全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月 • 143 •
• 药材与资源 •
大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达
吴晓莉，张 婷，边金铎，许 健*
浙江中医药大学生命科学学院，浙江 杭州 310053
摘 要：目的 从大蒜鳞茎中克隆蒜氨酸酶基因，构建蒜氨酸酶真核表达载体，并在毕赤酵母系统中表达，进一步探讨重组蒜
氨酸酶的生物学活性。方法 利用 RT-PCR 方法克隆大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因，通过 pPIczαC 载体构建 pPIczαC-蒜氨酸酶真核表
达质粒，电转化法导入毕赤酵母 X-33，筛选阳性克隆，经甲醇诱导后取表达上清进行 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析。利
用丙酮酸法检测重组蒜氨酸酶和提取的天然蒜氨酸酶的活性，Lowry 法测 2 种蒜氨酸酶蛋白质量，通过比活力比较 2 种酶活性
大小。结果 从大蒜内克隆出蒜氨酸酶基因，大小为 1 500 bp，重组蒜氨酸酶相对分子质量约为 5.5×104，存在于毕赤酵母表
达上清液中。重组蒜氨酸酶比活力为（82.09±3.89）U/mg，天然蒜氨酸酶比活力为（176.49±5.06）U/mg。结论 蒜氨酸酶基
因可以在毕赤酵母表达系统中获得表达，重组蒜氨酸酶具有酶活性，但是其活性低于提取的天然蒜氨酸酶。
关键词：蒜氨酸酶；克隆；毕赤酵母；pPIczαC 载体；RT-PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)01 - 0143 - 05
Cloning of alliinase gene from garlic bulb and its expression in Pichia pastoris
WU Xiao-li, ZHANG Ting, BIAN Jin-duo, XU Jian
College of Life Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China
Abstract: Objective To clone the alliinase gene from the garlic bulb and construct the eukaryote expression plasmid for expressing
the recombinant alliinase in Pichia pastoris system and analyzing its bioactivity. Metheds The alliinase gene was cloned from the
Zhejiang garlic bulb by RT-PCR and the eukaryote expression plasmid of alliinase was constructed with the pPIczαC vector. The
recombinant plasmid was transformed into Pichia pastoris X-33 by eletroporation. The positive clones were screened and were
induced by methanol. Supernatants after induction were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The activities of the
recombinant protein and the extracted alliinase were detected by the pyruvic acid method and compared by specific activity. The
contents of the two kinds of alliinase were detected by Lowry method. Results The alliinase gene was successfully cloned from the
garlic bulb, the length of alliinase gene was 1 500 bp, the molecule of the recombinant alliinase was about 5.5 × 104, existed in the
supernatant of Pichia pastoris. The specific activity of the recombinant protein was (82.09 ± 3.89) U/mg and the nature alliinase was
(176.49 ± 5.06) U/mg. Conlusion The alliinase gene is successfully expressed in Pichia pastoris system. The recombinant alliinase
has the activity of enzyme, but is lower than that of the extracted alliinase.
Key words: alliinase; cloning; Pichia pastoris (Guillierm.) Phaff; pPIczαC vector; RT-PCR

蒜氨酸酶（alliinase，EC4.4.1.4，1）又名蒜氨
酸裂解酶，存在于大蒜细胞的液泡中，而蒜氨酸存
在于细胞质中，当大蒜细胞受损时，二者相遇发生
酶解反应，产生具有多种药理活性的大蒜素[1]。由
于大蒜素不溶于水，且具有蒜臭味而影响其临床应
用。目前，国内外研究思路是从鲜蒜中提取蒜氨酸
及蒜氨酸酶，制成无臭无味的“蒜氨酸-蒜氨酸酶复
合制剂”，使其在体内释放大蒜素充分发挥疗效。该
研究思路改变了大蒜素给药方式，弥补了大蒜素的
不足，但是溶液提取获得的蒜氨酸酶量较低，且由
于蒜氨酸酶不稳定，在提取过程中，活性容易丧
失导致大蒜素生成能力降低[2]。本研究拟用分子
生物学的方法克隆蒜氨酸酶基因，在毕赤酵母系
统表达重组蒜氨酸酶蛋白，对重组蒜氨酸酶进行
活性分析，为改进大蒜素的给药方式，更好地发挥
蒜类产品的药理学活性奠定实验基础。

