全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月

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中心组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的处方
谭静净，程 岚，李学涛*
辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600
摘 要：目的 采用中心组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的最佳处方。方法 以主动载药-pH 梯度
法制备亲水基修饰阳离子脂质体，以包封率、Zeta 电位为指标，考察长春碱与二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）质量比、DPPC
与 3β-[N-(N′, N′-二甲基胺乙基)胺基甲酰胺基] 胆固醇（DC-Chol）物质的量之比、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇
（DSPE-PEG 2000）的质量分数 3 个因素对考察指标的影响，并对各个因素进行二项式拟合，通过响应面分析选取最佳处方。
结果 优化出的长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的处方为长春碱与 DPPC 质量比为 0.06、DPPC 与 DC-Chol 物质的量之比为
1.00、DSPE-PEG 2000 的质量分数为 7%。结论 中心组合设计-效应面法应用简便、预测性好，制备的长春碱亲水基修饰阳
离子脂质体符合设计要求。
关键词：中心组合设计；效应面法；长春碱；阳离子脂质体；主动载药-pH 梯度法
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)09 - 1742 - 04
Prescription optimization of vinblastine hydrophilic group-modified cationic
liposomes by central composite design-response surface method
TAN Jing-jing, CHENG Lan, LI Xue-tao
School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China
Abstract: Objective To optimize the prescription of vinblastine (VLB) hydrophilic group-modified cationic liposomes by using
central composite design-response surface method. Methods The hydrophilic group-modified cationic liposomes were prepared by
active loading-pH gradient method. Taking encapsulation efficiency (EE) and Zeta potential as indexes, the effects of weight ratio of
VLB/DPPC, the mole ratio of DPPC/DC-Chol, and the concentration of DSPE-PEG 2000 on them were investigated. Binomial fitting
of each factor was observed and response surface analysis was used to select the optimal prescription. Results The weight ratio of
VLB/DPPC in optimized prescription of VLB hydrophilic group-modified cationic liposomes was 0.06, the mole ratio of
DPPC/DC-Chol was 1.00, and the concentration of DSPE-PEG 2000 was 7%. Conclusion Central composite design-response
surface method is convenient to use with good predictability. The prepared VLB hydrophilic group-modified cationic liposomes reach
the design requirements.
Key words: central composite design; response surface method; vinblastine; cationic liposomes; active loading-pH gradient method

长春碱（vinblastine）是一种双吲哚型生物碱，
存在于夹竹桃科植物长春花 Catharathus roseus (L.)
G. Don 中。长春碱能干扰增殖细胞纺锤体的形成，
使有丝分裂停止于中期；并有免疫抑制作用；对何
杰金氏病、绒毛膜上皮癌疗效较好，对急性白血病、
乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌、口咽部癌、
单核细胞白血病均有一定疗效[1]。但同其他细胞毒
药物一样，长春碱缺乏对肿瘤组织的选择性，严重
限制了其在临床中对肿瘤的治疗应用[2]。亲水基修
饰的脂质体可以提高药物在血液中保留时间，增加
药物的被动靶向功能，并且可以降低毒性，提高疗
效[3]。阳离子脂质体可以与带负电荷的药物结合，提
高药物包封率，是带负电荷药物的一种转运工具[4-5]。
与药物结合之后，其表面仍有富余的正电荷，能被
表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过细胞内吞或膜
融合方式将药物导入细胞而发挥作用[6]。故本实验将
长春碱制备成亲水基修饰的阳离子脂质体，以解决
其在临床应用中面临的问题。

收稿日期：2012-03-06
基金项目：国家自然科学基金资助项目（1110172）
作者简介：谭静净（1985—），女，硕士研究生，研究方向为中药新剂型与新技术。Tel: 15542591812 E-mail: jingjingchd@126.com
*通讯作者 李学涛 E-mail: lixuetao1979@yahoo.cn
网络出版时间：2012-08-16 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120816.1041.004.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月

