，美国）进行双向测序，测
序结果在 GenBank 注册新序列号为 KF032247～
KF032292，见表 1。
2.2 数据处理
测序所得的峰图采用 CodonCode Aligner
V3.0（CodonCode Co.，美国）对序列峰图进行
校对拼接，去除引物区和低质量的序列，利用软
件 PAUP* Version 4.0b10 计算物种种内、种间
Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。构建邻接
（ Neighbor-joining ， NJ ） 系 统 发 育 树 ， 利 用
Bootstrap（BS）（1 000 次重复）检验各分支的支
持率。利用相似性搜索法（BLAST1）、最近距离
法（Nearest Distance）、构建 NJ 系统发育树等方
法对碎米桠及其近缘种类进行鉴定分析。
3 结果与分析
3.1 ITS 序列信息、序列种内及种间变异分析
碎米桠及其近缘种类的 7 个物种的 ITS 序列长
度变异范围为 567～584 bp，线纹香茶菜的 ITS 序列
最长，为 584 bp，香茶菜最短，为 567 bp。其中 ITS1
序列长度变异范围为 195～196 bp，差异较小。5.8 S
区域长度为 164 bp，7 个物种序列完全一致。ITS2
序列长度变异范围为 207～225 bp，差异较大。在
ITS 序列的矩阵中，碎米桠的 5 个居群的 ITS 序列
长度一致，居群间有 3 个碱基位点的变异，分别在
居群 A3 的第 425 个位点，居群 A4 的 66 个位点，
居群 A5 的 21 个位点，均发生由 C-T 的变异，这 3
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月

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表 1 样品来源
Table 1 Sources of samples
GenBank 登录号 编号 样 品 采集地
ITS psbA-trnH
A1 碎米桠 Isodon rubescens 河南郑州 KF032 247 KF032 270
A2 碎米桠 河南栾川 KF032 248 KF032 271
A3 碎米桠 河南济源 KF032 249 KF032 272
A4 碎米桠 河南济源 KF032 250 KF032 273
A5 碎米桠 河南济源 KF032 251 KF032 274
B1 毛叶香茶菜 I. japonicus 河南商城 KF032 252 KF032 275
B2 毛叶香茶菜 河南新县 KF032 253 KF032 276
B3 毛叶香茶菜 河南新县 KF032 254 KF032 277
C1 显脉香茶菜 I. nervosus 广西南宁 KF032 255 KF032 278
C2 显脉香茶菜 河南栾川 KF032 256 KF032 279
C3 显脉香茶菜 河南栾川 KF032 257 KF032 280
D1 香茶菜 I. amethystoides 广西南宁 KF032 258 KF032 281
D2 香茶菜 河南禹州 KF032 259 KF032 282
D3 香茶菜 河南洛宁 KF032 260 KF032 283
E1 溪黄草 I. serra 河南郑州 KF032 261 KF032 284
E2 溪黄草 河南栾川 KF032 262 KF032 285
E3 溪黄草 河南洛宁 KF032 263 KF032 286
F1 内折香茶菜 I. inflexus 河南商城 KF032 264 KF032 287
F2 内折香茶菜 广西南宁 KF032 265 KF032 288
F3 内折香茶菜 I. inflexus 广西南宁 KF032 266 KF032 289
G1 线纹香茶菜 I. lophanthoides 河南商城 KF032 267 KF032 290
G2 线纹香茶菜 河南栾川 KF032 268 KF032 291
G3 线纹香茶菜 广西南宁 KF032 269 KF032 292
H 罗勒 Ocimum basilicum GenBank DQ667 240 DQ667 350

个居群地理分布均在河南济源这个区域。ITS 序列种
内种间 K2P 遗传距离结果显示，碎米桠与其同属近
缘种类的种间遗传距离为 0.007 08～0.072 61，明显
大于碎米桠种内的遗传距离（0～0.001 76）（表 2）。
3.2 psbA-trnH 序列信息、序列种内及种间变异分析
碎米桠及其近缘种类的 7 个物种的 psbA-trnH
序列长度变异范围为 288～364 bp，碎米桠的
psbA-trnH 序列最长，为 364 bp，线纹香茶菜的
psbA-trnH 序列最短，为 288 bp。在 psbA-trnH 序列
的矩阵中，对比碎米桠的 psbA-trnH 序列，线纹香
茶菜的 psbA-trnH 序列在第 130 bp 和 224 bp 处有
69 个碱基和 7 个碱基的缺失，显脉香茶菜的
psbA-trnH 序列在第 271 bp 处有 6 个碱基的缺失，
香茶菜和毛叶香茶菜分别在第 295 bp 和 296 bp 处
有 4 个碱基的缺失，内折香茶菜在 355 bp 有 4 个
碱基的缺失。碎米桠的 5 个居群样本中，有 4 个
psbA-trnH 序列长度一致，其中居群 A4 有 2 个碱
基位点的缺失。psbA-trnH 序列种内、种间 K2P
遗传距离结果显示，碎米桠与其同属近缘种类的
种间遗传距离为 0.008 06～0.024 76，明显大于碎
米桠种内的遗传距离（0～0.002 68）（表 2）。
3.3 碎米桠与其同属近缘种类的鉴定分析
应用相似性搜索法（BLAST1）对碎米桠与其
同属近缘种类进行鉴定分析，结果表明 ITS 和
psbA-trnH 序列可以准确鉴别碎米桠与其同属近缘
种类。应用 PAUP* version 4.0b10 构建碎米桠与其
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 20 期 2013 年 10 月