收稿日期：2011-09-15
基金项目：浙江省教育厅课题（Y200805242）；浙江省中医药管理局资助课题（2010ZB026）；浙江中医药大学重点课题（2009ZZ05）；浙江省
科技厅新苗人才计划项目（67401219）；浙江中医药大学校级课题（17108015）
作者简介：吴晓莉（1975—）女，讲师，硕士，研究方向为中药有效成分筛选及现代化。Tel: (0571) 86633001 E-mail: JPWXL999@163.com
*通讯作者 许 健 Tel: (0571)86633001 E-mail: xujian832002@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月 • 144 •
1 材料
新鲜浙江白蒜鳞茎购买于当地市场。毕赤酵母
Pichia pastoris (Guillierm.) Phaff X-33菌株由吉林大
学药学院颜炜群教授惠赠，大肠杆菌DH5a、pPIczαC
载体由本实验室保存，pGEMP-T-easy 载体购自
Invetrogen 公司。Trizol 试剂、PCR 纯化试剂盒、凝
胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、鼠源抗 His
标签蛋白抗体，HRP 标记的羊抗鼠 IgG 购自
Invetrogen公司。Reverse Transcriptase XL反转录酶、
HS Prime Star DNA 聚合酶、限制性内切酶由 Takara
公司提供。蒜氨酸购自山西慈缘生物技术公司，质
量分数为 98%。
2 方法
2.1 引物设计
根据 Genbank 登录的蒜氨酸酶序列，在其 ORF
框上下游设计一对引物。上游引物：5’-GGTATAA-
ATGATCTGCCTAGTGATT-3’，下游引物：5’-CATA-
CAAAGATACTCCTTACTGCC-3’。
2.2 大蒜鳞茎总 RNA 的提取及 pGEMP-T-蒜氨酸
酶质粒的构建和鉴定
取新鲜大蒜鳞茎于液氮中研碎，按照 Trizol 试剂
说明书进行总 RNA 的提取并进行 RT-PCR。以合成
的 cDNA 第一链为模板，扩增蒜氨酸酶序列。PCR
参数为 94 ℃、5 min，98 ℃、10 min，55 ℃、10 min，
72 ℃、3 min，30 个循环，72 ℃延伸 5 min。1%琼
脂糖电泳检测 PCR 产物，PCR 产物纯化后克隆到
pGEMP-T-easy 载体。并转化至大肠杆菌 DH5a，挑
取阳性克隆于 37 ℃过夜震荡培养，按照质粒提取试
剂盒说明书提取重组质粒，测序并进行生物学分析。
2.3 蒜氨酸酶基因亚克隆及 pPIczαC-蒜氨酸酶重
组质粒的构建和鉴定
重新设计上下游引物。上游引物：CCCTCGAG-
AAGAGAGAGATGATCTGCCTAGTG；下游引物：
GGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAATG-
AAAGGACGAC。分别引入 XholI 和 EcoRI 酶切位
点，以 pGEMP-T-蒜氨酸酶为底物进行 PCR，PCR
产物和 pPIczαC 载体分别经 XholI 和 EcoRI 双酶切
进行连接构建，重组质粒 pPIczαC-蒜氨酸酶经双酶
切鉴定，由 Takara 公司进行 DNA 测序。
2.4 pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒的毕赤酵母表达
取 5 mL YPD 培养基于 50 mL 锥形瓶中，接种
酵母 X-33 于 30 ℃过夜培养。取 0.1～0.2 mL 培养
物接种于 500 mL 新鲜培养基中，摇至吸光度（A600）
值为 1.3～1.5。4 ℃，1 500×g，离心 5 min，收集
细胞，用 500 mL 冷的无菌水重悬细胞，离心，重