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在工艺优化和处方筛选过程中，常需同时考察
多个因素对结果的影响，并对结果进行优化。中心
组合设计-效应面法是国外常用的集数学和统计学
方法于一体的试验设计方法，比较成熟且特点鲜明，
建立的效应与因素之间的数学关系式，通过统计学
检验确保模型的可信度较高。所以本实验采用中心
组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子
脂质体的处方。
1 仪器与材料
Horiba LB—550 动态光散射粒度分布分析仪
（1～6 000 nm，日本 Horiba 公司），Zeta 电位分析
仪（SZP—06，德国 BTG），安捷伦 LC—1100 液相
色谱仪（G21771AA—UV 检测器，安捷伦色谱工作
站），KQ3200 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限
公司），AY220 电子分析天平（日本岛津公司），
DF2101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（河南巩义市
予华仪器厂），RE—52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生
化仪器厂）。
长春碱（批号 GPC-JNHG20110921，质量分数
98.2%，武汉金诺化工有限公司）；3β-[N-(N′, N′-二
甲基胺乙基)胺基甲酰胺基] 胆固醇（DC-Chol，相
对分子质量 495.18，Avanti Polar Lipids，Inc.）；二
棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，相对分子质量 734.04，
日本精化株式会社 NFC），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-
聚乙二醇（DSPE-PEG 2000，相对分子质量 280.5，
日本精化株式会社 NFC）；Sephadex G-50（上海华
蓝化学科技有限公司），Triton X-100（北京赛百盛
生物工程公司），甲醇、乙腈（色谱纯），其他试剂
均为分析纯，实验用水为三蒸水。
2 方法与结果
2.1 长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的制备
按处方比例，精密称取 DC-Chol、DPPC、DSPE-
PEG 2000，加氯仿 10 mL 溶解，于旋转薄膜蒸发器
上除去氯仿，制备磷脂膜。加入柠檬酸缓冲液（pH
3.0）水化磷脂膜，振摇，搅拌，超声处理，制备空
白脂质体。将所得空白脂质体依次通过0.45、0.22 μm
微孔滤膜，加入 0.2 mol/L 长春碱溶液，并用 l mol/L
Na2HPO4 溶液将 pH 值调至 7.5，于 55 ℃水浴保温
10 min，冷却至室温，即得长春碱亲水基修饰阳离
子脂质体[7]。
2.2 脂质体包封率的测定
2.2.1 色谱条件[8] 色谱柱为迪马公司 C18 柱（200
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为二乙胺溶液（取二
乙胺 14 mL，加水 986 mL，混匀，用磷酸调 pH 值
7.5）-乙腈 200 mL 与甲醇 800 mL 的混合液（32∶
68），柱温 30 ℃，检测波长 264 nm，体积流量 1.0
mL/min，进样量 10 μL，理论塔板数按长春碱峰计
算不低于 3 000。
2.2.2 线性关系考察 精密称取长春碱 20.0 mg，置
50 mL 量瓶中加甲醇 40 mL 超声 10 min，甲醇定容
至 50 mL，得质量浓度为 0.400 mg/mL 长春碱储备
液。精密量取上述储备液用甲醇稀释成质量浓度分
别为 0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400 mg/mL
的系列溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进行操作，
测定色谱峰峰面积。以进样量为横坐标（X），色谱
峰峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方
程 Y＝5 188.9 X－30.775，r＝0.999 6，表明长春碱在
0.025～0.400 mg/mL 线性关系良好。
2.2.3 药物总量的测定 精密量取脂质体样品 0.1
mL 于 5 mL 量瓶中，加入 0.2 mL 20% Triton X-100
乙醇溶液，超声使其溶解，流动相定容至刻度，0.45
μm 微孔滤膜滤过，取续滤液 10 μL，注入高效液相
色谱仪，测定，计算长春碱总量。
2.2.4 游离药物量的测定和包封率的计算 精密量
取长春碱脂质体 0.5 mL，加至 Sephadex G-50 凝胶
柱（12 cm×1.0 cm）上方，以水进行洗脱，体积流
量为 1.0 mL/min，收集游离药物部分，混合，蒸干，
残渣用流动相溶解，滤过，滤液定容至 5 mL，0.45
μm 微孔滤膜滤过，取滤液 10 μL，注入高效液相色
谱仪，测定，计算游离长春碱的量，并计算脂质体
的包封率。
包封率＝1－游离长春碱的量/长春碱总量
2.3 脂质体 Zeta 电位及粒径分布的测定
取长春碱亲水基修饰阳离子脂质体混悬液以水
为分散介质稀释至适宜质量浓度，采用 Zeta 电位分
析仪和动态光散射粒度分布分析仪测定脂质体的
Zeta 电位和粒径分布。
2.4 试验设计[9-10]
在预试验的基础上，选择对长春碱亲水基修饰
阳离子脂质体的制备影响较显著的 3 个因素作为考
察对象，即长春碱与 DPPC 质量比（X1）、DPPC 与
DC-Chol 物质的量之比（X2）、DSPE-PEG 2000 的
质量分数（X3），并确定其范围：X1 0.01～0.09，X2
0.5～1.5，X3 2%～12%。采用 3 因素中心组合设计，
以脂质体包封率（Y1）和 Zeta 电位（Y2）为指标进
行考察，试验设计及结果见表 1。
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表 1 中心组合试验设计与结果
Table 1 Central composite test design and results
试验号 X1 X2 X3 Y1 / % Y2 / mV
1 0.03 (−1) 0.71 (−1) 4% (−1) 75.6 44.56
2 0.07 (1) 0.71 (−1) 4% (−1) 82.9 58.64
3 0.03 (−1) 1.29 (1) 4% (−1) 71.6 40.92
4 0.07 (1) 1.29 (1) 4% (−1) 78.8 55.38
5 0.03 (−1) 0.71 (−1) 10% (1) 70.1 26.09
6 0.07 (1) 0.71 (−1) 10% (1) 77.7 45.94
7 0.03 (−1) 1.29 (1) 10% (1) 68.6 18.63
8 0.07 (1) 1.29 (1) 10% (1) 75.4 50.52
9 0.01 (−1.732) 1.00 (0) 7% (0) 72.1 14.97
10 0.09 (1.732) 1.00 (0) 7% (0) 78.5 64.24
11 0.05 (0) 0.50 (−1.732) 7% (0) 89.2 22.92
12 0.05 (0) 1.50 (1.732) 2% (0) 81.0 38.48
13 0.05 (0) 1.00 (0) 2% (−1.732) 77.9 64.52
14 0.05 (0) 1.00 (0) 12% (1.732) 63.9 30.28
15 0.05 (0) 1.00 (0) 7% (0) 85.5 35.45
16 0.05 (0) 1.00 (0) 7% (0) 85.4 35.44
17 0.05 (0) 1.00 (0) 7% (0) 85.6 35.43
18 0.05 (0) 1.00 (0) 7% (0) 85.3 35.46
19 0.05 (0) 1.00 (0) 7% (0) 85.5 35.45
20 0.05 (0) 1.00 (0) 7% (0) 85.7 35.45