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表 2 基于 ITS 和 psbA-trnH 序列的碎米桠与其近缘种的种间和种内 K2P 遗传距离
Table 2 K2P genetic distance based on ITS and psbA-trnH from I. rubescens and its closely related species
名 称 K2P 遗传距离 ITS psbA～trnH
碎米桠 种间 0.007 08～0.072 61 0.008 06～0.024 76
种内 0～0.001 76 0～0.002 68
香茶菜 种间 0.005 31～0.068 92 0.002 71～0.024 63
种内 0 0
毛叶香茶菜 种间 0.007 06～0.072 66 0.002 71～0.027 99
种内 0 0
显脉香茶菜 种间 0.008 83～0.070 50 0.005 47～0.022 66
种内 0 0
溪黄草 种间 0.007 06～0.072 40 0.005 47～0.022 09
种内 0～0.001 75 0
内折香茶菜 种间 0.015 93～0.083 86 0.022 04～0.031 02
种内 0 0
线纹香茶菜 种间 0.068 62～0.083 86 0.017 71～0.031 02
种内 0 0

同属近缘种类的 ITS 和 psbA-trnH 序列的 NJ 系统发
育树（图 1、2），外类群选择与香茶菜属近缘的罗勒
属[19]。从 NJ 树可以看出，ITS 序列构建的分子系统
树上（图 1），碎米桠的 5 个居群样本聚为一单系分
支，支持率为 94%，其中，香茶菜的 3 个居群样本
与内折香茶菜 3 个居群样本聚为一单系分支，支持
率 56%，其余 4 个物种的各自 3 个居群样本都聚为
一单系分支，具有较高的支持率。依据 ITS 序列构
建的分子系统树可将碎米桠与其同属近缘种类明显
地区分开。系统发育关系图显示，碎米桠与毛叶香
茶菜、香茶菜、内折香茶菜聚为一单系分支，具有
70%的支持率，溪黄草和显脉香茶聚为一单系分支，
具有 81%的支持率，线纹香茶菜处于系统树的基部
位置。在 psbA-trnH 分子系统树上（图 2），碎米桠
的 5 个居群样本聚为一单系分支，具有 68%的支持
率，其余 6 个物种的各自 3 个居群样本均聚为一单
系分支，具有较高支持率。依据 psbA-trnH 序列构建
的分子系统树可将碎米桠与其同属近缘种类明显地
区分开。系统发育关系图显示，碎米桠与毛叶香茶
菜、香茶菜、内折香茶菜聚为一单系分支，支持率
为 51%，溪黄草和显脉香茶聚为一单系分支，具有
63%的支持率，线纹香茶菜处于系统树的基部位置。
4 讨论
4.1 基于 ITS和 psbA-trnH 序列对碎米桠与其近缘
种的分子鉴定
近年来，随着碎米桠功效在医学临床方面的不

分支上部数值表示 NJ 的 BS 分析对该分支的支持强度 (＞50%)，
下同
BS values of NJ (> 50%) are shown above and below branches, same
as below
图 1 基于 NJ 法（ITS 数据）构建系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic tree constructed based on NJ method
(ITS data)
断发现，碎米桠市场需求量也越来越大。然而，由
于香茶菜属药用植物种类众多，多个地区出现碎米
桠的近缘种类替代用药，导致冬凌草临床用药存在
不安全因素。本研究应用国际通用的 DNA 条形码
序列核基因 ITS 和叶绿体基因 psbA-trnH 序列对碎
米桠及其同属近缘种 7 个物种（23 个样本）进行鉴