悬细胞于 250 mL 无菌水中离心。用 20 mL 1 mol/L
山梨醇重悬细胞，同上离心。用 1 mL 1 mol/L 山梨
醇重悬细胞至终体积为 1.5 mL，制备毕赤酵母 X-33
感受态细胞。
混合 80 μL 毕赤酵母 X-33 感受态细胞与 5～20
μg 线性化 pPIczαC-蒜氨酸酶质粒和 pPIczαC 载体，
转移至冰预冷的 0.2 cm 电转杯中，冰上放置 5 min，
电压 1 500 V，电击 4～10 ms，立即加入 1 mL 冰冷
1 mol/L 的山梨醇，取 200～600 μL 上述内容物涂布
于含 zeocin 的 MD 平板，30 ℃培养，直至长出单
克隆菌落。从 MD 平板上挑取单克隆分别接种于 10
mL YPD 培养基中，30 ℃震摇培养过夜，提取酵母
DNA，然后进行 PCR，鉴定重组的阳性克隆。
取已鉴定的阳性克隆，接种于 100 mL
BMMY 培养基中，28～30 ℃，250～300 r/min
震摇培养至 A600 值 2.0～6.0 。1 500～3 000 ×g，
室温离心 5 min，收集细胞。将细胞重悬于原体
积 1/5 至 1/10 体积的 BMMY 培养基中，继续振
摇培养。加 100%甲醇使终体积分数为 0.5%，每
隔 12 h 取样。样品 1 500 ×g 离心 5 min。收集
上清液进行检测。
2.5 重组蒜氨酸酶 SDS-PAGE 分析和 Western
blotting 鉴定
以 pPIczαC 空载体表达上清为对照，将不同时
间收集的酵母表达上清进行 SDS-PAGE 电泳分析，
再将表达产物经离心浓缩后进行 Western blotting 鉴
定。利用半电干转移仪将 SDS-PAGE 凝胶上的蛋白
转移至硝酸纤维膜上，以 5%脱脂奶粉封闭，4 ℃
过夜，加入鼠源 His-tag 标签抗体 37 ℃孵育 2 h，
洗膜，加入 HRP 标记的山羊抗鼠 IgG 二抗，37 ℃
孵育 1 h，经显色后观察蛋白表达情况。
2.6 重组蒜氨酸酶和天然蒜氨酸酶的活性分析
天然蒜氨酸酶的提取参照李燕等[3]方法。取一
定量大蒜（4 ℃预冷），加入预冷的 PBS 缓冲溶液，
10%甘油、1 mmol/L CaCl2，匀浆。上清经 35%的饱
和硫酸铵进行蛋白沉淀，4 ℃，12 000×g 离心
30 min，取沉淀复溶后，透析，收集酶液。经
SDS-PAGE 凝胶电泳检测纯度。Lowry 法测定溶液
提取蒜氨酸酶和浓缩重组蒜氨酸酶蛋白质量。
以 3 mmol/L 的蒜氨酸为底物，用丙酮酸法[4]
分别测定重组蒜氨酸酶和溶液提取蒜氨酸酶活性。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 1 期 2012 年 1 月 • 145 •
酶活定义为以在 35 ℃条件下，产生 l μmol/min 丙
酮酸为 1 个活力单位（U）。1.0 mL 酶液加 2.0 mL
底物在 35 ℃下反应 5 min 后，加 3 mL 10%三氯乙
酸终止反应，吸取 2.0 mL 反应物与 0.5 mL 2, 4-二
硝基苯肼充分反应后，加入 5 mL 0.5 mol/L NaOH
摇匀显色，520 nm 波长测定 A 值。
2.7 统计学处理
应用 SPSS 16.0 软件进行统计学分析，计量资
料采用 ±x s 表示，组间比较采用 t 检验。
3 结果与分析
3.1 蒜氨酸酶基因 RT-PCR 结果
根据 GenBank 登录序列，RT-PCR 产物大小预
期为 1 495 bp，图 1 所示约在 1 500 bp 可见一条明
显、特异性条带，与预期大小基本一致。克隆到
pGEMP-T-easy 载体后测序。经测序分析发现本次克
隆序列比 Genbank 登录的大蒜鳞茎蒜氨酸酶核苷酸
序列多了 3 个碱基“GTA”，有 9 个位点发生了改变，
核甘酸同源性为 98.15%[5]。