2.5 数据处理
采用 Statistica 6.0（StatSoft，Inc.）统计软件以
Y1、Y2 为因变量，分别对各因素进行二次多项式拟
合，得拟合方程。
Y1＝40.56＋861.42 X1－7 102.52 X12－5.90 X2＋4.78 X22＋
803.17 X3－5 911.74 X32－19.40 X1X2－20.83 X1X3－88.87
X2X3（r＝0.941 1，P＜0.01）
Y2＝70.87－456.10 X1＋4 089.09 X12＋55.03 X2－45.34
X22－1 514.27 X3＋5 385.18 X32＋267.67 X1X2＋4 833.33
X1X3＋254.47 X2X3（r＝0.962 4，P＜0.01）
将各因素对脂质体的 Y1和 Y2进行相关性分析，
相关系数（r）见表 2。
由于效应面法得出的是三维图谱，故固定对实
验结果影响较小的一个影响因素。由各项 r 可知，
X2 对 Y1 和 Y2影响最小，因此，确定 X2 用量为中心
点值，将 X2＝1.00 带入上述二次多项式回归方程得
下列简化方程。
Y1＝39.44＋842.02 X1－7 102.52 X12＋714.3 X3－5 911.74
X32－20.83 X1X3
Y2＝80.56－188.43 X1＋4 089.09 X12－1 259.83 X3＋
表 2 各项的相关系数
Table 2 Correlation coefficients of each vector
r r 因素
Y1 Y2
因素
Y1 Y2
X1 0.34 0.73 X32 −0.49 −0.41
X12 0.24 0.73 X1X2 0.15 0.65
X2 −0.23 0.07 X1X3 −0.03 0.18
X22 −0.22 0.06 X2X3 −0.45 −0.36
X3 −0.36 −0.46