F1
F3
F2
D2
D1
D3
B1
B2
B3
A2
A3
A4
A1
A5
E1
E3
E2
C2
C3
C1
G1
G3
G2
H
100
56
86
67
70
94 100
62
81
58
100
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图 2 基于 NJ 法 (psbA-trnH 数据) 构建系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on NJ method
(psbA-trnH data)
定研究，结果表明 ITS 和 psbA-trnH 序列在碎米桠 5
个不同居群个体间均存在少量的变异，在碎米桠与
其同属近缘种之间，存在丰富的变异。碎米桠与其
同属近缘种之间 ITS 和 psbA-trnH 序列的种间 K2P
遗传距离均远大于碎米桠种内居群间 K2P 遗传距
离（表 2）。NJ 树聚类分析结果显示，在 ITS 和
psbA-trnH 分子系统树上，碎米桠 5 个居群均聚为一
单系分支，支持率分别均为 94%和 68%，与其他 6
个近缘种很好地区分开（图 1、2）。此外，《中国药
典》2010 年版附录中首次收载中药材溪黄草的来源
为香茶菜属的植物溪黄草或线纹香茶菜[《中国药
典》2010 年版中拉丁文名为 Isodon striatus (Benth.)
Kudo，Flora of China 中的拉丁文名为 Isodon
lophanthoides (Buchanan-Hamilton ex D. Don) H.
Hara]的干燥地上部分。本研究的结果发现，溪黄草
和线纹香茶菜与其同属 5 个近缘种之间 ITS 和
psbA-trnH 序列的种间 K2P 遗传距离均远大于溪黄
草和线纹香茶菜的 3个居群样本间的种内K2P遗传
距离（表 2）。NJ 树聚类分析结果显示，在 ITS 和
psbA-trnH 分子系统树上，溪黄草和线纹香茶菜各自
的 3 个居群均聚为一单系分支，具有较高的支持率，
与其他 5 个近缘种很好地区分开（图 1、2）。本课
题组的研究支持卢小蕾等[8]利用 RAPD 分子标记对
碎米桠与其同属 5 个近缘种的研究结果，表明河南
产香茶菜属植物不同种间存在明显的遗传分化，ITS
和 psbA-trnH 序列可以作为碎米桠、溪黄草及其与
同属近缘种进行鉴定的条形码序列。
4.2 碎米桠及其近缘种的系统发育关系
基于 DNA 条形码技术的分子鉴定不仅能准确
鉴定中药材正品与伪品，还能准确构建药用植物与
其近缘种类的系统发育关系，是开展药用植物亲缘
学研究的基础和关键[20]。本研究对碎米桠与其同属
近缘种的系统发育关系研究中发现，基于核基因
ITS 和叶绿体基因 psbA-trnH 序列构建的分子系统
树拓扑结构基本一致（图 1、2），但核基因 ITS 的
NJ 分子系统树中的各节点的支持率稍高于叶绿体
基因 psbA-trnH 的 NJ 分子系统树各节点的支持率，
这与核基因 ITS 序列对比叶绿体基因 psbA-trnH 序
列具有较多的变异位点（信息位点）相关[21]。其中，
碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜亲缘关
系较近，溪黄草和显脉香茶菜亲缘关系最近。此外，
《中国药典》2010 年版中，冬凌草的基源植物碎米
桠的拉丁文名称仍为 Rabdosia rubescens (Hemsl.)
Hara，参照 Flora of China 中碎米桠的命名和植物命
名法规，Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara 被作为
Isodon rubescens (Hemsl.) Hara 的异名，应该废弃。
《中国药典》中冬凌草的基源植物碎米桠的拉丁文名
称应更改为 Isodon rubescens (Hemsl.) Hara。本课题
组的研究对碎米桠及其近缘种的系统发育关系进
行初步探讨，但鉴于香茶菜属植物种类较多，进一
步在该属扩大取样范围，选取 ITS 和 psbA-trnH 序
列及其他基因片段开展分子系统学研究，方能全面
构建香茶菜属属下系统发育框架，从分子水平揭示
该属各种间的亲缘关系，这将为香茶菜属的药用植
物的资源开发与利用、品种选育、引种栽培提供可
靠的理论依据。
志谢：中国科学院植物研究所系统与进化植物
学国家重点实验室王印政课题组提供本研究分子
实验平台。中国科学院植物研究所标本馆协助查阅
标本。
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D1
D2
D3
B1
B2
B3
F1
F3
F2
A3
A2
A4
A1
A5
E1
E2
E3
C2
C3
C1
G1
G3
G2
H
65
89
77
100
51
56 68
55
63
56
52
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