1、2-蒜氨酸酶 PCR 结果 3-250 bp DNA 梯状标记
1, 2-PCR results of alliinase 3-250 bp DNA Ladder Marker
图 1 蒜氨酸酶 PCR 产物
Fig. 1 PCR product of alliinase
3.2 pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒的鉴定
pPIczαC 载体大小为 3 600 bp 左右，蒜氨酸
酶为 1 400 bp 左右，pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒
大小约为 5 000 bp，在 5 000 bp 左右出现一条明
亮特异性条带（图 2），经 XholI 和 EcoRI 双酶切
在 2 250 bp 和 3 000 bp 左右分别出现两条特异性
条带（图 3），大小与预期基本相符，经测序鉴定
后完全正确。
3.3 蒜氨酸酶在毕赤酵母中的表达
蒜氨酸酶基因大小为 1 495 bp，其编码的目的
蛋白相对分子质量约为 5.5×104，取蒜氨酸酶毕赤
酵母表达上清进行 SDS-PAGE 分析，在 4.5×104～
6.6×104 见到两条蛋白条带（图 4、5），而对照组
（pPIczαC 载体）表达组在相应位置未见明显条带；
表达产物上清离心浓缩后经 Western blotting 检测，

1～3- pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒PCR 结果 4-250 bp DNA 梯状标记
1—3-PCR of pPIczαC-alliinase recombinant plasmid
4-250 bp DNA Ladder Marker
图 2 pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒
Fig. 2 Recombinant plasmid of pPIczαC-alliinase

1、2-pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒 XholI/EcoRI 双酶切结果
3-250 bp DNA 梯状标记
1, 2-recombinant plasmid of pPIczαC-alliinase digested
by XholI/EcoRI 3-250 bp DNA Ladder Marker
图 3 pPIczαC-蒜氨酸酶重组质粒 XholI/EcoRI 双酶切
Fig. 3 Recombinant plasmid of pPIczαC-alliinase digested
by XholI/EcoRI

1-pPIczαC-蒜氨酸酶表达 2-pPIczαC 空载体表达 3-Marker
1-expression of pPIczαC-alliinase 2-expression of pPIczαC empty
vector 3-Marker
图 4 重组蒜氨酸酶表达
Fig. 4 Expression of recombinant alliinase
在 5.5×104左右出现一条特异性条带，见图 6。
3.4 溶液提取的天然蒜氨酸酶
硫酸铵沉淀后酶液中蒜氨酸酶量较多，但同时
含有大量的杂蛋白，透析后酶液在 4.5×104～6.6×
104 显示单一条带，其他部位基本无条带，说明酶液
中蒜氨酸酶的纯度有所提高，大小与预期蛋白基本

1 2 3
1.16×105
6.60×104
4.50×104
3.50×104

2.50×104

1.84×104
1.44×104
4 500 bp
3 000 bp
2 250 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
1 2 3

1 2 3 4
4 500 bp
3 000 bp
2 250 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp

500 bp


250 bp
1 2 3

4 500 bp
3 000 bp
2 250 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp

250 bp
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一致，见图 7。
3.5 重组蒜氨酸酶和溶液提取大蒜蒜氨酸酶活性比较
当酶的体积相同时，重组蒜氨酸酶酶活性为
（103.93±4.92）U，比活力为（82.09±3.89）U/mg，
明显低于天然蒜氨酸酶酶活性（185.66±5.32）U 和
比活力（176.49±5.06）U/mg。

1-Marker 2～7-重组蒜氨酸酶 2～7 d 内的表达
1-Marker 2—7-expression of recombinant alliinase in 2—7 d
图 5 重组蒜氨酸酶不同时间表达
Fig. 5 Expression of recombinant alliinase in different time

1～3-重组蒜氨酸酶
1—3-recombinant alliinase
图 6 重组蒜氨酸酶 Western-blotting 分析
Fig. 6 Western-blotting analysis of recombinant alliinase