5 385.18 X32＋4 833.33 X1X3
根据上述方程，绘制 X1与 X3 对 Y1和 Y2 影响的
效应面图，见图 1。
结合上述数学模型和效应面图，确定 X1 优化范
围为 0.01～0.09，X3 优化范围为 2%～12%，寻求此
取值范围内最佳值。X1＝0.06，X3＝7%为 1 组最佳
值，代入方程得 Y1＝85.49%，Y2＝42.47 mV。
结合上述实验处方筛选结果和本课题组前期研
究经验确定长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的制备
方法：精密称取 DC-Chol 0.250 g（0.505 mmol）、
DPPC 0.370 g（0.504 mmol）、DSPE-PEG 2000 0.010 g
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图 1 X1与 X3 对 Y1 (A) 和 Y2 (B) 影响的效应面图
Fig. 1 Response surface of X1 and X3 on Y1 (A) and Y2 (B)

（0.036 mmol）加氯仿 10 mL 溶解，于旋转薄膜蒸发
器上除去氯仿，制备磷脂膜；加入柠檬酸缓冲液（pH
3.0）水化磷脂膜，振摇，搅拌，超声处理，制备空
白脂质体。将所得脂质体依次通过 0.45、0.22 μm
微孔滤膜，加入 0.2 mol/L 长春碱溶液 4.44 mL，并
用 l mol/L Na2HPO4 将 pH 值调至 7.5，于 55 ℃水浴
保温 10 min，冷却至室温，即得。
2.6 优化处方的验证试验
根据上述优化处方得到的结果制备 3 批长春碱
亲水基修饰阳离子脂质体，按“2.2”、“2.3”项下方
法测其包封率、Zeta 电位及粒径分布，结果包封率
分别为 87.43%、85.44%、86.09%，Zeta 电位分别
为 43.29、43.02、42.28 mV，平均粒径分别为 133、
128、130 nm。
3 讨论
阳离子脂质体与其他脂质体最大的不同就在于
表面带正电荷，Zeta 电位是表征粒子表面电荷情况
的一个重要指标，且 Zeta 电位的大小对脂质体混悬
液的稳定性也有影响，故 Zeta 电位的测定是阳离子
脂质体的一个重要指标。荷电的脂质体能够减少相
互间的聚集和融合，增加稳定性。Zeta 电位绝对值
大于 60 mV 时，荷电粒子相当稳定；Zeta 电位绝对
值在 30～60 mV 时，荷电粒子比较稳定；在 Zeta
电位绝对值小于 30 mV 时，荷电粒子不稳定，容易
聚集[11]。本实验制备的脂质体的 Zeta 电位在 43 mV
左右，因此比较稳定。
本实验处方中加入了少量的 DSPE-PEG 2000，
该亲水基团的引入不但能够使脂质体逃避网状内皮
系统的捕获，增加脂质体的血液循环时间，同时还
能提高脂质体的被动靶向性。亲水基修饰脂质体表
面由于 PEG 2000 层的引入，其体内外稳定性将发
生很大改变[12]。由于 PEG 化的磷脂的空间位阻的原
因，长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的 Zeta 电位会
降低，从而影响脂质体的整体稳定性，故处方中对
DSPE-PEG 2000 的加入量需要严格控制。
脂质体的制备技术包括被动载药技术和主动载
药技术。被动载药技术通常只适用于和脂类物质（尤
其是磷脂）有强烈相互作用的脂溶性或亲脂性药物，
否则药物的包封率和载药量不能满足临床要求；主
动载药法适用于药物具有合适的油水分配系数，为
弱酸或弱碱，能与脂质体的内相缓冲液形成稳定的
复合物或沉淀物。所以本实验采用主动载药-pH 梯
度法制备长春碱亲水基修饰阳离子脂质体。
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0 0
Y 1
/
%

6.0
12.0
5.0
10.0 10.0
5.06.0
12.0
100 100
50
0
Y 2
/
m
V

60
20
A B
X1 / % X1 / %X3 / % X3 / %