1-硫酸铵沉淀的蒜氨酸酶 2, 3-透析后的蒜氨酸酶 4-Marker
1-alliinase deposited by ammonium sulfate 2, 3-alliinase by dialysis 4-Marker
图 7 溶液提取天然蒜氨酸酶产物
Fig. 7 Product of natural alliinase extracted by solution
4 讨论
本研究根据 Genbank 登录的蒜氨酸酶序列，在
其 ORF 框上下游分别设计引物，利用分子生物学技
术克隆出浙江白蒜蒜氨酸酶基因。经生物学软件分
析表明，从浙江白蒜内克隆的蒜氨酸酶基因序列与
Genbank 登录序列相比 9 个碱基发生了突变，由于
克隆所用 HS Prime Star DNA 聚合酶为高保真酶，9
个碱基的突变排除实验操作引起，分析可能与大蒜
品种不同导致的基因多态性有关。
曾有报道证实克隆得到大蒜蒜氨酸酶的基因，
有的在原核细胞或真核细胞系统中进行了重组表
达[1, 6-9]。但由于大蒜品种、表达载体和表达系统的
不同，所报道的基因序列、蛋白相对分子质量及生
化性质有诸多分歧。本研究选择新一代的毕赤酵母
分泌表达载体 pPICZαC，该载体具有强效可调控启
动子 AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）、Zeocin
抗性筛选标记基因和信号肽 α-交配因子，有利于重
组质粒的筛选和分泌表达，同时该载体的 3’端含有
6 个 His 序列，便于目的蛋白的鉴定和分离纯化。
本研究首次在毕赤酵母 X-33 中表达重组蒜氨酸酶，
但是目的蛋白表达量不高，分析可能表达条件还需
要优化，特别是诱导剂甲醇量和诱导表达时间及外
源基因特性等方面还需要进一步摸索和优化。
巴斯特毕赤酵母表达系统是目前研究最多、应
用最广泛的真核表达系统之一，它可以对表达蛋白
进行糖基化、蛋白磷酸化、信号序列加工等一系列
的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性，
克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白
质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、
表达产量低等缺陷[10]。而且该酵母菌营养要求低、
生长快、表达量高，便于工业化生产；表达的外源
蛋白可分泌到胞外，分离纯化简便，所分泌的糖蛋
白的免疫原性较低，更利于临床应用[11]。采用丙酮
酸标准曲线法对重组蒜氨酸酶和天然蒜氨酸酶进行
酶活性分析发现，重组蒜氨酸酶具有酶活性，比活
力为（82.09±3.89）U/mg，低于天然蒜氨酸酶比活
力（176.49±5.06）U/mg，分析可能有两种原因：
（1）外源表达的重组蒜氨酸酶活性较天然蒜酶活性
低；（2）重组蒜氨酸酶没有经过纯化，杂蛋白相对
较高，影响比活力。
今后的研究工作主要是提高重组蒜氨酸酶的表
达量和酶活性。通过优化表达体系，提高酶的表达
量；通过建立重组蒜氨酸酶纯化平台，探索纯化条
件，提高纯化效果和重组蛋白纯度，并通过生物信
息学寻找重组蒜氨酸酶活性中心，并尝试利用定点
突变等技术对蒜氨酸酶活性中心进行修饰改造，进
一步提高重组蛋白活性，为工业化生产重组蒜氨酸
酶奠定实验基础。进一步以此为平台将重组蒜氨酸
酶和蒜氨酸进行配伍组成“蒜氨酸酶-蒜氨酸复合制
剂”，筛选出“蒜氨酸酶-蒜氨酸复合制剂”的最佳
配伍比例，改进大蒜素的给药方式，以现代生物技

1 2 3 4
1.16×105
6.60×104

4.50×104

3.50×104


2.50×104

1.84×104
1.44×104
1.16×105
6.60×104
4.50×104
3.50×104

2.50×104

1.84×104
1.44×104

1 2 3

1 3
5.5×104
1 2 3 4 5 6 7
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术促进蒜类产品的现代化，更有效地发挥蒜类产品
的药理学活性。
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